Metodo MALDI-ToF MS per la caratterizzazione di polimeri sintetici con dispersità e gruppi terminali variabili

Sommario

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate ed esempi per la preparazione del campione, l'acquisizione e l'analisi dei dati per caratterizzare polimeri sintetici con dispersità e gruppi finali variabili utilizzando la spettrometria di massa a tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Abstract

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-ToF MS) è uno strumento analitico efficace per la caratterizzazione dei polimeri sintetici, in grado di fornire una precisa determinazione del peso molecolare e approfondimenti strutturali come le masse unitarie ripetute e l'identificazione del gruppo finale. Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi per l'analisi dei polimeri, tra cui la preparazione del campione con l'appropriata selezione di matrici e cationi, l'acquisizione dei dati e un metodo di calibrazione per garantire misure di massa accurate. Evidenzia la versatilità di MALDI-ToF MS nell'analisi dei polimeri, dai materiali monodispersi a quelli altamente dispersi, osservando al contempo i limiti nella risoluzione di campioni altamente dispersi. Confrontando le masse teoriche e osservate, compresi i modelli isotopici, il metodo consente di confermare con sicurezza le unità ripetute e i gruppi terminali. Il protocollo supporta i nuovi utenti presentando dati rappresentativi sulla selezione della matrice, l'interpretazione spettrale attraverso intervalli di dispersione e la caratterizzazione di polimeri con caratteristiche isotopiche uniche o formazioni ioniche metastabili. Le strategie di risoluzione dei problemi includono la risoluzione di problemi come l'interferenza della matrice e i campioni che ionizzano senza un catione aggiunto durante la preparazione del campione. Nel complesso, questa guida funge da base per l'utilizzo di MALDI-ToF MS come tecnica rapida e affidabile per l'analisi dei polimeri.

Introduzione

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-ToF MS) è una tecnica analitica altamente efficace per la caratterizzazione di polimeri sintetici 1,2,3,4. Molti polimeri possono essere caratterizzati dalla risonanza magnetica nucleare (NMR) per confermare la struttura dell'unità di ripetizione. Tuttavia, la maggior parte dei gruppi terminali sono una frazione dei picchi unitari di ripetizione, anche per polimeri a basso peso molecolare, e all'aumentare del peso molecolare di un polimero, i segnali del gruppo terminale sembrano difficili da quantificare nell'NMR⁵. Tuttavia, i dati MALDI-ToF MS confermano che questi sono i gruppi terminali, anche a pesi molecolari più elevati. Questa tecnica di spettrometria di massa è nota per la sua capacità di ionizzazione morbida e genera principalmente ioni polimerici caricati singolarmente con una frammentazione minima². Ciò consente una determinazione precisa del peso molecolare e un'analisi strutturale dettagliata che fornisce risultati rapidi e accurati, fornendo informazioni preziose come le masse unitarie ripetute, le identificazioni dei gruppi finali e, per i polimeri a bassa dispersione, la determinazione del peso molecolare medio numerico (M_n), del peso molecolare medio ponderale (M_w) e della dispersione (Đ)⁶.

MALDI-ToF MS è in grado di analizzare polimeri con dispersità variabile, ma presenta limitazioni a dispersità più elevate. Per i polimeri monodispersi come i dendrimeri, questo metodo è ideale per confermare la loro massa e identificare i gruppi terminali⁷. Per i polimeri con bassa dispersione (1,01-1,09) e alcuni polimeri a dispersione moderata (Đ = 1,1-1,3), MALDI-ToF MS può essere utilizzato anche per determinare la massa dell'unità di ripetizione del polimero, la massa del gruppo terminale, Đ, M_n e M_w⁸. Tuttavia, per i polimeri altamente dispersi (Đ = 1,3-10), questo diventa difficile. Per i polimeri ampiamente dispersi, le frazioni più basse mostrano un'intensità molto più elevata rispetto alle loro controparti a peso molecolare più elevato, portando a una dispersione artificialmente inferiore rispetto ad altre tecniche di caratterizzazione come la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo è descritto come un "bias di massa bassa". La massa media dell'unità di ripetizione e i gruppi terminali possono essere confermati dai risultati del peso molecolare inferiore, ma è impossibile determinare i veri M_n, M_w e Đ per polimeri ad alta dispersione da MALDI-ToF MS⁹. Pertanto, SEC deve essere aggiunto come tecnica di caratterizzazione per polimeri ampiamente dispersi per determinare i veri M_n, M_w e Đ.

L'ottimizzazione della preparazione del campione è essenziale per una risoluzione di picco di alta qualità su uno spettro di massa MALDI-ToF ^2,10. Il primo passo prevede la selezione di una matrice appropriata in base alla polarità del polimero. Per i polimeri non polari, matrici come trans-2-[3-terz-butilfenil)-2-metil-2-propenilidene] (DCTB), radicale libero galvinossilico (GFR) e 9-nitroantracene (9-NA) sono comunemente usate¹¹. I polimeri polari sono più adatti a matrici come l'acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA), il ditranolo, l'acido 2-(4-idrossifenilazo)benzoico (HABA) e l'acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB)12,13,14. Per questo protocollo, DCTB è stato selezionato come matrice primaria grazie alla sua efficacia con polimeri non polari e CHCA è stato utilizzato per i polimeri polari. Anche la selezione dei cationi gioca un ruolo importante, poiché i metalli alcalini come il sodio e il potassio ionizzano efficacemente i polimeri contenenti ossigeno, mentre i metalli di transizione come l'argento sono più adatti per gli idrocarburi insaturi^10,14.

Una volta selezionati la matrice e l'analita, vengono determinati i rapporti catione:analita:matrice ottimali per le miscele di soluzioni campione. Questa miscela di soluzione campione verrà aggiunta alla piastra di destinazione in una quantità di 1 μl. La mancanza di uno o più dei rapporti corretti delle selezioni catione:analita:matrice può influire sulla sensibilità dell'acquisizione dei dati MALDI-ToF MS. Per i dati rappresentativi di seguito, la preparazione del campione è stata ottimizzata per la migliore risoluzione ^2,15.

Dopo aver preparato la soluzione campione e averla aggiunta alla piastra target MALDI-ToF MS, questo campione viene inserito nello strumento MALDI-ToF MS per iniziare l'acquisizione dei dati. Per questo studio, i dati sono stati raccolti esclusivamente in modalità ionica positiva ed è stato utilizzato un più recente spettrometro di massa MALDI-ToF, basato su un precedente lavoro di Payne et ^al.16. Importanti parametri MALDI-ToF MS, come la potenza del laser, il diametro del raggio laser, il guadagno del rivelatore e il tempo di ritardo dell'estrazione pulsata, possono essere regolati per migliorare la risoluzione durante l'acquisizione. Per l'acquisizione dei dati MALDI-ToF MS sono disponibili due modalità: lineare e reflectron¹⁷. La modalità Reflectron è preferita per ottenere una risoluzione del segnale più elevata rispetto alla modalità lineare^18,19. In modalità lineare, gli ioni accelerati viaggiano direttamente attraverso il tubo di volo fino al rivelatore. Al contrario, la modalità reflectron prevede di passare attraverso il tubo di volo una volta, e poi riflettere gli ioni attraverso il tubo di volo una seconda volta prima di raggiungere il secondo rivelatore, che raddoppia approssimativamente la loro traiettoria di volo. Questo approccio consente la differenziazione di ioni con masse simili ma velocità variabili^20,21. La potenza del laser può anche essere un fattore nell'aumentare il rapporto segnale/rumore o nel diminuire la frammentazione di un polimero²². La potenza laser più bassa possibile per l'ablazione di un campione migliorerà il rapporto segnale/rumore e ridurrà anche la possibilità di frammentazione²². Dopo aver ottimizzato la risoluzione del segnale e massimizzato il rapporto segnale/rumore, l'acquisizione può fornire dati di alta qualità per l'analita polimerico selezionato.

La calibrazione è essenziale per una misurazione accurata della massa in MALDI-ToF MS. Vengono utilizzati due metodi principali: la calibrazione interna ed esterna, entrambi basati su calibranti con masse note che coprono l'intervallo previsto dell'analita⁶. Per i polimeri analizzati nei dati rappresentativi, sono stati selezionati calibranti dendrimeri monodispersi per la calibrazione in ampi intervalli di massa²³. La taratura interna, in cui il tarante viene miscelato con il catione, l'analita e la matrice, migliora l'accuratezza della massa perché sia il tarante che l'analita sperimentano le stesse condizioni e qualsiasi spostamento di massa di taratura li influenza allo stesso modo. Tuttavia, questo metodo può portare alla sovrapposizione dei picchi con i segnali del polimero risultanti, complicando l'analisi²⁴. Al contrario, la calibrazione esterna, impiegata in questo protocollo, evita la sovrapposizione dei picchi preparando e individuando il catione:calibrante:matrice separatamente dal catione:analita:matrice sulla piastra target. Tuttavia, possono verificarsi piccole imprecisioni di massa a causa di lievi differenze nel posizionamento del campione e nella risposta locale dello strumento, come variazioni dell'intensità del laser o dell'efficienza di ionizzazione attraverso il bersaglio, in modo che il calibrante e l'analita siano vicini l'uno all'altro²⁴. Nei dati rappresentativi, la differenza di massa osservata utilizzando il metodo di calibrazione esterna era inferiore a 0,100 Da dal valore teorico.

