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Articolo metodologico

Raccolta di liquidi per il lavaggio nasale muino senza contaminazione del sangue

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DOI:

10.3791/68451

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11 luglio 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo per evitare la contaminazione del sangue nel liquido di lavaggio nasale murino (NLF). Poiché questo metodo garantisce la raccolta dell'NLF senza contaminazione del sangue, consente rilevamenti più accurati dei componenti immunologici e di vari agenti patogeni respiratori.

Abstract

I campioni delle vie aeree superiori, tra cui il liquido di lavaggio nasale (NLF) e i tamponi nasali, sono utili per rilevare agenti patogeni, inclusi virus e batteri, che possono causare malattie respiratorie. La NLF è stata utilizzata per esaminare i componenti cellulari e umorali del sistema respiratorio, ad esempio per valutare l'induzione dell'immunoglobulina (Ig) A in seguito alle vaccinazioni della mucosa. Nei roditori sperimentali, i campioni di NLF possono essere raccolti per via trans-faringea o trans-tracheale. Sebbene sia stato riportato che la via transfaringea è più efficiente nella raccolta dei campioni di NLF rispetto alla via trans-tracheale, i campioni di NLF raccolti per via transfaringea erano spesso contaminati da sangue, influenzando i livelli di contenuto cellulare e umorale nei campioni originali di NLF. Pertanto, questo studio mirava a stabilire un nuovo metodo di raccolta NLF nei topi sperimentali per ridurre al minimo la contaminazione del sangue. In breve, prima che la mascella inferiore del topo fosse separata, venivano messi dei batuffoli di cotone in bocca per assorbire il sangue. Quando l'emorragia è stata fermata, i campioni NLF sono stati raccolti inserendo una micropipetta nella coana e lavandoli due volte con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (volume finale: 400 μL/topo). Per rilevare la contaminazione del sangue, è stato utilizzato un test forense del luminol semplice e sensibile che rileva l'emoglobina. Il test del luminol ha dimostrato che la contaminazione del sangue era rilevabile nei campioni NLF raccolti con il metodo convenzionale (senza batuffoli di cotone), ma non in quelli raccolti con il nuovo metodo (con batuffoli di cotone). A causa della contaminazione del sangue, le concentrazioni totali di IgA e IgG nei campioni NLF erano più elevate nel metodo convenzionale rispetto al nuovo metodo; è noto che il sangue contiene livelli molto più elevati di IgA e IgG rispetto all'NLF. Pertanto, questo metodo unico può essere utilizzato come metodo semplice e sensibile per raccogliere campioni di NLF da topi sperimentali per prevenire la contaminazione del sangue.

Introduzione

Sia nella ricerca clinica che in quella di base, i metodi di raccolta dei campioni appropriati sono fondamentali per valutare i risultati. La lavanda nasale è una tecnica di irrigazione utilizzata per analizzare le componenti cellulari e umorali delle vie respiratorie 1,2,3. Clinicamente, il liquido di lavaggio nasale (NLF) è stato utilizzato come campione non invasivo efficace per la scoperta di biomarcatori, con diversi studi a sostegno del suo uso in varie malattie respiratorie, tra cui sinusite, fibrosi cistica e disturbi respiratori generali 4,5,6,7. Negli animali da esperimento, l'NLF è stato utilizzato anche per studiare modelli di malattie respiratorie, tra cui l'influenza, la malattia da coronavirus-2019 (COVID-19) e la malattia allergica 3,8,9. Questo metodo è ampiamente utilizzato per determinare i principali biomarcatori infiammatori, come le cellule polimorfonucleate e le citochine, che vengono spesso esaminate come indicatori di risposte ad allergeni, asma e infezioni respiratorie 10,11,12. Più recentemente, per studiare l'efficacia e la sicurezza di potenziali candidati vaccini intranasali, i campioni di NLF sono stati spesso raccolti da animali da esperimento e i livelli di patogeno e immunoglobulina (Ig) nei campioni di NLF sono stati quantificati come indicatori13.

