Diagnosi rapida dell'infezione da Mycobacterium tuberculosis e della resistenza ai farmaci basata sulla PCR a fluorescenza in tempo reale

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per rilevare il Mycobacterium tuberculosis e la sua resistenza ai farmaci utilizzando la tecnologia PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (qPCR).

Abstract

La tubercolosi (TBC) è un grave problema sanitario che colpisce in modo sproporzionato le popolazioni vulnerabili. L'insorgenza e la diffusione della tubercolosi resistente ai farmaci rappresentano una seria minaccia per la salute pubblica globale. I metodi diagnostici tradizionali per il Mycobacterium tuberculosis (MTB), come la microscopia a striscio e la coltura, hanno limitazioni significative e spesso comportano un ritardo nel trattamento clinico. Per affrontare questa sfida, è stato sviluppato uno schema diagnostico efficiente basato sulla PCR fluorescente in tempo reale. Gli acidi nucleici MTB di alta qualità possono essere estratti da campioni di prova e lo stato di resistenza può essere identificato nei siti di resistenza chiave. Rispetto ai metodi tradizionali, questo approccio riduce significativamente il tempo di rilevamento a poche ore, consentendo di determinare lo stato di infezione e resistenza poco dopo la visita iniziale di un paziente. La sensibilità di rilevamento supera l'85% e la specificità raggiunge il 95%. Questa tecnologia non invasiva non solo riduce al minimo il disagio del paziente, ma supporta anche una diagnosi accurata nelle istituzioni mediche di base grazie al suo basso costo e all'elevata efficienza. Nel complesso, l'approccio rappresenta un miglioramento significativo nella diagnostica della TBC.

Introduzione

La tubercolosi (TBC), una malattia infettiva cronica causata dal Mycobacterium tuberculosis (MTB), è tra le prime dieci cause di morte a livello^globale1. La tubercolosi resistente ai farmaci (DR-TB) rappresenta una sfida significativa per gli sforzi di controllo della tubercolosi. Il Piano d'azione per la costruzione di comunità libere dalla tubercolosi (2022-2027), pubblicato dal Centro cinese per il controllo e la prevenzione delle malattie (China CDC), sottolinea la necessità di uno screening precoce della resistenza ai farmaci in tutti i pazienti con tubercolosi polmonare batteriologicamente confermata². Sostiene l'adozione di nuove tecnologie diagnostiche molecolari per migliorare le capacità di rilevamento della DR-TB, abbreviare i tempi diagnostici, massimizzare l'identificazione dei casi di DR-TB, garantire un trattamento e una gestione standardizzati e implementare le necessarie misure di controllo delle infezioni³. Inoltre, l'Avviso sul rafforzamento della prevenzione e del controllo della DR-TB (n. 4, 2023) impone la promozione a livello nazionale di tecniche diagnostiche avanzate. Esorta uno screening tempestivo della resistenza per tutti i pazienti con TBC batteriologicamente confermata per ottenere uno screening universale, migliorare la standardizzazione diagnostica e migliorare l'accessibilità all'assistenza sanitaria⁴.

DR-TB si riferisce ai casi di TB resistenti ad almeno un farmaco anti-TB. Le classificazioni attuali includono TB resistente alla rifampicina (RR), monoresistente, poliresistente, multiresistente ai farmaci (MDR), pre-estensivamente resistente ai farmaci (pre-XDR) ed estensivamente resistente ai farmaci (XDR). Una meta-analisi globale dell'epidemiologia della DR-TB rivela tassi di resistenza allarmanti: MDR-TB all'11,6%, resistenza all'isoniazide al 15,7%, resistenza alla rifampicina al 9,4% e monoresistenza all'11,8%. Questi dati sottolineano la gravità e la complessità di DR-TB⁵.

