Raccolta di liquidi per il lavaggio nasale muino senza contaminazione del sangue

Sia nella ricerca clinica che in quella di base, i metodi di raccolta dei campioni appropriati sono fondamentali per valutare i risultati. La lavanda nasale è una tecnica di irrigazione utilizzata per analizzare le componenti cellulari e umorali delle vie respiratorie ^1,2,3. Clinicamente, il liquido di lavaggio nasale (NLF) è stato utilizzato come campione non invasivo efficace per la scoperta di biomarcatori, con diversi studi a sostegno del suo uso in varie malattie respiratorie, tra cui sinusite, fibrosi cistica e disturbi respiratori generali 4,5,6,7. Negli animali da esperimento, l'NLF è stato utilizzato anche per studiare modelli di malattie respiratorie, tra cui l'influenza, la malattia da coronavirus-2019 (COVID-19) e la malattia allergica ^3,8,9. Questo metodo è ampiamente utilizzato per determinare i principali biomarcatori infiammatori, come le cellule polimorfonucleate e le citochine, che vengono spesso esaminate come indicatori di risposte ad allergeni, asma e infezioni respiratorie 10,11,12. Più recentemente, per studiare l'efficacia e la sicurezza di potenziali candidati vaccini intranasali, i campioni di NLF sono stati spesso raccolti da animali da esperimento e i livelli di patogeno e immunoglobulina (Ig) nei campioni di NLF sono stati quantificati come indicatori¹³.

Nei topi sperimentali, l'NLF può essere raccolto utilizzando il metodo trans-faringeo o trans-tracheale. Nel metodo trans-faringeo, la testa murina, compresa la regione palatofaringea, è stata separata dalla laringe, quindi un catetere è stato inserito attraverso l'apertura faringea nella coana per iniettare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e raccogliere NLF dalla narice¹⁴. Il metodo trans-tracheale ha ottenuto l'accesso al tratto respiratorio attraverso la trachea senza recidere la testa e l'NLF è stato raccolto dalla narice, riducendo al minimo il rischio di contaminazione del sangue. Sebbene questi due metodi primari siano stati impiegati per la raccolta di NLF nei topi sperimentali, entrambi i metodi convenzionali hanno i loro limiti. È stato dimostrato che il metodo trans-tracheale produce quantità inferiori di NLF rispetto al metodo trans-faringeo a causa della fuoriuscita di liquido di lavaggio trans-tracheale nella cavità orale. Lo studio precedente ha dimostrato che, dopo l'iniezione di PBS, i volumi di fluido recuperati nella NLF erano rispettivamente del 70%-80% e del 90%-100% nei metodi trans-tracheale e trans-faringeo. Sebbene il metodo trans-faringeo possa essere considerato migliore con quantità maggiori di NLF rispetto al metodo trans-tracheale, la contaminazione del sangue durante la procedura era inevitabile in una certa misura^14,15. Allo stesso modo, diversi studi hanno riportato che i campioni di NLF erano spesso contaminati da alti livelli di proteine sieriche del sangue 16,17,18. Ciò può interferire con il rilevamento e la quantificazione di biomarcatori specifici per NLF per le malattie respiratorie¹⁹. Ciò può anche influenzare le concentrazioni di Ig, in particolare IgA e IgG, nei campioni di NLF poiché il sangue contiene quantità maggiori di IgA e IgG rispetto all'NLF.

Per affrontare queste sfide, questo studio mirava a stabilire un metodo transfaringeo unico, semplice e affidabile per la raccolta di campioni di NLF da topi sperimentali, massimizzando la resa del campione e riducendo al minimo la contaminazione del sangue. Durante i processi sperimentali, i batuffoli di cotone sono stati inseriti nella bocca del topo per inibire la contaminazione del sangue, quindi è stato iniettato il PBS per raccogliere campioni di NLF dalla narice. I livelli di contaminazione ematica nell'NLF sono stati determinati utilizzando una tecnica forense, la chemiluminescenza a base di luminolo, che consente la semi-quantificazione dei livelli di emoglobina (Hb) nei campioni di NLF; la reazione del luminol nell'NLF raccolto con il nuovo metodo è risultata negativa. Pertanto, l'attuale nuovo metodo può migliorare la qualità del campione NLF per vari esperimenti biologici, come i saggi di immunoassorbimento enzimatico anticorpale (ELISA), i profili delle citochine, le determinazioni immunologiche e mediche dei biomarcatori e i modelli di malattia respiratoria murina.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Facoltà di Medicina dell'Università di Kindai ed eseguite secondo i criteri delineati dal National Institutes of Health (NIH)²⁰. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 di 4 mesi. Le informazioni sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Raccolta NLF