Nei topi sperimentali, l'NLF può essere raccolto utilizzando il metodo trans-faringeo o trans-tracheale. Nel metodo trans-faringeo, la testa murina, compresa la regione palatofaringea, è stata separata dalla laringe, quindi un catetere è stato inserito attraverso l'apertura faringea nella coana per iniettare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e raccogliere NLF dalla narice14. Il metodo trans-tracheale ha ottenuto l'accesso al tratto respiratorio attraverso la trachea senza recidere la testa e l'NLF è stato raccolto dalla narice, riducendo al minimo il rischio di contaminazione del sangue. Sebbene questi due metodi primari siano stati impiegati per la raccolta di NLF nei topi sperimentali, entrambi i metodi convenzionali hanno i loro limiti. È stato dimostrato che il metodo trans-tracheale produce quantità inferiori di NLF rispetto al metodo trans-faringeo a causa della fuoriuscita di liquido di lavaggio trans-tracheale nella cavità orale. Lo studio precedente ha dimostrato che, dopo l'iniezione di PBS, i volumi di fluido recuperati nella NLF erano rispettivamente del 70%-80% e del 90%-100% nei metodi trans-tracheale e trans-faringeo. Sebbene il metodo trans-faringeo possa essere considerato migliore con quantità maggiori di NLF rispetto al metodo trans-tracheale, la contaminazione del sangue durante la procedura era inevitabile in una certa misura14,15. Allo stesso modo, diversi studi hanno riportato che i campioni di NLF erano spesso contaminati da alti livelli di proteine sieriche del sangue 16,17,18. Ciò può interferire con il rilevamento e la quantificazione di biomarcatori specifici per NLF per le malattie respiratorie19. Ciò può anche influenzare le concentrazioni di Ig, in particolare IgA e IgG, nei campioni di NLF poiché il sangue contiene quantità maggiori di IgA e IgG rispetto all'NLF.

Per affrontare queste sfide, questo studio mirava a stabilire un metodo transfaringeo unico, semplice e affidabile per la raccolta di campioni di NLF da topi sperimentali, massimizzando la resa del campione e riducendo al minimo la contaminazione del sangue. Durante i processi sperimentali, i batuffoli di cotone sono stati inseriti nella bocca del topo per inibire la contaminazione del sangue, quindi è stato iniettato il PBS per raccogliere campioni di NLF dalla narice. I livelli di contaminazione ematica nell'NLF sono stati determinati utilizzando una tecnica forense, la chemiluminescenza a base di luminolo, che consente la semi-quantificazione dei livelli di emoglobina (Hb) nei campioni di NLF; la reazione del luminol nell'NLF raccolto con il nuovo metodo è risultata negativa. Pertanto, l'attuale nuovo metodo può migliorare la qualità del campione NLF per vari esperimenti biologici, come i saggi di immunoassorbimento enzimatico anticorpale (ELISA), i profili delle citochine, le determinazioni immunologiche e mediche dei biomarcatori e i modelli di malattia respiratoria murina.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Facoltà di Medicina dell'Università di Kindai ed eseguite secondo i criteri delineati dal National Institutes of Health (NIH)20. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 di 4 mesi. Le informazioni sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Raccolta NLF

  1. Eutanasia di un topo con isoflurano21 al 5% seguendo protocolli istituzionalmente approvati.
  2. Posiziona il topo sulla schiena su una placca chirurgica e fissalo bloccando tutti e quattro gli arti.
  3. Prelevare il sangue dal cuore utilizzando una siringa da 1 ml.
  4. Aprire la cavità addominale usando le forbici per esporre gli organi viscerali e il diaframma.
  5. Incidere il diaframma e le costole con le forbici per rendere visibile l'atrio destro.
  6. Perforare l'atrio destro usando le forbici per rimuovere ulteriormente il sangue.
  7. Metti tre batuffoli di cotone nella bocca dell'animale mentre tiri la lingua.
  8. Separare la mascella inferiore usando le forbici mentre si solleva la testa (posizione con il naso in su) per inibire la contaminazione del sangue nella NLF.
  9. Sostituisci i batuffoli di cotone con quelli nuovi per evitare la contaminazione del sangue.
  10. Dopo che l'emorragia si è fermata, iniettare 200 μL di PBS sterile nella coana e raccogliere l'NLF espulso dalle narici in una provetta da 1,5 mL.
  11. Ripetere ancora una volta il passaggio 1.10.