Infine, per tutti i polimeri, i dati MALDI-ToF MS possono essere analizzati per determinare la massa unitaria ripetuta ed eseguire l'analisi del gruppo finale dei polimeri. La massa dell'unità di ripetizione può essere confermata confrontando la massa teorica dell'unità di ripetizione utilizzando strumenti software con la massa dell'unità di ripetizione osservata negli spettri di massa MALDI-ToF. Se corrispondono, è probabile che il polimero abbia la struttura dell'unità di ripetizione prevista (o un isomero). L'analisi del gruppo terminale MALDI-ToF MS per i polimeri inizia calcolando la massa teorica dell'analita. Ciò include la massa combinata dell'unità ripetuta, dei gruppi terminali e del catione selezionato dalla preparazione del campione. Nel caso di macromolecole monodisperse, il calcolo include la massa totale di un analita insieme alla massa del catione selezionato. Gli strumenti software per il disegno di strutture chimiche possono aiutare in questi calcoli. La massa teorica del software viene quindi confrontata con la massa osservata dagli spettri di massa MALDI-ToF per verificare se il polimero corrisponde alla struttura molecolare prevista. Tuttavia, se la massa unitaria di ripetizione osservata corrisponde approssimativamente al valore teorico, ma la massa totale di un n-mero specificato, inclusi i gruppi terminali e il catione, non lo fa, la discrepanza può suggerire la presenza di gruppi finali inaspettati. Per identificare i gruppi terminali sconosciuti, le condizioni di reazione vengono esaminate per determinare molecole o reagenti alternativi che potrebbero aver reagito per formare i gruppi finali osservati. Questo passaggio è fondamentale per caratterizzare accuratamente tutta la struttura del polimero.

Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo per l'analisi MALDI-ToF MS di polimeri sintetici, progettato per assistere gli utenti, in particolare i principianti, nella preparazione del campione, nell'ottimizzazione del metodo dello strumento, nell'acquisizione e nell'analisi dei dati. Dati rappresentativi illustrano la selezione della matrice per un dato polimero; spettri e analisi di polimeri con dispersità variabile, inclusi campioni monodispersi, moderatamente dispersi e altamente dispersi; l'analisi del gruppo terminale dei polimeri, che include quelli con pattern di risoluzione isotopica distinti (ad esempio, alogenati) e quelli inclini alla formazione di ioni metastabili (ad esempio, con terminazione azidica); l'analisi dei dati dei polimeri mediante MALDI-ToF MS, che include un confronto tra le masse osservate e teoriche per confermare la massa unitaria ripetuta e la massa totale del polimero, compresi i gruppi terminali e gli addotti cationici; e un esempio di risoluzione dei problemi per l'interferenza della matrice di polimeri a bassa massa e polimeri autoionizzanti.

Questo protocollo non solo fornisce una base per la caratterizzazione dei polimeri MALDI-ToF MS, ma offre anche una guida sulla preparazione del campione, sull'ottimizzazione passo-passo del metodo dello strumento (Figura 1) e sull'interpretazione degli spettri sia per i polimeri sintetici di nuova sintesi che per quelli commerciali.

Protocollo

ATTENZIONE: Consultare le schede di sicurezza (SDS) di tutte le sostanze chimiche prima dell'uso. Eseguire tutte le preparazioni dei campioni e le preparazioni delle piastre MALDI-ToF MS in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, inclusi occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e guanti.

1. Preparazione del campione

1. Preparazione della matrice, del catione, del calibrante e della soluzione madre dell'analita
   1. Preparare la soluzione madre di cationi alcalini sciogliendo 2 mg del catione desiderato in 1 mL di un solvente selezionato per la sua compatibilità con l'analita e il catione. Per il campione 1, 2 mg di trifluoroacetato di sodio sono stati disciolti in 1 mL di THF.
   2. Preparare la soluzione madre della matrice sciogliendo 20 mg della matrice desiderata in 1 mL di un solvente compatibile in base alla solubilità dell'analita. Esempio: Per i dati rappresentativi (Campione 1), sciogliere 20 mg di DCTB in 1 mL di tetraidrofurano (THF).
   3. Preparare la soluzione madre calibrante seguendo le istruzioni del fornitore.
   4. Preparare la soluzione dell'analita sciogliendo 10 mg di analita in 1 mL di un solvente adatto. Per il campione 1, 10 mg dell'analita vengono disciolti in 1 mL di THF.
2. Preparazione della piastra target MALDI-ToF MS
   1. Pulire la piastra di destinazione MALDI-ToF MS.
   2. Preparare il campione di acquisizione dell'analita e la soluzione del campione di calibrazione. Aggiungere le soluzioni stock di catione, analita e matrice in un rapporto di 1:5:20 μL nella provetta A e nel vortice. Per la calibrazione esterna: aggiungere le soluzioni madre di catione, calibrante e matrice in un rapporto di 1:5:20 μl nella provetta B e nel vortice.
   3. Aggiungere la miscela di soluzione per analita e campione calibrante alla piastra target MALDI-ToF MS. Pipettare 0,5 μl della miscela di soluzione del campione catione:analita:matrice (provetta A) sulla piastra target MALDI-ToF MS utilizzando il metodo delle goccioline essiccate. Pipettare 0,5 μl della miscela catione:calibrante:matrice (provetta B) su un punto adiacente all'analita sulla piastra target MALDI-ToF MS utilizzando il metodo delle gocce essiccate. Registra la posizione esatta di ogni punto (riga, lettera e numero di colonna) per individuare facilmente il campione e il calibratore durante l'acquisizione dei dati.