La rifampicina e l'isoniazide sono farmaci fondamentali per il trattamento della tubercolosi. Tuttavia, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) osserva che, sebbene siano disponibili tecnologie diagnostiche rapide per la resistenza alla rifampicina, mancano strumenti analoghi per la resistenza all'isoniazide. Questa lacuna impedisce la diagnosi tempestiva della tubercolosi multiresistente ai farmaci (MDR-TB). La definizione provvisoria di "TB resistente alla rifampicina" riflette questa limitazione diagnostica, evidenziando l'insufficiente capacità di rilevare rapidamente la resistenza ad altri farmaci ^6,7. L'OMS stima che i casi di tubercolosi resistente all'isoniazide siano due volte più diffusi dei casi resistenti alla rifampicina. L'affidamento esclusivo sui rischi dello screening della resistenza alla rifampicina trascura la tubercolosi monoresistente all'isoniazide (Hr-TB)⁸. I pazienti con Hr-TB non rilevati trattati con regimi standard corrono rischi elevati di fallimento del trattamento, recidiva e progressione verso MDR-TB⁹. Anche la resistenza all'etambutolo è preoccupante. Essendo un farmaco critico per il trattamento della TB e della MDR-TB, l'indagine di base cinese del 2017 sulla DR-TB ha riportato tassi di resistenza all'etambutolo del 4,9% nei nuovi casi e del 17,2% nei casi di ritrattamento¹⁰.

Attualmente, per il rilevamento della resistenza ai farmaci della tubercolosi residua, la coltura artificiale è ancora il metodo preferito in alcuni laboratori, ma la tecnologia PCR fluorescente in tempo reale è superiore ai metodi convenzionali nel rilevare la resistenza ai farmaci della tubercolosi: Rilevamento e quantificazione: la PCR fluorescente in tempo reale fornisce un'analisi quantitativa accurata attraverso il monitoraggio in tempo reale dei segnali fluorescenti, mentre i metodi convenzionali mancano di questa accuratezza. I metodi di sperimentazione tradizionali richiedono molto tempo e manodopera, richiedono personale addestrato e sono altamente soggettivi. Al contrario, la PCR in tempo reale acquisisce sonde e segnali fluorescenti tramite computer, riducendo al minimo gli errori umani. I metodi convenzionali di analisi dei dati sono più soggettivi, mentre la PCR in tempo reale consente di ottenere un'analisi accurata e obiettiva attraverso curve di amplificazione, curve standard e altri metodi di analisi. Questi progressi rendono la PCR fluorescente in tempo reale il metodo preferito per rilevare la resistenza ai farmaci della tubercolosi¹¹.

In sintesi, la tubercolosi resistente ai farmaci (DR-TB) è emersa come una crisi globale. La resistenza ai farmaci chiave – isoniazide, rifampicina ed etambutolo – complica ulteriormente gli sforzi di controllo della tubercolosi. Il rilevamento tempestivo e accurato della resistenza ai farmaci è fondamentale per guidare regimi di trattamento su misura, migliorare il successo terapeutico e mitigare la minaccia della DR-TB.

Per affrontare la sfida diagnostica, questo studio ha utilizzato un kit in grado di identificare il Mycobacterium tuberculosis e rilevare mutazioni resistenti ai farmaci entro 3,5 ore utilizzando campioni di espettorato. Ciò è stato ottenuto con il supporto della qPCR a fluorescenza in tempo reale. Il metodo è semplice, economico e accurato, il che lo rende uno strumento prezioso nella lotta contro la DR-TB.

Protocollo

Questa ricerca è stata approvata dal Comitato Etico dell'Ospedale della Quinta Divisione del Corpo di Produzione e Costruzione dello Xinjiang; Il numero etico è LLWYH2025001 e non c'è conflitto etico. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta dei campioni

