Questo protocollo consente l'isolamento di un numero sufficiente di condrociti primari entro 6-8 ore, facilitando ulteriori indagini approfondite sulla biologia della cartilagine e sui meccanismi della malattia della cartilagine.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura in vitro di condrociti primari di topo per la biologia della cartilagine
In questo articolo
Sommario
Abstract
La distruzione della cartilagine articolare porta a un'alterazione dell'attività dei condrociti, che è un importante fattore causale in una varietà di malattie della cartilagine, tra cui l'osteoartrite (OA) e l'artrite reumatoide (RA). Essendo il tipo di cellula più abbondante nella cartilagine, uno studio approfondito delle proprietà biologiche dei condrociti è essenziale per lo sviluppo di strategie efficaci di trattamento della malattia. L'isolamento e la coltura dei condrociti primari forniscono importanti materiali sperimentali per lo studio della malattia della cartilagine e contribuiscono a svelare i meccanismi di lesione e riparazione della cartilagine. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei metodi di isolamento e coltura in vitro per i condrociti primari derivati dai topi. Utilizzando il protocollo ottimizzato della collagenasi II, l'isolamento dei condrociti può essere completato entro 8 ore per campioni di cartilagine dell'articolazione del ginocchio di topo neonatale. La resa cellulare è di circa 1-2 × 10³ cellule/mg di tessuto cartilagineo, variabile con la freschezza del tessuto e la densità cellulare iniziale; Le cellule isolate mostrano una vitalità del >90%. Questo protocollo utilizza come esempio i condrociti primari di topo, che mostrano le caratteristiche morfologiche e lo stato di adesione delle cellule coltivate per 1, 2 e 5 giorni dopo l'isolamento. La reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa (RT-qPCR) e il western blotting hanno dimostrato che il trattamento con interleuchina-1β (IL-1β) ha ridotto il collagene di tipo II alfa 1 (Col2a1) e aumentato l'espressione della metallopeptidasi 13 della matrice (Mmp13), confermando che i condrociti isolati rispondono agli stimoli infiammatori. Rispetto ai metodi convenzionali, questo protocollo impiega una maggiore concentrazione di collagenasi per ridurre l'impatto del tempo di isolamento prolungato sulla vitalità cellulare, evitando al contempo potenziali danni cellulari dovuti al trattamento con tripsina. I condrociti primari ottenuti sono puri e vitali, adatti per studi approfonditi sui meccanismi correlati alla lesione cartilaginea, che hanno importanti implicazioni per la ricerca in vitro e il trattamento clinico della malattia cartilaginea.
Introduzione
La distruzione della cartilagine articolare è una delle principali cause di varie malattie della cartilagine, come l'OA e l'AR 1,2. I condrociti, il tipo di cellula predominante nella cartilagine, sono essenziali per mantenere l'omeostasi e facilitare la riparazione in risposta alla lesione3. Le alterazioni dell'attività dei condrociti non solo influenzano l'integrità strutturale della cartilagine, ma inducono anche risposte infiammatorie e progressiva degenerazione tissutale4. Pertanto, un'indagine approfondita delle proprietà biologiche dei condrociti è fondamentale per chiarire l'eziopatogenesi di queste malattie.
Negli ultimi anni, il ruolo dei condrociti nelle risposte infiammatorie ha ricevuto una crescente attenzione. Gli studi hanno dimostrato che le citochine infiammatorie, come l'IL-1β e il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), compromettono significativamente i processi metabolici dei condrociti, con conseguente aumento dell'espressione degli enzimi che degradano la matrice e diminuzione della sintesi della matrice 5,6,7. Questi cambiamenti alla fine portano alla graduale degenerazione della cartilagine e alla disfunzione articolare. Pertanto, lo studio delle alterazioni biologiche dei condrociti in condizioni patologiche all'interno di modelli in vitro è diventato particolarmente imperativo. Basandosi sulla tradizionale coltura monostrato bidimensionale (2D), i recenti progressi nella coltura di condrociti tridimensionali (3D) e nelle tecnologie degli organoidi sono stati sempre più adottati nella ricerca relativa alla cartilagine. Questi sistemi raffinati offrono un microambiente fisiologicamente più rilevante e forniscono preziose informazioni sul comportamento dei condrociti in contesti patologici8.