2. Acquisizione dati

1. Inserire la piastra target MALDI-ToF MS e selezionare un metodo di acquisizione
   1. Inserire la piastra target MALDI-ToF MS nello strumento. Posizionare la piastra di riferimento sul supporto con l'orientamento corretto e non spingere troppo la piastra di destinazione MALDI-ToF MS.
   2. Agganciare la piastra target MALDI-ToF MS allo strumento utilizzando il software di controllo dello strumento.
   3. Selezionare e aprire un file Method sul software di controllo dello strumento. Scegliere un metodo con riflettore positivo (RP) o positivo lineare (LP) all'interno dell'intervallo di massa dell'analita.
   4. Monitorare il software di controllo dello strumento per verificare che la piastra target sia stata inserita e che l'impostazione del metodo sia completa.
      NOTA: Questi polimeri rappresentativi hanno ossigeno; Pertanto, viene selezionata la modalità positiva (la maggior parte dei composti ha l'acquisizione completata in modalità positiva). Per i dati rappresentativi, è stato selezionato un metodo RP per la modalità riflettore su tutti i campioni.
2. Acquisizione iniziale dei dati
   1. Sul software di controllo dello strumento, individuare la telecamera che visualizza la piastra di destinazione MALDI-ToF MS e un diagramma dei pozzetti con le lettere delle colonne e i numeri di riga visualizzati. Fare clic sul pozzetto MALDI-ToF MS contenente la miscela catione:analita:matrice da selezionare per l'acquisizione dei dati.
   2. Regolare l'intervallo di rilevamento della massa sul software di controllo dello strumento su un ampio intervallo da 500 a 20000 Da per garantire che la massa prevista dell'analita sia completamente catturata. Utilizzare il cursore per regolare l'intervallo di circa 2 volte al di sotto e al di sopra della massa prevista dell'analita dopo un'acquisizione iniziale.
   3. Acquisizione dati
      1. Premere il pulsante Start sul software di controllo dello strumento per avviare l'acquisizione dei dati MALDI-ToF MS.
      2. Premere Stop o attendere il completamento automatico dell'acquisizione MALDI-ToF MS.
      3. Fare clic su Aggiungi per aggiungere il MALDI-ToF MS spettro singolo al buffer dello spettro di somma.
         NOTA: Il buffer a spettro singolo MALDI-ToF MS memorizza un singolo spettro di massa MALDI-ToF e il buffer a spettro totale accumula i dati da più acquisizioni, aumentando l'intensità del segnale.
      4. Riposizionare il laser MALDI-ToF MS visualizzando il feed della telecamera e fare clic su Anywhere all'interno dello stesso pozzetto selezionato per spostare il laser in una nuova posizione.
      5. Ripetere le acquisizioni MALDI-ToF MS per aggiungere i singoli spettri MALDI-ToF MS al buffer di somma. Ripetere i passaggi da 2.2.3.1 a 2.2.3.4 fino a quando i risultati MALDI-ToF MS non sono soddisfacenti.
      6. Valutare lo spettro di massa MALDI-ToF per la risoluzione e il rumore di base. Se lo spettro MALDI-ToF MS presenta un'alta risoluzione e un rumore di base minimo, procedere alla fase di calibrazione. In caso contrario, prendere in considerazione l'ottimizzazione del metodo di acquisizione dei dati (ad esempio, la regolazione della potenza del laser, del guadagno del rivelatore o delle impostazioni di estrazione degli ioni pulsati).
3. Ottimizzazione dell'acquisizione dati (vedi Figura 1)
   1. Regola la potenza del laser MALDI-ToF MS, il guadagno del rivelatore e l'estrazione degli ioni pulsati uno alla volta per migliorare la risoluzione e/o ridurre il rumore di fondo
   2. Per duplicare il metodo MALDI-ToF MS, copiare e incollare il metodo MALDI-ToF MS LP o RP con un nuovo nome. Aprire il file del metodo MALDI-ToF MS incollato che è stato creato e rinominare il file.
   3. Acquisire uno spettro di massa MALDI-ToF iniziale seguendo tutti i passaggi della sezione 2.2 per l'acquisizione iniziale dei dati, nella sezione di acquisizione dei dati. Ingrandisci una serie di picchi del MALDI-ToF MS con la massima intensità per valutare la risoluzione e il rumore di base sul software di controllo dello strumento.
   4. Ottimizzazione delle acquisizioni
      1. Regola la potenza del laser MALDI-ToF MS
         1. Iniziare con una bassa potenza laser MALDI-ToF MS di ~ 4% e seguire i passaggi 2.2.3.1 e 2.2.3.2 per l'acquisizione iniziale dei dati per avviare e interrompere l'acquisizione dei dati.
         2. Osservare e confrontare la risoluzione e il rumore di base del buffer singolo MALDI-ToF MS e lo spettro iniziale nel buffer di somma.
         3. Aumenta la potenza del laser MALDI-ToF MS con incrementi del 2%-10% per migliorare la ionizzazione. Seguire i passaggi 2.2.3.1 e 2.2.3.2 per avviare l'acquisizione iniziale dei dati e interrompere l'acquisizione dei dati dopo ogni incremento.
         4. Seleziona la potenza laser più bassa che fornirà picchi di alta intensità con un rumore minimo.
            NOTA: Quando la potenza del laser MALDI-ToF MS è pari o superiore al 50%, c'è una maggiore possibilità di frammentazione del campione.
      2. Ottimizza il diametro del laser MALDI-ToF MS
         1. Nella scheda del rivelatore, regolare il diametro del laser MALDI-ToF MS per testare le impostazioni medie, grandi e ultra. Seguire i passaggi 2.2.3.1 e 2.2.3.2 per l'acquisizione iniziale dei dati per avviare e interrompere l'acquisizione dei dati.
         2. Osservare e confrontare la risoluzione e il rumore di base del buffer singolo MALDI-ToF MS e lo spettro iniziale nel buffer di somma.
         3. Seleziona il diametro del laser MALDI-ToF MS che fornisce una risoluzione ottimale con un rumore di base minimo.
            NOTA: Il diametro del laser MALDI-ToF MS controlla il diametro del raggio laser.
      3. Regolare il guadagno del rivelatore MALDI-ToF MS
         1. Con piccoli incrementi, aumentare o diminuire il guadagno del rivelatore MALDI-ToF MS. Seguire i passaggi 2.2.3.1 e 2.2.3.2 per l'acquisizione iniziale dei dati per avviare e arrestare l'acquisizione dei dati per ogni aumento o diminuzione del guadagno del rivelatore MALDI-ToF MS.
         2. Osservare l'intensità e la risoluzione del segnale degli spettri di massa MALDI-ToF sul software di controllo dello strumento ad ogni regolazione del buffer singolo MALDI-ToF MS e dello spettro iniziale nel buffer di somma.
         3. Mantieni il guadagno del rivelatore MALDI-ToF MS che fornisce la migliore intensità e una buona risoluzione del segnale.
      4. Modifica l'estrazione degli ioni pulsati MALDI-ToF MS
         1. Regolare l'estrazione di ioni pulsati MALDI-ToF MS con incrementi di 10 ns. Seguire i passaggi 2.2.3.1 e 2.2.3.2 per l'acquisizione iniziale dei dati per avviare e arrestare l'acquisizione dei dati, per ogni aumento o diminuzione del guadagno del rivelatore.
         2. Valuta in che modo le modifiche all'estrazione degli ioni pulsati migliorano la risoluzione del segnale MALDI-ToF MS.
            NOTA: L'estrazione di ioni pulsati MALDI-ToF MS è definita come un ritardo tra la ionizzazione laser. Aumentando o diminuendo l'estrazione di ioni a impulsi, gli ioni di diverse energie rimarranno nel campo elettrico per tempi più o meno lunghi. Il tempo più lungo può consentire agli analiti della stessa massa e agli ioni caricati positivamente che si ablano in tempi leggermente diversi di accelerare completamente alla stessa velocità degli ioni analita della stessa massa quando viene applicata la tensione. Questo può essere utilizzato per aumentare la risoluzione e diminuire il rumore di fondo del segnale²⁵.
   5. Una volta raggiunta la risoluzione ottimale e il rapporto segnale/rumore più elevati, salvare il file del metodo MS MALDI-ToF ottimizzato per l'uso attuale e futuro.
4. Calibrazione MALDI-ToF MS
   1. Acquisire lo spettro di massa MALDI-ToF di calibrazione selezionando il campione di calibrazione sulla piastra target e seguendo tutti i passaggi della sezione 2.2 per l'acquisizione iniziale dei dati
      1. Accedi ai punti di riferimento della calibrazione. Accedere alla scheda di calibrazione nel software di controllo dello strumento. Aprire l'apposita lista di controllo della massa corrispondente al calibrante utilizzato.
   2. Abbina i picchi di calibrazione dello spettro di massa MALDI-ToF con le masse di riferimento nell'elenco di controllo di massa.
      1. Nell'elenco di controllo della massa, selezionare la massa corrispondente al primo picco di calibrazione nello spettro di massa MALDI-ToF. Lo spettro di massa MALDI-ToF ingrandirà automaticamente il picco di calibrazione selezionato.
      2. Impostare il picco di riferimento facendo clic a sinistra del segnale di calibrazione. Il picco verrà selezionato.
      3. Selezionare Applica per impostare il segnale di calibrazione come massa di riferimento nell'elenco di controllo della massa.
      4. Ripetere questa procedura per tutti i picchi di calibrazione aggiuntivi. Selezionare la massa di interesse successiva dall'elenco di controllo della massa, allineare il picco di calibrazione corrispondente e applicare l'impostazione di riferimento.
5. Acquisizione di campioni di analita polimerico calibrato
   1. Individuare e selezionare il pozzetto contenente la miscela catione:analita:matrice sul software di controllo dello strumento.
   2. Eseguire l'acquisizione dei dati seguendo tutti i passaggi della sezione 2.2 con il metodo ottimizzato e calibrato aperto.
   3. Aggiungere un nome file appropriato e salvare lo spettro di massa MALDI-ToF dell'analita calibrato per ulteriori analisi.
6. Rimuovere la piastra di destinazione MALDI-ToF MS con il software di controllo dello strumento. Pulire la piastra di destinazione MALDI-ToF MS

Figura 1: Albero decisionale per l'ottimizzazione del metodo dello strumento. Questa guida è stata progettata per aiutare gli utenti principianti a ottimizzare sistematicamente i parametri del metodo dello strumento. Iniziare con le impostazioni predefinite o iniziali e regolare un parametro alla volta aumentando o diminuendo in base ai miglioramenti osservati. Quindi, continua nella direzione che migliora (1) l'intensità del picco, (2) la qualità della linea di base (basso rumore) e (3) fornisce una risoluzione isotopica e di picco stretta. Questo approccio aiuta a identificare le condizioni ottimali per spettri affidabili e di alta qualità. Se il campione di polimero non ionizza o non produce uno spettro utilizzabile in modalità riflettore, passare alla modalità lineare e utilizzare lo stesso albero decisionale per ottimizzare i parametri. Si noti che la modalità lineare spesso si traduce in picchi più ampi e risoluzione isotopica limitata o assente, ma può essere efficace per polimeri di massa più elevata o polimeri che possono perdere ionizzazione in modalità riflettore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Analisi e interpretazione dei dati

1. Aprire il software di analisi dei dati MALDI-ToF MS e caricare lo spettro del campione dell'analita MALDI-ToF MS.
2. Selezionare il metodo di elaborazione MALDI-ToF MS corretto per i campioni di analita. Qui, tutti i campioni avevano una risoluzione isotopica e il primo picco è stato selezionato per tutti i picchi con il metodo di elaborazione MALDI-ToF MS selezionato.
   NOTA: I parametri di elaborazione MALDI-ToF MS possono essere personalizzati per campioni di polimeri sintetici. Ad esempio, un metodo di lavorazione MALDI-ToF MS per i polimeri è stato sviluppato durante una sessione di formazione tecnica dal tecnico dello strumento MALDI-ToF MS. Un metodo di elaborazione della massa media MALDI-ToF MS è stato creato da Payne et al. per applicazioni specifiche¹⁶. Contatta il team tecnico dei polimeri del produttore MALDI-ToF MS per informazioni e consigli sulla modifica del metodo di lavorazione MALDI-ToF MS.
3. Trova i picchi utilizzando il software di analisi MALDI-ToF MS.
4. Confronta la massa teorica e sperimentale del polimero
   1. Registrare la massa teorica del polimero. Disegna la struttura della macromolecola prevista, incluso il catione, in un software di disegno chimico. Aprire la finestra di analisi nel software di disegno chimico e registrare la massa teorica.
      1. Macromolecole monodisperse: Registra l'esatta massa e il peso molecolare della macromolecola selezionando insieme la struttura e il catione.
      2. Polimeri a bassa, moderata e alta dispersione: per la massa dell'unità di ripetizione, selezionare solo la spina dorsale del polimero per registrare la massa dell'unità di ripetizione. Per la massa totale di un n-mero specificato, impostare il numero dell'unità di ripetizione su una massa all'interno dell'intervallo dello spettro MALDI-ToF MS visualizzato nel software di analisi MALDI-ToF MS. Selezionare l'intera struttura del polimero, compresi i gruppi cationici e terminali, per registrare la massa di un n-mero specificato.
   2. Confrontare la massa teorica registrata con la massa osservata dallo spettro MALDI-ToF MS
      1. Per il calcolo della massa totale delle macromolecole monodisperse, seguire i passaggi descritti di seguito.
         1. Ingrandisci il picco con la massima intensità sullo spettro MALDI-ToF MS, assicurandoti che la vista includa un intervallo di massa di almeno 2 volte al di sotto e al di sopra della massa teorica.
         2. Confrontare la massa teorica con la massa osservata nello spettro di massa MALDI-ToF. Se la differenza è inferiore a 0,100 Da, la massa della macromolecola monodispersa attesa è probabilmente accurata.
         3. Esaminare lo spettro MALDI-ToF MS alla ricerca di ulteriori picchi che potrebbero indicare la presenza di strutture impreviste.
         4. Se vengono rilevate discrepanze, valutare le potenziali variazioni strutturali. Rivedere lo schema di reazione e calcolare le masse di strutture alternative per il confronto.
      2. Per ripetere il calcolo della massa unitaria di polimeri a bassa, moderata e alta dispersione, seguire i passaggi descritti di seguito.
         1. Selezionare e ingrandire due picchi separati dalla massa dell'unità di ripetizione nello spettro MALDI-ToF MS che mostrano la massima intensità.
         2. Per ogni coppia di picchi adiacenti, sottrarre la massa osservata del picco di massa superiore dal picco di massa inferiore per calcolare la massa unitaria ripetuta. Ripetere questo processo per la successiva serie di picchi per confermare la consistenza della massa dell'unità di ripetizione.
         3. Confrontare la massa dell'unità di ripetizione calcolata con la massa dell'unità di ripetizione teorica. Se i valori osservati e teorici corrispondono e mostrano differenze di massa coerenti, la massa unitaria ripetuta del polimero è probabilmente corretta.
      3. Per la massa totale di un n-mero specificato di polimeri a bassa, moderata e alta dispersione, seguire i passaggi descritti di seguito.
         1. Ingrandisci il picco sullo spettro di massa MALDI-ToF corrispondente alla massa totale teorica, così come i picchi di un'unità di ripetizione sopra e sotto.
         2. Confrontare la massa teorica con la massa osservata nello spettro di massa MALDI-ToF. Se la differenza è inferiore a 0,100 Da, è probabile che i gruppi finali previsti siano accurati.
         3. Ispezionare lo spettro di massa MALDI-ToF per ulteriori picchi che potrebbero suggerire strutture impreviste.
         4. Se vengono identificate discrepanze, valutare gruppi terminali alternativi o variazioni strutturali. Rivedere lo schema di reazione e calcolare le masse per potenziali gruppi terminali alternativi o strutture cicliche.