2. Rilevamento della contaminazione ematica mediante chemiluminescenza del luminol

  1. Sciogliere 1 mg di luminolo e 5 mg di perossido di sodio (Na2O2) con 1 mL di acqua sterile utilizzando una provetta da 1,5 mL per ottenere la soluzione madre.
    NOTA: La concentrazione finale è di 1 mg/mL di luminol e di 5 mg/mL di Na2O2.
  2. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e conservarlo a 4 °C fino al momento dell'uso.
  3. Diluire la soluzione madre 10 volte con acqua deionizzata per ottenere una soluzione funzionante.
    NOTA: La concentrazione finale è di 0,1 mg/mL di luminolo e 0,5 mg/mL di Na2O2.
  4. Pipettare 2 μl di campioni NLF nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
  5. Aggiungere 100 μl della soluzione di luminol diluita a ciascun pozzetto.
  6. Agitare brevemente la piastra a 96 pozzetti per miscelare i campioni con la soluzione di luminol.
  7. Osservare direttamente la chemiluminescenza del luminol al buio.
  8. Semi-quantificare la concentrazione di Hb utilizzando un luminometro, se necessario.

3. Quantificazione di IgA e IgG mediante ELISA

  1. Rivestire i pozzetti di piastre da 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di anticorpo IgA (20 ng/pozzetto; 200 ng/mL) o IgG (10 ng/pozzetto; 100 ng/mL) (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Sigillare le piastre e incubarle a 4 °C per una notte.
  3. Lavare le piastre tre volte con 300 μL/pozzetto di un tampone di lavaggio contenente ogni volta lo 0,05% di Tween 20 in PBS, quindi tamponare le piastre su carta assorbente.
  4. Aggiungere 200 μl di un diluente per test contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e lo 0,2% di Tween 20 in PBS in ciascun pozzetto.
  5. Incubare le piastre a temperatura ambiente (RT) per 60 minuti.
  6. Aspirare il diluente del saggio e poi tamponare le piastre su carta assorbente.
  7. Preparare 100 ng/mL di uno standard IgA o IgG di topo con il diluente del test ed effettuare due diluizioni seriali: 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,25 ng/mL, 3,13 ng/mL, 1,56 ng/mL e 0,78 ng/mL.
    NOTA: Il volume richiesto di ogni standard è di 100 μl per pozzetto.
  8. Diluire i campioni con il diluente del saggio alle diluizioni appropriate: siero (da 104 a 106), NLF (10, 50, 200 e 500) e BALF (da 101 a 104).
    NOTA: Il volume richiesto di ciascun campione è di 100 μl per pozzetto.
  9. Aggiungere 100 μl di standard IgA o IgG e campioni nei pozzetti appropriati.
  10. Incubare le piastre a RT per 75 min.
  11. Lavare le piastre tre volte con 300 μL/pozzetto di tampone di lavaggio ogni volta, quindi tamponare le piastre su carta assorbente.
  12. Diluire un anticorpo F(ab')2 di topo coniugato con perossidasi (vedere la Tabella dei materiali) con il diluente del saggio alla diluizione appropriata: 10diluizione di 4 volte.
    NOTA: Il volume richiesto è di 100 μl per pozzetto.
  13. Aggiungere 100 μl dell'anticorpo F(ab')2 di topo coniugato con perossidasi diluita in ciascun pozzetto.
  14. Incubare le piastre a RT per 75 min.
  15. Lavare le piastre cinque volte con 300 μL/pozzetto di tampone di lavaggio ogni volta, quindi tamponare le piastre su torri di carta.
  16. Aggiungere 100 μl di una soluzione di substrato contenente tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno in ciascun pozzetto.
  17. Incubare le piastre a RT per 5 minuti.
  18. Aggiungere 50 μl di una soluzione di arresto, acido solforico 2 N (2N H2SO4), a ciascun pozzetto.
  19. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
  20. Determinare le concentrazioni di IgA e IgG in ciascun campione utilizzando le curve standard.

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Risultati

Utilizzando il metodo convenzionale o innovativo, i campioni di NLF sono stati raccolti da topi C57BL/6 attraverso la via transfaringea. Come mostrato nella Figura 1, i campioni NLF raccolti con il metodo convenzionale erano leggermente sfumati di rosa (Figura 1A); i campioni di NLF raccolti con il nuovo metodo erano chiari (Figura 1B). Poiché la differenza sembrava derivare dalla contaminazione del sangue nei campioni NLF con il me...