La selezione di una fonte cellulare determina in modo critico se i risultati in vitro ricapitolano accuratamente la fisiopatologia delle articolazioni. A differenza delle linee di condrociti immortalizzate o degli espianti di cartilagine, i condrociti primari conservano il background genetico nativo, le vie di segnalazione del calcio meccanosensibili e la stabilità fenotipica della cartilagine articolare, esibendo così una capacità condrogenica superiore e comportamenti biologici che riflettono più da vicino quelli delle cellule cartilaginee residenti9. Sono state documentate differenze sistematiche nelle fonti di segnalazione del calcio e nei canali ionici chiave e nelle vie a valle tra i condrociti primari e la linea cellulare ATDC510. Di conseguenza, quando si studia la fisiologia o la patologia articolare, i condrociti primari dovrebbero avere la priorità. Pertanto, l'ottimizzazione dell'isolamento e della coltura dei condrociti primari è essenziale per modellare accuratamente la biologia correlata alla malattia e per esplorare potenziali farmaci terapeutici 11,12,13,14,15. Tuttavia, i metodi esistenti compromettono la vitalità cellulare o l'integrità del fenotipo a causa della digestione prolungata16,17.
Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura in vitro di condrociti primari derivati dal tessuto cartilagineo di topo, che produce rapidamente cellule sufficienti. Rispetto ai protocolli convenzionali di digestione prolungata a bassa concentrazione enzimatica, questo studio ha ottimizzato le condizioni di digestione enzimatica e le fasi di pretrattamento dei tessuti. Questa ottimizzazione ha ridotto significativamente il tempo di digestione a 6-8 ore, evitando potenziali danni cellulari dovuti al trattamento con tripsina15,17. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere circa 1-2 × 103 condrociti da ogni mg di tessuto cartilagineo di topo. Questo protocollo offre una guida affidabile per l'isolamento e la coltura di condrociti primari in vitro, fornendo un modello robusto per gli studi sulla malattia della cartilagine.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Xi'an Honghui (n. 202309009) e le procedure sperimentali hanno aderito rigorosamente ai principi delle 3R di sostituzione, riduzione e perfezionamento per la sperimentazione animale.
La Figura 1A illustra un diagramma schematico della preparazione dei reagenti e delle apparecchiature. La Tabella dei Materiali include informazioni sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate in questo protocollo.
1. Topi sperimentali
NOTA: In questo studio sono stati utilizzati quattro topi C57BL/6J wild-type di 3 giorni.
- Mantenere le gabbie ad una temperatura costante di 25 °C ± 2 °C e umidità del 50%-60%, con un ciclo luce/buio di 12 h/12 h. Fornire una dieta sterile per topi di grado SPF (priva di agenti patogeni specifici) (sterilizzata mediante irradiazione 60Co) e acqua sterile ad libitum.
- Raccogliere la cartilagine dell'articolazione del ginocchio (~10 mg/topo) da quattro topi di 3 giorni post mortem per isolare i condrociti primari.
2. Raccolta e lavorazione dei campioni di cartilagine
- Processamento del topo e dissezione tissutale
- Eutanasia nei topi neonati entro 3 giorni dalla nascita. Sterilizzare la superficie del corpo strofinando con alcol medico al 75%.
- Isolare le articolazioni del ginocchio del topo con strumenti chirurgici sterili. Mettili in 1x PBS sterile.
- Asportare accuratamente i muscoli, le ossa, la sinovia e altri tessuti connettivi proliferativi che circondano l'articolazione del ginocchio con strumenti chirurgici sterili. Conservare solo il tessuto cartilagineo dell'articolazione del ginocchio.
- Sciacquare i campioni di tessuto 3 volte con 1 PBS sterile. Scartare il liquido.
NOTA: La Figura 1B illustra un diagramma schematico semplificato dell'acquisizione e del pretrattamento del tessuto cartilagineo.
Figura 1: Flusso di lavoro semplificato per la preparazione del materiale e l'elaborazione dei campioni di cartilagine. (A) Diagramma schematico della configurazione dei reagenti e delle apparecchiature, inclusi reagenti, materiali di consumo e strumenti principali. (B) Protocollo passo-passo per l'elaborazione dei tessuti cartilaginei dalle articolazioni del ginocchio di topo. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Isolamento e coltura dei condrociti primari
- Trasferire il tessuto cartilagineo isolato in una nuova piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti. Utilizzando una lama chirurgica sterile n. 11, tritare il tessuto in piccoli pezzi di circa 0,25 mmdi dimensione 3 . Risciacquare una volta con 1x PBS sterile preraffreddato. Scartare il liquido.