Risultati

Campione 1: Tris[G1](OH)₆ monodisperso
La generazione 1 di un dendrimero monodisperso costituito da un nucleo di 1,1,1-tris(idrossimetil)propano con tre acidi bis(idrossimetil)propiogenici protetti dal benzilinene alla periferia (Tris[G1]Bnz₃) è stata fatta reagire con Pd/C e H₂ gassoso in metanolo:cloroformio 1:1 per rimuovere i gruppi benzilidenici e ha portato a un dendrimero con 6 gruppi ossidrilici per formare Tris[G1](OH)₆ (Figura 2A).

Tris[G1](OH)₆ è stato analizzato utilizzando NaTFA come agente cationico con CHCA come matrice. Il CHCA è stato utilizzato perché è altamente efficace con i composti polari e interagisce con i gruppi ossidrilici di Tris[G1](OH)₆ per fornire uno strato omogeneo sulla piastra bersaglio. La preparazione del campione MALDI-ToF MS è stata avviata con la produzione di soluzioni madre di NaTFA (1 mg/mL in THF), analita (5 mg/mL in THF) e CHCA (5 mg/mL in THF). Una volta realizzate queste soluzioni, 1 μL della soluzione cationica Na⁺ , 5 μL della soluzione dell'analita e 20 μL della soluzione della matrice sono stati combinati in una provetta da microcentrifuga e vortex (rapporto di 1:25:100 catione:analita:matrice per un totale di 26 mL). Successivamente, 1 μl di questa miscela è stato rimosso dalla provetta per microcentrifuga ed essiccato sulla piastra target MALDI-ToF MS. Questo campione è stato analizzato in modalità riflettore e il picco è stato confermato nello spettro MALDI-ToF MS confrontando i valori teorici e osservati (Figura 2B, rosso).

Figura 2: (A) Schema di reazione per la modifica del campione 1 a Tris[G1](OH)₆. I gruppi benzilidenici sono stati rimossi con una reazione Pd/C e H₂ per formare Tris[G1](OH)₆. MALDI-ToF MS è stato utilizzato per determinare il completamento della reazione. (B) spettri di massa MALDI-ToF del campione 1, Tris[G1](OH)₆ e uno spettro di matrice vuota sovrapposto, che includeva la matrice e il sale ([CHCA + Na]⁺). L'intero spettro MALDI-ToF MS e lo zoom-in di Tris[G1](OH)₆ mostrano che un valore di massa osservato per [Tris[G1](OH)₆ + Na⁺]⁺ è 505,239 Da e ha una differenza di +0,013 Da dalla massa teorica di 505,226 Da. Confrontando lo spettro della matrice MS MALDI-ToF in bianco (nero) con lo spettro MS MALDI-ToF Tris[G1](OH)₆ (rosso), tutti i picchi diversi da 505,26 Da possono essere ignorati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

È stato osservato l'addotto Na⁺ per Tris[G1](OH)₆ . Il valore teorico di massa di [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ è composto dalla massa del picco monoisotopico di Tris[G1](OH)₆ (482,2362 Da) più la massa del catione sodio (22,9892 Da) che produce una massa totale di 505,226 Da. Il valore di massa osservato per [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ è 505,239 Da, che corrisponde al valore teorico con una differenza di +0,013 Da.

Per garantire la completa rimozione di tutti e tre i gruppi benzilidenici, lo spettro MALDI-ToF MS è stato ulteriormente analizzato tra 505-769 Da. Questo intervallo di massa consente il rilevamento di eventuali gruppi periferici che non sono stati rilevati. Ci sarebbe la presenza di un picco, [Tris[G1]Bnz₂(OH)₂ + Na]⁺, che indicherebbe che un benzilidene rimosso a 681,289 Da ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Da - 88,0313 Da), e a 593,257 Da picco ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Da -176,0626 Da) per [Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ + Na]⁺ che indicherebbe che due gruppi benzilidenici sono stati rimossi da Tris[G1]Bnz₃ (Figura 3). Questi picchi e Tris[G1]Bnz₃ non sono presenti; quindi, la reazione è andata a compimento e Tris[G1](OH)₆ è stato sintetizzato.

Figura 3: Strutture e masse teoriche di Tris[G1]Bnz₃, gli intermedi di Tris[G1]Bnz₂(OH)₂, Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ e il campione 1 Tris[G1](OH)_6. Il punto nero indica il prodotto. Strutture e masse teoriche di uno e due gruppi benzilidenici rimossi e Tris[G1](OH)₆ Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella regione a basso peso molecolare inferiore a 900, sono presenti picchi multipli che non si allineano con la massa monodispersa Tris[G1](OH)₆ . La maggior parte delle matrici presenta problemi di rumore minori al di sotto di 1000, quindi è incluso uno spettro MALDI-ToF MS vuoto per confermare che Tris[G1](OH)₆ è puro. Il campione bianco della matrice includeva le soluzioni stock della matrice (CHCA) e del catione (Na⁺). Per la miscela di campioni da analizzare sono state utilizzate le stesse quantità del rapporto catione/matrice di concentrazione del Tris[G1]OH₆ (1:100 mg/mL). Successivamente, 1 μl della miscela è stato aggiunto alla piastra del campione ed essiccato per l'analisi.

L'acquisizione preliminare dei dati, l'acquisizione della calibrazione e l'acquisizione dei dati sono state completate per acquisire uno spettro di matrici MS MALDI-ToF vuoto. Nella Figura 2B (nero), la matrice bianca MALDI-ToF MS (nero) e lo spettro Tris[G1](OH)₆ del campione (rosso) sono stati sovrapposti nell'analisi flessibile per confrontare e confermare quali picchi non sono associati al prodotto. Qualsiasi picco identificato nello spettro della matrice MS MALDI-ToF in bianco e nel Tris[G1](OH)₆ può essere ignorato e, pertanto, l'unico picco è 505,226 Da, che corrisponde al campione 2. Ad esempio, i picchi di 445,016 Da e 656,141 Da nello spettro Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF MS (Figura 2B in rosso) si trovano anche nello spettro della matrice MALDI-ToF MS in bianco (Figura 2B in nero) a 445,017 Da e 656,144 Da e hanno una differenza di +0,001 Da e +0,003 Da, rispettivamente. Questi picchi non saranno inclusi nell'analisi poiché corrispondono e presentano differenze simili rispetto alla matrice bianca e allo spettro MS Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF. Pertanto, la massa di Tris[G1](OH)₆ è confermata attraverso MALDI-ToF MS, ma saranno necessarie altre analisi come SEC e NMR per confermare la purezza del campione.

Campione 2: Poli(2,2-dimetilpropanoato) con un gruppo terminale di cloruro e un protone
L'acido 3-cloro-2,2-dimetilpropanoico è stato polimerizzato utilizzando carbonato di potassio come base (Figura 4A). Un campione di poli(2,2-dimetilpropanoato) (PDMP) con cloruro su un'estremità e un protone sull'altra estremità (M_n = 980 Da) è stato ionizzato con MALDI-ToF MS per determinare le architetture polimeriche formate durante la reazione e per analizzare i diversi gruppi terminali. La preparazione del campione MALDI-ToF MS è stata avviata con la preparazione di soluzioni stock di NaTFA (2 mg/mL in THF), analita (5-7 mg/mL in THF) e DCTB (20 mg/mL in THF). Una volta realizzate queste soluzioni, 5 μL della soluzione cationica Na⁺ , 5 μL della soluzione dell'analita e 10 μL della soluzione della matrice sono stati combinati in una provetta da microcentrifuga e vortex (rapporto di 10:25:200 catione:analita:matrice per un totale di 20 mL). Successivamente, 1 μl di questa miscela è stato rimosso dalla provetta per microcentrifuga ed essiccato sulla piastra target MALDI-ToF MS. Per la matrice, è stato selezionato il DCTB in quanto funziona con molti altri poliesteri, tuttavia sono state provate altre matrici come CHCA, HABA, GFR e DHB. CHCA, HABA e GFR hanno ionizzato bene il campione, tuttavia, il DHB si è rivelato infruttuoso. Lo ione NaTFA ha funzionato meglio rispetto al trifluoroacetato di potassio (KTFA), al trifluoroacetato di cesio (CsTFA), al trifluoroacetato di litio (LiTFA) e al trifluoroacetato d'argento (AgTFA) perché interagisce meglio con gli ossigeni dei gruppi estere.