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Discussione

La lavanda nasale è una tecnica preziosa per acquisire informazioni biochimiche, citologiche e biologiche nelle malattie respiratorie, come l'influenza e il COVID-1923. Oltre a identificare varie cellule infiltranti, la composizione non cellulare del tratto respiratorio può essere esaminata dai campioni NLF utilizzando vari metodi, come ELISA, immunoblot e reazione a catena quantitativa della polimerasi 1,19,24<...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Seiichi Omura, Ph.D., Cong Thanh Nguyen, M.D., Ph.D., Kota Moriguchi, M.D., Ph.D., Reona Shiro, M.D., e Sandesh Rimal, M.S., Dipartimento di Microbiologia, Facoltà di Medicina dell'Università di Kindai, e Hirotaka Ebina, Ph.D., Shinya Okamura, Ph.D., e Yasuo Yoshioka, Ph.D., Virus Vaccine Group (Gruppo di vaccini antivirali), BIKEN Innovative Vaccine Research Alliance Laboratories, Istituto di ricerca per le malattie microbiche, Università di Osaka, per utili discussioni. Esprimiamo anche la nostra gratitudine ai membri del Life Science Research Institute, Kindai University, per la loro eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia, Giappone, attraverso la borsa di studio Monbukagakusho (MEXT, 2021-2025) (IA), la sovvenzione in aiuto per la ricerca scientifica KAKENHI della Società giapponese per la promozione della scienza (JSPS) JP23K06493 (FS), JP21K07287/JP24K10500 (AMP) e JP22K18378/JP24K10163 (IT) e la sovvenzione per il miglioramento della ricerca dell'Università Kindai KD2406 (FS) e KD2506 (IT).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago per fissazione animaleNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, GiapponeKN-358-AAbbiamo fissato un topo con aghi per la fissazione animale. Acciaio inossidabile; lunghezza totale, 23 mm; e punta dell'ago, 15 mm.
BD OptEIATM  Set di reagenti per substrato TMBBD Biosciences, San Diego, CA, USA555214Abbiamo aggiunto 100 μ L di soluzione di substrato TMB per pozzetto.
Campana di vetroNANA Abbiamousato una campana di vetro per l'anestesia.
Piastre a 96 pozzetti trasparenti a fondo piatto non sterili ThermoFisher Scientific, Rochester, NY, USA442404Abbiamo utilizzato piastre a 96 pozzetti Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile con trattamento superficiale MaxiSorp per saggi di immunoassorbimento enzimatico.
Batuffolo di cotoneSansho Co., Ltd., Tokyo, Giappone94-1951Abbiamo usato batuffoli di cotone per evitare la contaminazione del sangue. Il diametro dei batuffoli di cotone era di 7 mm.
Siero fetale bovinoSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA172012-500 MLAbbiamo aggiunto il 10% di siero fetale bovino al diluente del saggio.
Forcipe (Micro pinzette per esperimenti di ricerca, punta curva)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Giappone91-1506Abbiamo usato le pinze per la dissezione. Modello, HSC 551-10; e su tutta la lunghezza, 105 mm.
Forcipe (pinzette di precisione)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Giappone91-2772Abbiamo usato il forcipe per la dissezione. Modello, HSC 607-12; tutta la lunghezza complessiva, 120 mm; e diametro della punta, 0,3 mm.
Capra Anti-Topo IgA-UNLBSouthernBiotech, Birmingham, AL, USA1040-01Abbiamo rivestito Clear-Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates con 100 μ L/pozzetto (20 ng/pozzetto) di immunoglobulina A totale.
Isoflurano Viatris Inc., Canonsburg, PA, USANAAbbiamo usato l'isoflurano per l'anestesia.
Set di reagenti per la retrazione del luminolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Giappone124-06511Abbiamo utilizzato un set di reagenti per la reazione del luminol per rilevare l'emoglobina nei campioni NLF.
MicrotubeWatson Co., Ltd., Tokyo, Giappone131-7155CAbbiamo utilizzato microprovette per la raccolta di NLF e BALF (microprovette da 1,5 mL con tappo di bloccaggio, fondo rotondo, tappo soft touch).