- Aggiungere 2 mL di soluzione digestiva preriscaldata (37 °C) contenente collagenasi II ad alta concentrazione (25 mg/mL, disciolta in terreno basale sterile Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12]) per coprire il blocco tissutale.
- Incubare la piastra di coltura cellulare in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per 15 minuti per la digestione enzimatica. Dopo l'incubazione, scartare il liquido.
- Ripetere i passaggi 3.2 e 3.3.
NOTA: La digestione enzimatica ad alta concentrazione è una fase preliminare. Ha lo scopo di predigerire il tessuto, scompone parzialmente la sua struttura per una migliore digestione successiva e rimuove le aderenze della matrice che possono esistere a causa del taglio dalla periferia del tessuto. - Aggiungere 2 mL di soluzione digestiva preriscaldata (37 °C) contenente collagenasi II a bassa concentrazione (5 mg/mL, disciolta in terreno basale sterile DMEM/F12) per coprire il blocco tissutale.
- Incubare la piastra di coltura cellulare in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per 6-8 ore per la digestione e osservare l'andamento della separazione cellulare. Eseguire occasionalmente un'agitazione orizzontale lenta (80-120 giri/min) o un pipettaggio delicato per migliorare l'efficienza della lisi.
NOTA: Per il tessuto di topo neonatale, il rilascio delle cellule è visibile intorno alle 3 ore, con un isolamento completo ottenibile tra le 6 e le 8 ore. Durante il trattamento di 6-8 ore con collagenasi II, osservare la lisi ogni ora e terminare la digestione quando non sono visibili ad occhio nudo pezzi di tessuto evidenti e il 90% delle cellule è libero e in sospensione al microscopio. Durante il processo di digestione, si possono osservare condrociti simili a vacuoli che si staccano gradualmente dalla massa del tessuto cartilagineo al microscopio ottico. Questo passaggio può essere ripetuto più volte per ridurre al minimo i danni ai condrociti causati da una digestione prolungata e la soluzione digestiva può essere sostituita con una soluzione fresca di digestione a bassa concentrazione di collagenasi II per aumentare la resa cellulare. - Filtrare tutti i prodotti della digestione attraverso un filtro cellulare da 100 μm in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml.
NOTA: Utilizzare un filtro cellulare da 100 μm per prevenire la perdita di aggregati di condrociti e aumentare la resa. I frammenti di tessuto residui vengono rimossi durante lo scambio del terreno. - Sciacquare la piastra di coltura cellulare con 1x PBS sterile. Filtrare nuovamente attraverso il filtro cellulare.
- Raccogliere tutto il filtrato del passaggio precedente in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente con il freno spento. Eliminare il surnatante dopo la centrifugazione.
- Aggiungere 2 mL di 1x PBS sterile e risospendere delicatamente il precipitato soffiando leggermente e aspirando con una pipetta. Trasferire in una provetta da centrifuga sterile da 15 ml. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente con il freno spento. Eliminare il surnatante dopo la centrifugazione.
- Risospendere il precipitato del passaggio 4.10 con 2 mL di terreno completo sterile DMEM/F12 appena preparato, che contiene il 15% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di P/S. Enumerare la sospensione cellulare raccolta utilizzando un emocitometro, quindi piastrarle in una piastra di coltura sterile da 10 cm a 2-2,5 × 105 cellule/cm2. Integrare fino a un volume finale di 10 mL con terreno completo.
NOTA: La densità di semina dei condrociti dovrebbe essere di 2-2,5 × 105 cellule/cm2, poiché la semina a bassa o media densità può portare a uno spostamento fenotipico dei condrociti articolari verso i fibroblasti. L'attività di proliferazione e la vitalità delle cellule primarie isolate possono essere valutate utilizzando saggi MTT opzionali o colorazione con esclusione con blu di tripano (fase opzionale). - Incubare in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C.
- Sostituire con un terreno completo DMEM/F12 fresco (contenente il 10% di FBS, 1% di P/S) dopo aver osservato che le cellule sono completamente aderenti alla parete al microscopio ottico.
- Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Continuare la coltura fino a quando la confluenza raggiunge il 70%, a quel punto è possibile eseguire esperimenti successivi.
NOTA: La concentrazione sierica nel terreno di coltura può essere aumentata fino al 15% in base alle condizioni della cellula. La Figura 2 illustra un diagramma schematico semplificato della digestione, dell'isolamento e della coltura delle cellule primarie del tessuto cartilagineo.
Figura 2: Procedura semplificata per la digestione del tessuto cartilagineo, l'isolamento delle cellule primarie e la coltura. La cartilagine è stata macinata e digerita continuamente con una soluzione digestiva di collagenasi II ad alta concentrazione per 15 minuti, ripetuta una volta, quindi digerita con una soluzione di digestione di collagenasi II a bassa concentrazione per 6-8 ore per isolare le cellule. Il tessuto digerito è stato quindi filtrato e il filtrato è stato raccolto e centrifugato. Il pellet cellulare è stato lavato con 1x PBS e coltivato in terreno DMEM/F12 fino a quando la confluenza ha raggiunto il 70%, a quel punto le cellule erano pronte per gli esperimenti successivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Verifica funzionale dei condrociti primari
- Metabolismo e cambiamenti dei condrociti in condizioni infiammatorie.
- Trattare le cellule con 10 ng/mL di IL-1β per 24 ore per simulare le condizioni infiammatorie.
- Per la RT-qPCR e il western blotting, estrarre l'RNA totale o la proteina totale per rilevare gli indicatori metabolici della matrice extracellulare dei condrociti, come COL2A1, MMP13.
NOTA: La Figura 3 illustra un diagramma schematico della validazione funzionale dei condrociti primari e delle successive procedure sperimentali. Le informazioni sugli anticorpi sono fornite nella Tabella dei materiali. Le procedure dettagliate per il western blotting e la RT-qPCR sono fornite nella Tabella 1, Tabella 2, Tabella 3, Tabella 4 e Tabella 5. Tutti i metodi hanno seguito i protocolli standard11,18.
Figura 3: Diagramma schematico del programma di validazione funzionale dei condrociti primari. Condizioni infiammatorie indotte dal trattamento con IL-1β; effetti sui fenotipi associati alla cartilagine valutati mediante RT-qPCR e Western blotting. Abbreviazioni: IL-1β = interleuchina-1β; RT-qPCR = Reazione quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Condizioni del flusso di lavoro Western Blotting | |
| Passo | Condizione / Reagente |
| Preparazione del gel SDS-PAGE | 8 % (p/v) di gel separatore Tris-HCl |
| Elettroforesi impilabile | 80 V, 30–40 min |
| Risoluzione dell'elettroforesi | 120 V, 1–1,5 h |
| Trasferimento | Semi-secco, 15 V, 30–60 min |
| Inceppamento | Tampone di bloccaggio rapido, 2 h a temperatura ambiente |
Tabella 1: Condizioni del flusso di lavoro del Western blotting. Riepilogo delle condizioni di western blotting, inclusa la composizione SDS-PAGE, i parametri dell'elettroforesi, le impostazioni di trasferimento e la procedura di blocco.
| Miscela di reazioni di trascrizione inversa | |
| Componente | Volume (μL) |
| 5× Tampone di reazione della trascrittasi inversa del trascrittore | 4 |
| Miscela di deossinucleotidi (10 mM ciascuno) | 2 |
| Inibitore della RNasi Protector (40 U/μL) | 0.5 |
| Trascrittore trascrittasi inversa (20 U/μL) | 0.5 |
| Acqua priva di nucleasi | fino a 20 |
| Volume totale | 20 |
Tabella 2: Miscela di reazioni di trascrizione inversa. Composizione della reazione di trascrizione inversa per la sintesi del cDNA.
| Informazioni sul primer per RT-qPCR di condrociti primari di topo | ||||
| Nome del gene | Sequenza(5'3 ') | Temperatura di ricottura (°C) | ||
| mGapdh | Inoltrare | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| Inverso | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | Inoltrare | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| Inverso | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | Inoltrare | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| Inverso | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
Tabella 3: Informazioni sul primer per RT-qPCR di condrociti primari di topo. Sequenze e temperatura di ricottura (60 °C) dei primer utilizzati per quantificare i trascritti di Gapdh, Col2a1 e Mmp13 nei condrociti primari di topo.