Lo spettro MALDI-ToF MS (Figura 4B) ha confermato la distribuzione del peso molecolare di PDMP con un gruppo terminale di cloruro per il campione 3 nell'intervallo da 600 Da a 1600 Da. Ciò significa che il campione aveva una bassa dispersione, il che ha portato i valori di M_n,_{M w} e Đ a 980 Da, 1070 Da e 1,09, rispettivamente, utilizzando il software di analisi MALDI-Tof MS. Il picco monoisotopico è stato sufficientemente risolto in modalità riflettron, il che ha permesso l'uso dell'esatta identificazione della massa.

Figura 4: Schema di reazione e spettro di massa MALDI-ToF MS del campione 2. (A). Schema di reazione per la sintesi di PDMP utilizzando acido 3-cloro-2,2-dimetilpropanoico. (B) Spettro di massa MALDI-ToF MS del campione 2. Questo spettro completo MALDI-ToF MS mostra la distribuzione complessiva del campione di PDMP con un gruppo terminale di cloruro (M_n = 980 Da) ionizzato con Na⁺. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per confermare la massa unitaria ripetuta del polimero, è stata calcolata la differenza di massa tra due picchi adiacenti. L'unità di ripetizione del polimero ha un peso molecolare medio osservato di 100,056 Da e ciò è stato confermato prendendo la massa media di otto picchi (distribuzione principale) nell'intervallo da 600 Da a 1300 Da, che è solo +0,004 Da al di sotto dell'unità di ripetizione teorica di PDMP (100,052 Da) e, inoltre, ha una massa del gruppo finale che corrisponde a un idrogeno (sul fronte) e un cloruro (sul retro) fine).

Lo spettro MALDI-ToF MS ha rivelato tre distribuzioni distinte, ciascuna corrispondente al polimero risultante con diversi gruppi terminali. Questi gruppi terminali sono stati identificati e confermati calcolando le loro masse teoriche e confrontandole con le masse osservate nello spettro MALDI-ToF MS. Per identificare ulteriormente i gruppi terminali, è stato selezionato un singolo n-mero per l'analisi (Figura 5).

La distribuzione principale di PDMP ha mostrato che il polimero ha un idrogeno (all'estremità anteriore) e un cloruro (all'estremità posteriore; blu). Il valore teorico della massa dell'8-mer di PDMP (Figura 5) è composto dalla massa delle unità di ripetizione (100,0524 Da x 8) più la massa del gruppo terminale Cl (+ 34,9689 Da) e la massa del gruppo terminale dell'idrogeno (+ 1,0078 Da) più la massa del catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce una massa totale di 8-mer di 859,385 Da. Il valore di massa osservato per 8-mer [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ è 859,426 Da, che è solo +0,041 Da diverso dal valore teorico.

La distribuzione successiva (arancione) mostrava il polimero che sostituiva il protone sull'estremità anteriore con un sodio e un cloruro sull'estremità posteriore. Il valore teorico della massa dell'8-mer del PDMP deprotonato è composto dalla massa delle unità di ripetizione (100,0524 Da x 8) più la massa del gruppo terminale Cl (+ 34,9689 Da) e la massa di due gruppi di sodio (+ (22,9892 Da x 2)) che produce una massa totale di 881,367 Da. Il valore di massa osservato per 8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ è 881,413 Da, che è solo +0,046 Da diverso dal valore teorico.

Infine, la terza distribuzione (verde) di PDMP ha confermato la presenza di specie oligomeriche cicliche. Il valore teorico della massa dell'8-mer della PDMP ciclica è composto dalla massa delle unità di ripetizione (100,0524 Da × 8) più la massa di un gruppo sodico (+ 22,9892 Da), ottenendo una massa totale di 8-mer di 823,409 Da. Il valore di massa osservato per l'8-mer ciclico [PDMP8 + Na]+ è 823,448 Da, che è solo +0,039 Da diverso dal valore teorico.

La presenza di alogeni sul polimero può essere identificata mediante MALDI-ToF MS. Il gruppo terminale sul polimero lineare ha un Cl, che è indicato dal rapporto di circa 3:1 dei picchi [M^+] e [M+2]⁺ . La differenza tra i picchi osservati e teorici [M^+] e [M+2^]+ è stata mostrata nella Tabella 1. L'abbondanza percentuale teorica e osservata per il secondo picco a 761,3 Da [M+2]⁺ è rispettivamente del 42,3% e del 42,2% (con il primo picco del 100%), il che conferma la presenza di un gruppo Cl sul gruppo terminale polimerico. La specie ciclica è risultata essere 36 Da al di sotto del composto sodicato lineare e 58 Da al di sotto del composto disodiato. Inoltre, questo composto ciclico non aveva il rapporto 3:1 di una specie monoclorurata. Questo cloruro potrebbe essere stato rimosso tramite un attacco S_N2 con il carbossilato all'estremità opposta, portando alla chiusura dell'anello.

Figura 5: Spettro di massa MALDI-ToF MS di una ripetizione individuale del campione 2. Questo spettro MALDI-ToF MS mostra il picco maggiore come PDMP con gruppi terminali di idrogeno e cloruro (M_n = 980 Da) ionizzati con Na⁺. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Confronto tra l'abbondanza percentuale di picco osservata e teorica e l'intensità isotopica di picco di [M^+] e [M+2]⁺ picchi (con [M⁺] = 100 %) del PDMP lineare con gruppo terminale di idrogeno e cloruro (M_n = 980 Da) da MALDI-ToF MS. Il gruppo terminale sul polimero lineare ha un Cl che è indicativo dal rapporto approssimativo di 3:1 dei picchi [M^+] e [M+2]⁺ . Clicca qui per scaricare questa tabella.

Campione 3: Poli(2,2-dimetilpropanoato) con un ammonio quaternario e gruppi terminali di protoni.
L'acido 3-bromo-2,2-dimetilpropanoico è stato polimerizzato utilizzando la trietilammina (TEA) come base, tuttavia, è stato determinato che TEA stava sostituendo il Br sul gruppo terminale (Figura 6A). Un campione di PDMP con un ammonio quaternario su un lato e un protone sull'altra estremità (M_n = 1410 Da) è stato utilizzato per confrontare la distribuzione isotopica con quelli aventi un gruppo terminale Cl. La preparazione del campione MALDI-ToF MS è stata avviata realizzando soluzioni stock di KTFA (2 mg/mL in THF), analita (5-7 mg/mL in THF) e DCTB (20 mg/mL in THF). Una volta ottenute queste soluzioni, 5 μL della soluzione cationica K⁺ , 5 μL della soluzione dell'analita e 10 μL della soluzione della matrice sono stati combinati in una provetta da microcentrifuga e vortex (rapporto di 10:25:200 catione:analita:matrice per un totale di 20 mL). Successivamente, 1 μl di questa miscela è stato rimosso dalla provetta per microcentrifuga ed essiccato sulla piastra target MALDI-ToF MS. Per la matrice, è stato selezionato il DCTB in quanto funziona con molti altri poliesteri. Il catione potassio è stato aggiunto per confermare se il campione era autoionizzante.

Il polimero contiene azoto quaternario (caricato positivamente) sul gruppo terminale, che può autoionizzarsi. Ciò è stato confermato dagli spettri MALDI-ToF MS poiché il rapporto massa/carica (m/z) non è cambiato indipendentemente dal fatto che K⁺ o Na⁺ sia stato utilizzato nella preparazione del campione. Inoltre, gli spettri MALDI-ToF MS hanno confermato la presenza di ammonio quaternario caricato positivamente sul gruppo terminale, poiché Br è un buon gruppo uscente.

Gli spettri MALDI-ToF MS hanno confermato che la distribuzione del peso molecolare di PDMP con un gruppo terminale di ammonio quaternario è compresa nell'intervallo da 600 Da a 2200 Da (Figura 6B). Ciò significa che il campione aveva una bassa dispersione, il che ha portato i valori di M_n, M_w e Đ a 1410 Da, 1540 Da e 1,08, rispettivamente utilizzando il software di analisi MALDI-Tof MS.

Figura 6: Schema di reazione e spettro di massa MALDI-ToF MS del campione 3. (A) Schema di reazione per il campione 3. Schema di reazione per la sintesi di PDMP utilizzando acido 3-bromo 2,2-dimetilpropanoico con trietilammina come base. (B) Questo spettro completo MALDI-ToF MS mostra la distribuzione complessiva del PDMP lineare con un gruppo terminale di ammonio quaternario (M_n = 1410 Da). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per confermare se il polimero aveva la stessa unità di ripetizione (monomero), è stata calcolata la differenza tra due picchi adiacenti. L'unità di ripetizione del polimero ha un peso molecolare medio osservato di 100,0535 Da. Ciò è stato confermato osservando la media di dodici picchi (distribuzione principale), che vanno da 900 Da a 2300 Da, che è solo +0,0011 Da al di sopra dell'unità di ripetizione teorica (100,0524 Da).