1. Utilizzare flaconi di espettorato con tappo a vite standardizzati a livello internazionale raccomandati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), o scatole di plastica sigillate e scatole di carta oleata, per raccogliere campioni di espettorato.
2. Etichettare i contenitori dell'espettorato con il nome del paziente, il numero (il numero di sequenza ambulatoriale per i nuovi pazienti o il numero di registrazione per i pazienti di follow-up), gli elementi dell'esame e i numeri di sequenza dei contenitori 1, 2, 3 (1 = espettorato immediato lo stesso giorno, 2 = espettorato notturno, 3 = espettorato mattutino il giorno successivo). Per i pazienti senza espettorato, raccogliere campioni attraverso la raccolta dell'espettorato indotta da aerosol.
   NOTA: Il personale deve valutare la qualità dei campioni di espettorato raccolti. Il volume del campione deve essere generalmente mantenuto a 3-5 mL. I campioni qualificati includono espettorato secco, espettorato marrone macchiato di sangue, espettorato contenente una piccola quantità di sangue fresco o espettorato mucoso. I campioni non qualificati, come la saliva, devono essere ripresentati per il test dopo ulteriori indicazioni.

2. Pre-elaborazione dell'espettorato

1. Aggiungere 1-2 volte il volume della soluzione di NaOH al 4% nel contenitore dell'espettorato in base al volume dell'espettorato raccolto. Agitare e mescolare il contenuto per 2 minuti.
2. Porre il contenitore in una cabina di biosicurezza a temperatura ambiente per 15 minuti, agitandolo più volte durante questo periodo per garantire la completa liquefazione dell'espettorato.
   NOTA: Maneggiare NaOH con cura a causa della sua natura corrosiva. Se l'espettorato non è completamente liquefatto, aumentare il tempo di agitazione. Questo passaggio è particolarmente importante durante l'esperimento.

3. Preparazione del reagente (area pre-PCR)

1. Preparazione dei reagenti: Preparare i reagenti nell'area pre-PCR designata. Scongelare i reagenti congelati a temperatura ambiente. Vortice per 5-10 s. Centrifugare a 3000 × g per 5-10 s a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo reagente è un sistema doppio (A/B) e deve essere preparato separatamente.
2. Preparazione della miscela master PCR
   1. Miscela A: in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, combinare (n + 3) × 19,6 μl di RIF PCR Mix A e (n + 3) × 0,4 μl di enzima TB. Vortice per 5-10 s. Centrifugare a 3000 × g per 5-10 s a temperatura ambiente (PCR Mix A: 60 μL).
   2. Miscela B: in un'altra provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, combinare (n + 3) × 19,6 μl di RIF PCR Mix B e (n + 3) × 0,4 μl di enzima TB. Vortice e centrifugare come sopra (PCR Mix B: 60 μL).
3. Conservazione e utilizzo: Conservare le miscele master preparate a ≤-18 °C. Se non utilizzato immediatamente, consumare entro 4 ore.
   NOTA: Lo stesso protocollo si applica ai reagenti EMB e INH.
4. Aliquotazione della miscela master PCR: erogare 20 μl di PCR Mix A e Mix B in provette di reazione PCR a parete sottile separate. Trasferire le provette aliquotate in sacchetti sigillati nell'area di estrazione.

4. Estrazione dell'acido nucleico e caricamento del campione (area di estrazione)

1. Centrifugare 1,2 mL di espettorato completamente liquefatto a 15.058 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e conservare il pellet. Opzionale: centrifugare l'intero campione digerito se l'attrezzatura lo consente.
2. Risospendere il pellet in 1,2 mL di soluzione fisiologica, vortex e centrifugare a 15.058 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa fase di lavaggio tre volte.
3. Aggiungere 250 μl di tampone di estrazione TB al pellet. Vorticare ed eseguire la lisi termica a 99 °C per 10 min. Raffreddare a temperatura ambiente. Centrifugare a 15.058 × g per 1 minuto a temperatura ambiente e raccogliere il surnatante (campione estratto).
   NOTA: Per i campioni viscosi, aumentare il volume del tampone di liquefazione o prolungare il tempo di vortex. Se i campioni sono destinati esclusivamente all'estrazione del DNA, prolungare il tempo di liquefazione per garantire una digestione completa.
4. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 5 μl di campione estratto o controlli negativi/positivi a ciascuna provetta di reazione a parete sottile della PCR. Sigillare immediatamente le provette ed etichettarle in modo appropriato.
5. Provette per PCR caricate a vortice per 5-10 s e centrifugare brevemente (5-10 s). Trasferire le provette nell'area di amplificazione PCR.