Milli-Q acquaMerck KGaA, Darmstadt, GermaniaMilli-Q Direct 8Abbiamo utilizzato l'acqua MilliQ per realizzare una soluzione di rezione in luminol.
Mini-Shaker PSU-2TBiosan Ltd., Riga, LettoniaPSU-2TAbbiamo agitato piastre a 96 pozzetti utilizzando il Mini-Shaler PSU-2T.
Ceppo di topoCLEA Japan, Inc., Tokyo, GiapponeNAabbiamo usato topi maschi C57BL/6 di 4 mesi.
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treatated, Micropiastra a fondo piattoThermo Fisher Scientific Nunc A/S . Kamstrupvej,Roskilde, Danimarca136101Per il test del luminol abbiamo utilizzato la micropiastra NuncTM MicroWellTM 96-Well, Nunclon con trattamento Delta, a fondo piatto.
AffiniAffiniPure F(ab')2 Frammento di capra IgG anti-topo, F(ab')2 Frammento specifico (reazione crociata minima alle proteine del siero umano, bovino e cavallo)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA115-036-072Abbiamo aggiunto 100 μ L del frammento AffiniPure F(ab')2 coniugato con perossidasi anti-topo IgG di capra, F(ab')2 frammento specifico, come anticorpo di rilevamento (diluizione di 10.000 volte) per ciascun pozzetto.
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USAD8537-500MLAbbiamo utilizzato la soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (modificata senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, liquida, filtrata in modo sterile, adatta per la coltura cellulare) per la raccolta di NLF e BALF.
Pipetta Watson Co., Ltd., Tokyo, GiapponeNAAbbiamo usato un 200-μ L. pipetta per lavaggio nasale.
Puntale per pipettaWatson Co., Ltd., Tokyo, GiapponeNAAbbiamo usato un 200-μ L punta per pipetta multifit per lavaggio nasale.
Poliossietilene(20) Monolaurato di sorbitano (Tween 20)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Giappone167-11515Abbiamo aggiunto lo 0,05% di Tween 20 al tampone di lavaggio e lo 0,2% di Tween 20 al diluente del saggio.
Anticorpo IgG (reattività x minima) di capra purificataBioLegend, San Diego, CA, USA405301Abbiamo rivestito piastre a 96 pozzetti Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile con 100 μ L/pozzetto (10 ng/pozzetto) di immunoglobulina totale G.
Forbici piccole, a doppia puntaSansho Co., Ltd., Tokyo, Giappone91-7005Abbiamo usato le forbici per la dissezione. Modello, S-4A; e complessivamente tutta la lunghezza, 115 mm.
Acido solforicoWako Pure Chemical Industries, Ltd, Tokyo, Giappone192-04755Abbiamo aggiunto 50 μ L di acido solforico 2 N a ciascun pozzetto per fermare la reazione.
Catetere endovenoso Surflo Terumo Corporation, Tokyo, GiapponeSR-FS2032Abbiamo utilizzato un catetere endovenoso surflo e iniettato PBS nella trachea per il lavaggio broncoalveolare. Catetere, 20G; lunghezza del catetere, 32 mm; diametro interno del catetere, 0,80 mm; diametro esterno del catetere, 1,1 mm; e needel interno, 22G.
Forbici diritte chirurgicheSansho Co., Ltd., Tokyo, Giappone91-7004Abbiamo usato le forbici per la dissezione. Modello, S-3B; e su tutta la lunghezza, 120 mm.
Piastra chirurgicaNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, GiapponeKN-321-BAbbiamo usato un pannello di sughero per la dissezione. Profondità, 20 cm; larghezza, 15 cm; e altezza 3 cm.
Lettore di micropiastre multimodale ibrido Synergy H1 Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USANAAbbiamo misurato l'assorbanza dei campioni a 450 nm, utilizzando il lettore di micropiastre multimodale ibrido Synergy H1.
SiringaTerumo Corporation, Tokyo, Giappone SS-01TAbbiamo utilizzato una siringa da 1 ml per il prelievo di sangue dal cuore.
Filettatura  Niccho Kogyo Co., Ltd. Tokyo GiapponeNAAbbiamo legato un catetere con un filo per garantire il corretto posizionamento durante la procedura.

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