Lo spettro MALDI-ToF MS ha mostrato due diverse distribuzioni. Una delle distribuzioni ha mostrato che il polimero ha un acido carbossilico e un ammonio quaternario caricato positivamente come gruppi terminali (nero), mentre l'altra distribuzione (viola) ha mostrato la perdita di protone dall'acido carbossilico e un'aggiunta di ione potassio. Per identificare ulteriormente i gruppi terminali, è stato selezionato un singolo n-mer per l'analisi (Figura 7).

Il valore teorico della massa del 12-mer di PDMP con gruppo terminale di ammonio quaternario è composto dalla massa delle unità di ripetizione (100,0524 x 12) più la massa del gruppo terminale di ammonio quaternario (+ 101,1199) e la massa del gruppo terminale di idrogeno (+ 1,0078) che produce una massa totale di 12-mer di 1302,757 Da. Il valore di massa osservato per 12-mer [H-PDMP_12-TEA]⁺ è 1302,730 Da, che è solo -0,027 Da al di sotto del valore teorico.

Il valore teorico della massa del 12-mer di PDMP con il gruppo terminale di ammonio quaternario su un lato e la sostituzione del protone con un altro ione potassio è composto dalla massa delle unità di ripetizione (100,0524 × 12) più la massa del gruppo terminale di ammonio quaternario (+ 101,1199) e la massa del gruppo terminale di potassio (+ 38,9637) che produce una massa totale di 12 mer di 1340,713 Da. Il valore di massa osservato per 12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ è 1340,700 Da, che è solo -0,013 Da al di sotto del valore teorico.

Figura 7: Spettro di massa MALDI-ToF MS di una ripetizione individuale del campione 3. Questo spettro MALDI-ToF MS mostra la distribuzione primaria della PDMP lineare con un gruppo finale di ammonio quaternario (M_n = 1410 Da). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campione 4: Poli(etilene brassilato) lineare
Il successivo campione di polimero caratterizzato da MALDI-ToF MS è il poli(etilene brassilato) lineare (l-PEB). Questo è stato sintetizzato dal monomero macrociclico etilene brassilato, che ha un anello di diciassette membri contenente due gruppi estere (Figura 8A). Per comprendere il gruppo funzionale e il cambiamento architettonico all'interno della struttura polimerica, sono state esplorate quattro diverse tecniche di caratterizzazione: MALDI-ToF MS, ¹H-NMR, SEC e spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR). ¹H-NMR, SEC e FTIR confermano la rimozione del diester ciclico e la formazione di α-propargil-ω-idrossi-PEB. Tuttavia, queste tecniche non hanno rilevato alcun tipo di formazione di sottoprodotti. D'altra parte, lo spettro MALDI-ToF MS (Figura 8B) di l-PEB mostra tre diverse distribuzioni di massa che indicano la formazione di tre diversi PEB: α-idrossi-ω-idrossi-PEB (1), α-propargil-ω-propargil-PEB (2) e α-propargil-ω-idrossi-PEB (3), rispettivamente (Figura 8B).

Figura 8: Spettro MALDI-TOF di l-PEB con Na⁺. (A) Strutture lineari in poli(etilene brassillato). (1) α-idrossi-ω-idrossi-PEB (2) α-propargil-ω-propargil-PEB (3) α-propargil-ω-idrossi-PEB. (B) Sono state identificate tre distribuzioni, tra cui α-idrossi-ω-idrossi-PEB (1), α-propargil-ω-propargil-PEB (2) e α-propargil-ω-idrossi-PEB (3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il campione di l-PEB è stato analizzato sul MALDI-ToF MS utilizzando DCTB come matrice per polimeri non polari. La preparazione del campione MALDI-ToF MS è stata avviata con la produzione di soluzioni stock di NaTFA (1 mg/mL in THF), analita (5 mg/mL in THF) e DCTB (20 mg/mL in THF). Una volta ottenute queste soluzioni, 1 μL della soluzione cationica Na⁺ , 5 μL della soluzione dell'analita e 20 μL della soluzione della matrice (4) sono stati combinati in una provetta per microcentrifuga e vortex (rapporto di 1:25:400 catione:analita:matrice per un totale di 26 mL). Successivamente, 1 μl di questa miscela è stato rimosso dalla provetta per microcentrifuga ed essiccato sulla piastra target MALDI-ToF MS. I MW osservati per ciascuna distribuzione erano entro una deviazione di 0,03 Da dai pesi molecolari esatti degli ioni [M + Na]⁺ .

Il valore teorico della massa per il 6-mero di α-idrossi-ω-idrossi-PEB (1) è composto dalla massa delle unità di ripetizione (270,1831 Da x 6), più la massa del gruppo terminale 2-idrossietossi (+ 61,0290 Da), più la massa del gruppo terminale idrogeno (+ 1,008 Da), più il catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce un totale di 1706,124 Da. Il valore di massa osservato per il 6-mer di α-idrossi-ω-idrossi-PEB (1) è 1706,133 Da, che era solo +0,009 Da al di sopra del valore teorico.

Il valore teorico della massa per il 5-mer di α-propargil-ω-propargil-PEB (2) è composto dalla massa delle unità di ripetizione (270,1831 Da x 5), più la massa dell'ottilato di etilene meno OCH₂CH₂O (+ 210,1620 Da), più la massa di due gruppi terminali di propargil etere (+ 55,0184 Da x 2), più il catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce un totale di 1694,103 Da. Il valore di massa osservato per il 5-mer di α-propargil-ω-propaggil-PEB (2) è 1694,127 Da, che era solo +0,024 Da al di sopra del valore teorico.

Il valore teorico della massa per il 6-mer di α-propargil-ω-idrossi-PEB (3) è composto dalla massa delle unità di ripetizione (270,1831 Da x 6), più la massa del gruppo terminale propargil etere (+ 55,0184 Da), più la massa del gruppo terminale idrogeno (+ 1,008 Da), più il catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce un totale di 1700,113 Da. Il valore di massa osservato per 6-mer di α-propargil-ω-idrossi-PEB (3) è 1700,139 Da, che era solo +0,026 al di sopra del valore teorico.

Campione 5: Poli (etilene brassillato) lineare azidificato
Inoltre, l'I-PEB (campione 6) è stato funzionalizzato con acido 6-azidoesanoico mediante esterificazione dei suoi gruppi terminali alcolici (Figura 9), producendo l-PEB azidificato (campione 7). Il prodotto ottenuto è stato analizzato anche sul MALDI-ToF MS (Figura 10) utilizzando le tecniche di preparazione del campione come polimero genitore (campione 6). I MW osservati per ciascuna distribuzione erano entro una deviazione di 0,04 Da dagli esatti pesi molecolari degli ioni [M + Na]⁺. Dopo l'esterificazione, gli ioni [M + Na]⁺ di l-PEB con due gruppi idrossilati (1) mostrano uno spostamento di massa a causa della loro conversione da (1) a α-azido-ω-azido-PEB (4). Inoltre, gli l-PEB con un gruppo idrossilato e un gruppo propagil (3) sono stati convertiti in un α-propargil-ω-azido-PEB (5). Tuttavia, (2) rimane inreagito a causa di entrambi i suoi gruppi terminali alchini.

Figura 9: Esterificazione del poli(brassilato di etilene) lineare con gruppo terminale dell'alcol tramite schema di reazione dell'acido 6-azidoesanoico. α-idrossi-ω-idrossi-PEB (1) si converte in α-azido-ω-azido-PEB (4) e α-propargil-ω-idrossi-PEB converte (3) in α-propargil-ω-azido-PEB (5). α-propargil-ω-propargil-PEB (2) rimane inreattivo a causa dei gruppi terminali alchini che non subiscono una reazione di esterificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il valore teorico della massa per il 6-mer del α-propargil-ω-azido-PEB (5) è composto dalla massa delle unità di ripetizione (270,1831 Da × 6), più la massa del gruppo terminale dell'etere propargile (+ 55,0184 Da), più la massa del gruppo terminale azidoesanoato (+ 140,0824 Da), più il catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce un totale di 1839,188 Da. Il valore di massa osservato per 6-mer di α-propargil-ω-azido-PEB (5) è 1839,184 Da, che è solo -0,004 Da al di sotto del valore teorico. Inoltre, la presenza di picchi di ioni metastabili (5-N₂) per (5) è un'altra indicazione della funzionalizzazione dell'azide, poiché gli ioni metastabili si formeranno solo se è presente un azide nella molecola.

Il valore teorico di massa per il 6-mero del picco metastabile (5-N₂ + Na⁺) è 1815,126 Da, che è stato determinato utilizzando l'equazione del grafico della differenza di massa del picco metastabile e dei picchi α-azido-ω-idrossi-PEG (Figura 11). Il valore di massa osservato per il 6-mer del picco metastabile è 1815,089 Da, che è solo -0,031 Da al di sotto del valore teorico. Il grafico indica che, all'interno dell'intervallo di massa compreso tra 1000 e 2000 Da, il valore teorico della massa del picco metastabile è inferiore di 24-24,1 Da a quello di (5).

Il valore teorico della massa per il 6-mer del α-azido-ω-azido-PEB (4) è composto dalla massa delle unità di ripetizione (270,1831 Da × 6), più la massa del gruppo terminale 6-azidoesanoato (+ 140,0824 Da), più la massa del gruppo terminale 2-ossietil-6-azidoesanoato (+ 200,1035 Da), più il catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce un totale di 1994,273 Da. Il valore di massa osservato per il 6-mer di α-azido-ω-azido-PEB (4) è 1994,296 Da, che è +0,023 Da al di sopra del valore teorico.