1. Eutanasia di un topo con isoflurano²¹ al 5% seguendo protocolli istituzionalmente approvati.
2. Posiziona il topo sulla schiena su una placca chirurgica e fissalo bloccando tutti e quattro gli arti.
3. Prelevare il sangue dal cuore utilizzando una siringa da 1 ml.
4. Aprire la cavità addominale usando le forbici per esporre gli organi viscerali e il diaframma.
5. Incidere il diaframma e le costole con le forbici per rendere visibile l'atrio destro.
6. Perforare l'atrio destro usando le forbici per rimuovere ulteriormente il sangue.
7. Metti tre batuffoli di cotone nella bocca dell'animale mentre tiri la lingua.
8. Separare la mascella inferiore usando le forbici mentre si solleva la testa (posizione con il naso in su) per inibire la contaminazione del sangue nella NLF.
9. Sostituisci i batuffoli di cotone con quelli nuovi per evitare la contaminazione del sangue.
10. Dopo che l'emorragia si è fermata, iniettare 200 μL di PBS sterile nella coana e raccogliere l'NLF espulso dalle narici in una provetta da 1,5 mL.
11. Ripetere ancora una volta il passaggio 1.10.

2. Rilevamento della contaminazione ematica mediante chemiluminescenza del luminol

1. Sciogliere 1 mg di luminolo e 5 mg di perossido di sodio (Na₂O₂) con 1 mL di acqua sterile utilizzando una provetta da 1,5 mL per ottenere la soluzione madre.
   NOTA: La concentrazione finale è di 1 mg/mL di luminol e di 5 mg/mL di Na₂O₂.
2. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e conservarlo a 4 °C fino al momento dell'uso.
3. Diluire la soluzione madre 10 volte con acqua deionizzata per ottenere una soluzione funzionante.
   NOTA: La concentrazione finale è di 0,1 mg/mL di luminolo e 0,5 mg/mL di Na₂O₂.
4. Pipettare 2 μl di campioni NLF nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
5. Aggiungere 100 μl della soluzione di luminol diluita a ciascun pozzetto.
6. Agitare brevemente la piastra a 96 pozzetti per miscelare i campioni con la soluzione di luminol.
7. Osservare direttamente la chemiluminescenza del luminol al buio.
8. Semi-quantificare la concentrazione di Hb utilizzando un luminometro, se necessario.

3. Quantificazione di IgA e IgG mediante ELISA

1. Rivestire i pozzetti di piastre da 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di anticorpo IgA (20 ng/pozzetto; 200 ng/mL) o IgG (10 ng/pozzetto; 100 ng/mL) (vedere la Tabella dei materiali).
2. Sigillare le piastre e incubarle a 4 °C per una notte.
3. Lavare le piastre tre volte con 300 μL/pozzetto di un tampone di lavaggio contenente ogni volta lo 0,05% di Tween 20 in PBS, quindi tamponare le piastre su carta assorbente.
4. Aggiungere 200 μl di un diluente per test contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e lo 0,2% di Tween 20 in PBS in ciascun pozzetto.
5. Incubare le piastre a temperatura ambiente (RT) per 60 minuti.
6. Aspirare il diluente del saggio e poi tamponare le piastre su carta assorbente.
7. Preparare 100 ng/mL di uno standard IgA o IgG di topo con il diluente del test ed effettuare due diluizioni seriali: 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,25 ng/mL, 3,13 ng/mL, 1,56 ng/mL e 0,78 ng/mL.
   NOTA: Il volume richiesto di ogni standard è di 100 μl per pozzetto.
8. Diluire i campioni con il diluente del saggio alle diluizioni appropriate: siero (da 10⁴ a 10⁶), NLF (10, 50, 200 e 500) e BALF (da 10¹ a 10⁴).
   NOTA: Il volume richiesto di ciascun campione è di 100 μl per pozzetto.
9. Aggiungere 100 μl di standard IgA o IgG e campioni nei pozzetti appropriati.
10. Incubare le piastre a RT per 75 min.
11. Lavare le piastre tre volte con 300 μL/pozzetto di tampone di lavaggio ogni volta, quindi tamponare le piastre su carta assorbente.
12. Diluire un anticorpo F(ab')₂ di topo coniugato con perossidasi (vedere la Tabella dei materiali) con il diluente del saggio alla diluizione appropriata: 10^{diluizione di 4} volte.
    NOTA: Il volume richiesto è di 100 μl per pozzetto.
13. Aggiungere 100 μl dell'anticorpo F(ab')₂ di topo coniugato con perossidasi diluita in ciascun pozzetto.
14. Incubare le piastre a RT per 75 min.
15. Lavare le piastre cinque volte con 300 μL/pozzetto di tampone di lavaggio ogni volta, quindi tamponare le piastre su torri di carta.
16. Aggiungere 100 μl di una soluzione di substrato contenente tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno in ciascun pozzetto.
17. Incubare le piastre a RT per 5 minuti.
18. Aggiungere 50 μl di una soluzione di arresto, acido solforico 2 N (2N H₂SO₄), a ciascun pozzetto.
19. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
20. Determinare le concentrazioni di IgA e IgG in ciascun campione utilizzando le curve standard.