| Miscela di reazioni RT-qPCR | |
| Componente | Volume (μL) |
| 2 × SYBR Miscela Master qPCR verde | 10 |
| Modello di cDNA diluito | 8 |
| Primer diretto (10 μM) | 1 |
| Innesco inverso (10 μM) | 1 |
| Volume totale | 20 |
Tabella 4: Miscela di reazioni RT-qPCR. Miscela di reazione RT-qPCR (20 μL) con master mix, dima e primer SYBR Green.
| Protocollo di ciclo RT-qPCR | ||
| Passo | Temperatura (°C) | Ore |
| Denaturazione iniziale (×1) | 95 | 10 minuti |
| Denaturazione (×40) | 95 | 5 secondi |
| Ricottura/prolunga (×40) | 60 | 15 secondi |
| Estensione (×40) | 72 | 30 secondi |
| Curva di fusione (×1) | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
Tabella 5: Protocollo ciclico RT-qPCR. La denaturazione a 95 °C per 5 s, la ricottura/estensione a 60 °C per 15 s e un'analisi finale della curva di fusione sono state eseguite per 40 cicli.
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Risultati
Come descritto nella Figura 1, Figura 2 e Figura 3, abbiamo eseguito il protocollo e isolato con successo i condrociti primari dalle articolazioni del ginocchio di topo. Da circa 10 mg di cartilagine neonatale di topo, abbiamo ottenuto circa 1 × 104 cellule con vitalità del >90%. Il primo giorno di coltura in vitro , i condrociti primari di topo mostravano una morfologia arrotondata, con la ma...
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Discussione
L'isolamento e la coltura dei condrociti primari sono essenziali per chiarire la fisiopatologia delle malattie della cartilagine22. Nella coltura primaria dei condrociti, l'ottimizzazione della concentrazione di collagenasi e del tempo di digestione è fondamentale, in quanto bilancia la degradazione della matrice extracellulare riducendo al contempo il potenziale danno cellulare17. In questo articolo, descriviamo un metodo affidabile e riproducibile per isolare i condrociti...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82370909). Figure 1, Figure 2 e Figure 3 sono state create con Figdraw.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1&volte; PBS in polvere (2 L) | Servicebio | G0002-2L | |
| Piastre per colture cellulari da 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 μ setaccio per celle m | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| Provetta da centrifuga conica da 15 ml (sterile, senza enzimi) | Servicebio | EP-1501-J | |
| Provetta da centrifuga conica da 50 ml (sterile, senza enzimi) | Servicebio | EP-5001-J | |
| piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti | Servicebio | CCP-6H | |
| Anticorpo policlonale di coniglio anti-COL2A1 | Immunoway | YT1022 | anticorpi primari; Bilancia bianchi: 1/500 |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-GAPDH | Proteintech | 60004-1-IG | anticorpi primari; Bilanciamento del bianco: 1/2000 |
| Anticorpo policlonale di coniglio anti-MMP13 | Immunoway | YT2796 | anticorpi primari; Bilancia bianchi: 1/1000 |
| Banco asettico ultra-pulito | Thermo Fisher | 51029704 | |
| Incubatore per colture cellulari | Thermo Fisher | 51033782 | |
| Collagenasi II | Distretto di Solarbio | Visualizzazione del materiale C8150 | |
| Primer personalizzati (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biotech | Progettato utilizzando Primer BLAST | |
| DMEM/F12 medio | Clone | SH30023.01 | |
| Siero fetale bovino | Cella | FCS500 | |
| Anticorpo policlonale HRP-Goat Anti-Mouse | Immunoway | RS0001 | anticorpi secondari; Bilanciamento del bianco: 1/10000 |
| Anticorpo policlonale HRP-Goat Anti-Rabbit | Immunoway | RS0002 | anticorpi secondari; Bilancia bianchi: 1/10000 |
| Microscopio a contrasto di fase invertito | OLIMPO | CKX53 | |
| Micropipetta | Thermo Fisher | ||
| Centrifuga da banco in miniatura | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| Lama chirurgica n. 11 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina (100X) | Beyotime | Codice: C0222 | |
| Set di strumenti per la dissezione di piccoli animali | Servicebio | QXTZ01 |
Riferimenti
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