Figura 10: Spettro MALDI-ToF di l-PEB azidificati con Na⁺. Queste includono tre distribuzioni di α-propargil-ω-propargil-PEB (2), α-azido-ω-azido-PEB (4) e α-propargil-ω-azido-PEB (5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Illustrazione grafica della differenza di massa tra il α-azido-ω-idrossi-PEG e il suo composto metastabile rispetto alla massa di α-azido-ω-idrossi-PEG (massa media 1700 Da). Questo grafico è derivato dallo spettro MALDI-ToF di α-azido-ω-idrossi-PEG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campione 6: Un polimero a pettine ampiamente disperso
Lo schema di reazione finale è un polimero a pettine che ha unità ripetute di tioetere con catene laterali di poli(glicole etilenico)⁹. Il campione di polimero a pettine costituito da 400 M_n metil etere-PEG-propargilico e 1,6-esanditiolo (CP MeO-PEG-400 HDT; Figura 12A) è stato analizzato utilizzando NaTFA. Il sodio è stato scelto come controione perché gli eteri e i tioeteri ionizzano più facilmente con sodio, litio e potassio piuttosto che con metalli alcalino-terrosi più elevati come il cesio. Questi campioni sono stati analizzati con una matrice non polare, DCTB, sebbene siano state testate anche matrici aggiuntive (CHCA e DT) con scarsi risultati. La preparazione del campione MALDI-ToF MS è stata avviata con la produzione di soluzioni stock di NaTFA (1 mg/mL in THF), analita (5 mg/mL in THF) e DCTB (20 mg/mL in THF). Una volta realizzate queste soluzioni, 1 mL della soluzione cationica, 5 mL della soluzione dell'analita e 20 mL della soluzione della matrice sono stati combinati in una provetta da microcentrifuga e vortex (rapporto di 1:25:400 catione:analita:matrice per un totale di 26 mL). Successivamente, 1 mL di questa miscela è stato rimosso dalla provetta per microcentrifuga ed essiccato sulla piastra target MALDI-ToF MS. Poiché NaTFA è stato aggiunto al campione come controione, lo spettro di massa MALDI-ToF MS ha mostrato gli addotti Na⁺ attesi del campione noto. Inoltre, sono stati osservati aumenti di circa 16 Da, 32 Da e 48 Da al di sopra di questi picchi e saranno discussi più avanti in questo articolo.

Figura 12: Schema di reazione per il campione 6 e lo spettro di massa MALDI-ToF del campione 6 (A) Struttura chimica e condizioni di reazione di un polimero a pettine a base di ditiolo-yne con diversi distanziatori HDT e catene laterali PEG da 400 M_n . (B) Spettro di massa MALDI-ToF del campione 6, CP MeO-PEG-400 HDT. Unità di ripetizione maggiore = 550,30 Da, Unità di ripetizione minore = 44,02 Da Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MALDI-ToF MS ha confermato l'ampia distribuzione (dispersione di SEC = 2,88; Figura 12B) di CP MeO-PEG-400 HDT. Il picco monoisotopico (comprendente esclusivamente gli isotopi elementari più abbondanti, vale a dire ¹²C, ¹H, ¹⁶O e ³²S) è stato sufficientemente risolto, il che ha permesso l'uso dell'esatta identificazione di massa. Tutti i calcoli teorici della massa sono stati determinati utilizzando masse monoisotopiche per ciascun elemento. A causa dell'ampia dispersione del campione (2,88 per SEC), lo spettro di massa MALDI-ToF non può essere utilizzato per calcolare M_n, M_w o Đ. MALDI-ToF MS eccelle nella caratterizzazione di polimeri strettamente dispersi (Đ < 1.3), ma può avere difficoltà con la caratterizzazione completa di polimeri ampiamente dispersi. Quando si descrivono polimeri con ampie disperdità, solo l'estremità a basso peso molecolare dello spettro di massa sarà ben risolta e visibile con MALDI-ToF MS, escludendo qualsiasi specie a peso molecolare più elevato. Questo fenomeno è indicato come un bias di massa bassa. A causa di questo evento, la caratterizzazione completa dei polimeri a pettine attraverso il solo MALDI-ToF MS non è raggiungibile. Per questo motivo, SEC è stato utilizzato in tandem con MALDI-ToF MS per ottenere valori accurati di M_n, M_w e Đ.

Per confermare la presenza del polimero a pettine, è stato adottato un approccio simile per un polimero lineare o ciclico standard. Ogni unità di ripetizione del polimero a pettine contiene una distribuzione stretta di M_n = 400 catene laterali PEG, quindi le unità di ripetizione del polimero a pettine sono state esplorate per determinare la presenza del prodotto previsto in ciascuna. Inoltre, c'era una piccola quantità di materiale di partenza dalla polimerizzazione rimasta nella soluzione di reazione (300-700 Da) che è stata anche caratterizzata.

Nell'intero spettro MALDI-ToF MS, si possono vedere i MW più bassi e più alti per 6-15-mers del MeO-PEG-OH. Originariamente, nello spettro MALDI-ToF MS del materiale di partenza MeO-PEG-propargil, questi MeO-PEG-OH non erano visibili (Figura 13; spettro superiore). La comparsa di questi picchi è dovuta alla concentrazione relativa del MeO-PEG-propargil rispetto al MeO-PEG-OH. Man mano che la reazione del polimero a pettine procede, il MeO-PEG-propargyl viene incorporato nel prodotto. Per questo motivo, il rapporto tra il materiale di partenza dell'alchino rispetto al MeO-PEG-OH inizia a diminuire, il che mostra MeO-PEG-OH non funzionalizzato nello spettro MS MALDI-ToF (Figura 13; spettro inferiore).

Per quanto riguarda la distribuzione della massa del prodotto, per tutti i calcoli successivi sono stati utilizzati i valori di massa esatti. Il valore teorico della massa di un'unità di ripetizione del materiale di partenza [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ è 44,0262 Da. Questa massa dell'unità di ripetizione moltiplicata per il numero di unità ripetute, che sarà 10 per ogni catena laterale, (44,0262 Da x 10) più la massa del gruppo terminale α-metossi (+ 31,0183 Da) e la massa del gruppo terminale ω-propargile (+ 39,0235 Da) più la massa del catione sodio (+ 22,9892 Da) produce una massa totale di 10 mer di 533,2932 Da. Il valore di massa osservato per il PEG 10-mer + Na⁺ è 533,239 Da, che è -0,054 Da al di sotto del valore teorico (Figura 13). Negli spettri MALDI-ToF MS completi, c'è il 6-9-mer sotto e il 11-15-mer sopra per questa serie. La sequenza di picchi offset più piccoli nello spettro del basso peso molecolare corrisponde al materiale di partenza MeO-PEG-OH non funzionalizzato, dove il valore teorico della massa dell'11-mer è composto dalla massa delle unità di ripetizione (44,0262 Da x 11) più la massa del gruppo terminale α-metossi (+ 31,0184 Da) e la massa del gruppo finale ω-idrogeno (+ 1,008 Da) e la massa del catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce un totale di 11-mer massa di 539.304. Il valore di massa osservato per l'11-mer + Na⁺ è 539,252 Da, che è solo -0,052 Da al di sotto del valore teorico.

Figura 13: Spettri di massa MALDI-ToF (ingranditi da 530-615 Da) del materiale di partenza (in alto) e specie a basso peso molecolare del campione 8 (in basso), CP MeO-PEG-400 HDT. Il rapporto tra il materiale di partenza dell'alchino rispetto al MeO-PEG-OH (spettro superiore e rosso) inizia a diminuire, il che mostra MeO-PEG-OH (spettro inferiore e blu) non funzionalizzato nello spettro di massa CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (spettro inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per quanto riguarda i polimeri ciclici a pettine, le loro masse con vari gradi di polimerizzazione possono essere moltiplicate per le singole parti dell'n-mero desiderato. Il valore teorico della massa del 2-mero [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ è composto dalla massa delle unità di ripetizione di ciascuna catena PEG, di cui ce ne sono circa 8 per catena, (44,0262 Da x 16) più la massa dei gruppi terminali metilici di ciascuna catena PEG (+ 15,0235 Da x 2) più la massa dei carboni che una volta erano il gruppo propargilico e che ora hanno reagito con i tioli (+ 41,0391 Da x 2) più la massa dell'HDT che ha reagito con gli alchini (+ 148,0380 Da x 2) e la massa del catione sodio (+ 22,9892 Da) che produce una massa totale di 2 mer di 1167,599 Da. Il valore di massa osservato per il 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ è 1167,626 Da, che è +0,027 Da al di sopra del valore teorico (Figura 14). Sebbene siano state osservate strutture cicliche a basso peso molecolare, non è stato possibile osservare composti lineari con tioli su entrambe le estremità o doppi legami su entrambe le estremità.

Questi polimeri contenenti tioetere possono anche subire ossidazione, convertendo i tioeteri in solfossidi⁹. Ciò spiega l'aggiunta di più ossigeni (+ 15,9949 Da x n) a seconda del grado di ossidazione; questo differisce dall'addotto K+, che è una differenza di +15,9739 Da dall'addotto Na⁺ . Per la singola ossidazione del 2-mero [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]^+, il valore di massa teorico è 1183,594 Da, mentre il valore di massa osservato è stato di 1183,620 Da con un solo aumento di +0,026 Da rispetto al valore teorico. Per la doppia ossidazione del 2-mero [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺, il valore di massa teorico è 1199,590 Da, mentre il valore di massa osservato è stato di 1199,613 Da con un aumento di soli +0,023 Da rispetto al valore teorico. Infine, per la tripla ossidazione del 2-mero [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺, il valore di massa teorico è 1215,585 Da, mentre il valore di massa osservato è stato di 1215,617 Da con un aumento di soli +0,032 Da rispetto al valore teorico.