Utilizzando il metodo convenzionale o innovativo, i campioni di NLF sono stati raccolti da topi C57BL/6 attraverso la via transfaringea. Come mostrato nella Figura 1, i campioni NLF raccolti con il metodo convenzionale erano leggermente sfumati di rosa (Figura 1A); i campioni di NLF raccolti con il nuovo metodo erano chiari (Figura 1B). Poiché la differenza sembrava derivare dalla contaminazione del sangue nei campioni NLF con il metodo convenzionale, la contaminazione del sangue nei campioni NLF è stata esaminata utilizzando una reazione con luminol. Come mostrato nella Figura 2, la chemiluminescenza nei campioni NLF raccolti con il metodo convenzionale era positiva, indicando una contaminazione del sangue (Figura 2A). D'altra parte, la chemiluminescenza nei campioni NLF raccolti con il nuovo metodo era negativa (Figura 2B). Per negare plausibili tendenze emorragiche nei topi, è stato raccolto anche il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) utilizzando il metodo trans-tracheale standard; il campione BALF non presentava alcuna contaminazione ematica. Questi risultati hanno dimostrato che il nuovo metodo di raccolta NLF era superiore a quello convenzionale.

Per determinare se la contaminazione ematica nei campioni di NLF potesse influenzare le concentrazioni di IgA e IgG, i livelli di IgA e IgG nei sieri e NLF sono stati quantificati mediante ELISA. Come mostrato nella Figura 3, i livelli sierici di IgA e IgG erano simili tra i due metodi; le concentrazioni di IgA (Figura 3A) e IgG (Figura 3B) erano molto più alte nei sieri che nella NLF. I livelli di IgA nei campioni NLF tendevano ad essere più bassi nel nuovo metodo rispetto al metodo convenzionale (P < 0,1, t-test di Student); le concentrazioni di IgG nei campioni NLF erano significativamente più basse nel nuovo metodo rispetto al metodo convenzionale (P < 0,05, t-test di Student). Pertanto, la contaminazione del sangue con il metodo convenzionale sembrava produrre concentrazioni di anticorpi IgA e IgG imprecise nei campioni NLF; Il nuovo metodo era più preciso del metodo convenzionale.

Figura 1: Raccolta del liquido di lavaggio nasale (NLF) con il metodo convenzionale o innovativo. (A) Nel metodo convenzionale, l'NLF è stato contaminato con sangue e il colore del campione di NLF è diventato rosa pallido. (B) Nel nuovo metodo, non c'era contaminazione ematica nella NLF. (A,B) In entrambi i gruppi, il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) raccolto per via trans-tracheale era chiaro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Contaminazione del sangue rilevata dalla reazione con luminol. (A,B) Due μL di campioni NLF e BALF sono stati aggiunti in una piastra a 96 pozzetti e miscelati con 100 μL di una soluzione di luminol diluita. Il segnale di chemiluminescenza blu-bianco è stato rilevato nel campione di NLF contaminato raccolto con il metodo convenzionale (A), ma non rilevabile nel campione di NLF raccolto con il nuovo metodo (B). I campioni di sangue e BALF sono stati utilizzati rispettivamente come controlli positivi e negativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quantificazione delle concentrazioni di IgA e IgG in campioni di siero, NLF e BALF mediante saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). (A,B) L'NLF è stato raccolto dai topi utilizzando il metodo convenzionale (barra aperta) e il nuovo metodo (barra chiusa); anche il siero e il BALF sono stati raccolti dagli stessi topi. Le concentrazioni di IgA e IgG sono state quantificate mediante ELISA. I campioni di siero avevano livelli molto più elevati di IgA e IgG rispetto ai campioni NLF e BALF. Nella NLF, le concentrazioni di IgA tendevano ad essere più basse e le concentrazioni di IgG erano significativamente più basse nel nuovo metodo rispetto al metodo convenzionale (IgA, P < 0,1; IgG, P < 0,05, test t di Student). I risultati sono la media + l'errore standard della media di sei topi per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.