5. Amplificazione PCR (area di amplificazione)

NOTA: I programmi per il rilevamento della resistenza alla rifampicina, all'etambutolo e all'isoniazide sono stati impostati su un termociclatore Hongshi (Tabella 1, Tabella 2 e Tabella 3). Le condizioni ciclistiche sono incluse.

1. Posizionare le provette di reazione a parete sottile PCR caricate nel termociclatore per l'amplificazione.
2. Accedi all'interfaccia del ciclatore. Fare clic su Creazione guidata esperimento e selezionare il tipo di esperimento come Curva di fusione standard (come mostrato nella Figura 1).
3. Fare clic su Plate Editor, selezionare orizzontalmente due pozzetti vuoti adiacenti e assegnare il modello di farmaco corrispondente dal pannello di destra per definire un campione (come mostrato nella Figura 2).
4. Configura i controlli negativi/positivi e le informazioni sui campioni. Fare clic su Avvia per avviare il programma. L'autonomia è di 2 ore e 22 minuti.
5. Al termine, trasferire le provette di reazione a parete sottile della PCR (sigillate) in un sacchetto sigillato. Fissare la chiusura e maneggiarla come rifiuto a rischio biologico.
6. Fare clic su Analizza sul termociclatore per elaborare i dati.
   NOTA: I limiti di rilevamento di questo metodo sono i seguenti: Gruppo composito: 10 batteri/mL; Rifampicina: 20.000 batteri/mL; Isoniazide: 10.000 batteri/mL; Etambutolo: 10.000 batteri/mL. (I dati del limite di rilevabilità (LoD) derivano dall'analisi statistica di 765 casi clinici fornita nel manuale di istruzioni del reagente.)

6. Interpretazione dei risultati

1. Determinare le mutazioni confrontando le differenze di temperatura di fusione (Tm) tra i campioni di prova e i controlli positivi.
   NOTA: Wild-type (sensibile ai farmaci): i valori Tm del campione corrispondono al controllo positivo in tutti e quattro i canali (deviazione ≤1 °C). Mutante (resistente ai farmaci): il valore di Tm in qualsiasi canale è inferiore di ≥2 °C rispetto al controllo positivo (ΔTm ≥2 °C).

Risultati

Questo studio ha utilizzato la PCR a fluorescenza in tempo reale e l'analisi della curva di fusione per testare campioni di espettorato da 17 pazienti affetti da tubercolosi. Inoltre, 30 pazienti sono stati sottoposti a test di resistenza alla rifampicina e 20 sono stati testati per la resistenza all'isoniazide e all'etambutolo. Il metodo PCR a fluorescenza in tempo reale ha dimostrato un tasso di rilevamento positivo dell'88,2% per il complesso Mycobacteriu...

Discussione

L'emergere su scala globale di ceppi di Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) resistenti ai farmaci ha complicato in modo significativo il trattamento dei pazienti affetti da tubercolosi (TBC). In particolare, la tubercolosi multiresistente (MDR) ed estensivamente resistente ai farmaci (XDR) pone sfide formidabili al controllo della tubercolosi¹². L'individuazione rapida della resistenza ai farmaci è fondamentale per progettare regimi di trattamento a...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tampone di lisi della centrifuga
	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.		Kit di rilevamento delle mutazioni di resistenza all'etambutolo 24110701
Mycobacterium tuberculosis	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit di rilevamento delle mutazioni di resistenza all'isoniazide Mycobacterium tuberculosis	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Rilevamento delle mutazioni di resistenza alla rifampicina Ki	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
SLAN-96P Sistema di PCR in tempo reale	Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.	SLAN-96P
	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
TopPette Pipettore

ad alta velocità240308012401110124031001Soluzione per la lavorazione dell'espettorato 24110701