Figura 14: Spettro di massa MALDI-ToF del campione 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Ingrandisci da 1165 a 1254 Da mostra prodotti polimerici ciclici a pettine a 2 meri con diverse quantità di unità di ripetizione PEG attaccate e vari gradi di ossidazione del tioetere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'ossidazione può essere ulteriormente confermata eseguendo uno studio dei controioni. Ciò comporta l'utilizzo di un diverso catione ionizzante, come il K⁺, e il confronto dello spostamento dei picchi negli spettri MALDI-ToF MS. Un campione di CP MeO-PEG-400 HDT è stato eseguito sul MALDI-ToF MS utilizzando KTFA anziché NaTFA (Figura 15). Questo sposta tutte le masse dei picchi verso l'alto di +15,9739 Da a causa della differenza di massa tra Na⁺ e K⁺. Per l'analisi con l'addotto K⁺ , nessun polimero non ossidato (1183.574 Da_Theo) era presente negli spettri MALDI-ToF MS. Per la singola ossidazione del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ il valore teorico della massa è 1199,569 Da mentre il valore della massa osservata è stato di 1199,567 Da (solo -0,002 Da), per la doppia ossidazione del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ il valore teorico della massa è 1215,564 Da mentre il valore della massa osservata è stato di 1215,572 Da con una differenza (solo +0,008 Da), per la tripla ossidazione del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ il valore teorico della massa è 1231,558 Da mentre il valore della massa osservata è stato 1231,563 Da (solo +0,005 Da), e per la quadrupla ossidazione neoformata del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ il valore teorico della massa è 1247,553 Da mentre il valore della massa osservata è stato 1247,551 Da (solo -0,002 Da). Va notato che i polimeri si sono ossidati ulteriormente tra l'esecuzione degli addotti Na⁺ e K⁺ , con conseguente perdita del prodotto non ossidato e formazione della quadrupla ossidazione del CP MeO-PEG-400 HDT. Si può anche notare che, sebbene il polimero voli effettivamente con entrambi gli addotti Na⁺ e K⁺ , il rapporto segnale/rumore è significativamente più alto per gli addotti Na⁺ , accentuando l'opzione di utilizzare Na⁺ per la caratterizzazione primaria.

Figura 15: Spettro di massa MALDI-ToF del campione 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Lo zoom avanti da 1195-1254 Da mostra prodotti polimerici ciclici a pettine a 2 meri con diverse quantità di unità di ripetizione PEG attaccate e vari gradi di ossidazione del tioetere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

MALDI-ToF MS è una tecnica altamente efficace per la caratterizzazione di polimeri sintetici, che offre misure precise con frammentazione minima grazie al suo meccanismo di ionizzazione morbida. In questo metodo, la matrice assorbe energia da un laser e la trasferisce all'analita²⁶. Questa energia fa sì che il polimero vaporizzi, si ionizzi attraverso l'interazione con un agente cationizzante e si desorba nel vuoto. Gli analiti ionizzati viaggiano attraverso il tubo di volo, dove vengono rilevati in base al loro rapporto massa/carica (m/z)^26,27. Questo metodo è adatto per determinare la massa delle molecole monodisperse ed è ugualmente efficace per polimeri moderatamente dispersi (Đ = 1,1-1,3) e altamente dispersi, dove è possibile determinare la massa unitaria ripetuta e i gruppi terminali. Per polimeri moderatamente dispersi, MALDI-ToF MS fornisce anche dispersività (Ð), peso molecolare medio numerico (M_n) e peso molecolare medio ponderale (M_w).

Tuttavia, è necessario notare diversi limiti della tecnica. MALDI-ToF MS mostra una distorsione a bassa massa quando analizza polimeri con elevata dispersione (Đ > 1.3), il che significa che i polimeri di massa inferiore nella distribuzione dominano lo spettro mentre le specie di massa più elevata sono picchi di bassa intensità o assenti^28,29. Inoltre, la risoluzione diminuisce significativamente per i polimeri superiori a 10.000 Da e i polimeri superiori a 15.000 Da potrebbero essere analizzati meglio in modalità lineare. Tuttavia, la modalità lineare sacrifica la risoluzione del picco isotopico rispetto alla modalità riflettore. Inoltre, MALDI-ToF MS si basa sulla capacità del polimero di ionizzare efficacemente. I polimeri con sistemi coniugati o eteroatomi ionizzano più facilmente degli idrocarburi saturi come il polietilene o il polipropilene, che spesso richiedono modifiche chimiche per ionizzare^30,31.

La preparazione del campione è un passaggio cruciale per ottenere risultati di successo. Uno degli aspetti più importanti è la selezione della matrice appropriata per l'analita polimerico ^11,32. Ad esempio, matrici come DCTB e GFR funzionano bene per i polimeri non polari, mentre DHB e CHCA possono essere confrontati per i polimeri polari per identificare quale matrice fornisce i picchi più risolti. Inoltre, la scelta di un solvente appropriato per la dissoluzione sia della matrice che dell'analita garantisce un'adeguata co-cristallizzazione, che migliora l'ablazione laser e migliora la risoluzione negli spettri MALDI-ToF MS risultanti 33,34,35. Allo stesso modo, la scelta dell'agente cationizzante appropriato è essenziale per massimizzare l'efficienza di ionizzazione e produrre picchi chiari e distinguibili.

Una volta selezionati la matrice e l'agente cationizzante, è possibile ottimizzare il rapporto matrice:analita:cationico. Iniziare preparando le soluzioni madre del catione selezionato (1 mg/mL in THF), dell'analita (5 mg/mL in THF) e della matrice (20 mg/mL in THF). Si raccomanda un rapporto volume iniziale di 1:5:20 μL (catione:analita:matrice), corrispondente a rapporti di concentrazione di circa 1:25:400 mg/mL in un volume totale di 26 μL. Se questa miscela iniziale non produce spettri ben risolti, è possibile eseguire un'ottimizzazione sistematica utilizzando un approccio basato su griglia (Tabella 2)^10,16. In questa configurazione, il volume dell'analita è fisso, mentre il volume della matrice viene moltiplicato in modo incrementale per 4 tra le colonne e il volume del catione viene moltiplicato per 4 per le righe. Questa griglia consente agli utenti di identificare il rapporto ottimale per la ionizzazione e la risoluzione. Se una delle condizioni della griglia esterna fornisce prestazioni migliori, è possibile generare una nuova griglia centrata su quel rapporto, continuando il multiplo di 4 regolazioni per un ulteriore perfezionamento. Un buon punto di partenza è valutare se lo spettro contiene picchi ad alta intensità, basso rumore di base e risoluzione isotopica ben risolta. Questo processo può richiedere molto tempo, in particolare per polimeri nuovi o complessi che possono richiedere il test di diverse matrici e cationi in una griglia di preparazione 3 x 3.

Tabella 2: È possibile creare e testare una griglia sistematica di rapporti sperimentali. Un rapporto 1:5:20 μL di catione, analita e matrice, rispettivamente, sarà utilizzato per iniziare (1:25:400 mg/mL) catione:analita:matrice per un totale di 26 mL. Il volume dell'analita è fissato a 5 μL (25 mg/mL). La matrice e il rapporto cationico vengono moltiplicati in modo incrementale per 4 rispettivamente tra le colonne e verso l'alto nelle righe. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Dopo l'applicazione del campione sulla piastra target MALDI-ToF MS, utilizzando il metodo delle goccioline essiccate, la piastra MALDI-ToF MS viene quindi caricata nello strumento MALDI-ToF MS. I parametri di acquisizione dati MALDI-ToF MS, come la potenza del laser, il diametro del raggio laser, il guadagno del rivelatore e l'estrazione degli ioni a impulsi, possono essere regolati con precisione per ottenere una risoluzione più elevata e una separazione dei picchi più chiara. Questi possono essere modificati sistematicamente per determinare l'intensità di picco, ridurre il rumore di base e migliorare la risoluzione di picco (Figura 1).

L'ottimizzazione dei parametri strumentali e dei rapporti di preparazione dei campioni non segue un flusso di lavoro strettamente lineare. Gli operatori possono iniziare con un metodo di preparazione del campione preferito e uno screening in modalità lineare per valutare se il polimero si ionizza, oppure possono prima mettere a punto il metodo dello strumento (ad esempio, potenza laser, estrazione a impulsi) prima di modificare i rapporti di miscelazione del campione utilizzando la griglia di preparazione 3 x 3. La flessibilità nel flusso di lavoro è spesso necessaria, soprattutto quando si analizzano materiali nuovi, sconosciuti o scarsamente caratterizzati.

Una volta completata l'ottimizzazione, è possibile riutilizzare un protocollo di preparazione del campione, anche se può verificarsi una leggera variabilità tra operatori o tra giorni. L'esecuzione di una calibrazione per ogni esecuzione di acquisizione riduce al minimo la variazione e le differenze nella massa di picco rimangono in genere al di sotto di 0,1 Da quando vengono seguiti protocolli coerenti. Pertanto, la riproducibilità tra utenti e giorni è ottenibile se sia il metodo dello strumento che la preparazione del campione rimangono gli stessi. Se i problemi persistono, nella Tabella 3 viene fornita una tabella con i problemi comuni che un utente potrebbe riscontrare e le soluzioni.

Tabella 3: Problemi comuni e strategie di risoluzione dei problemi basate sull'esperienza pratica. La tabella aiuta a risolvere i problemi riscontrati durante la preparazione del campione, l'acquisizione e l'analisi dei dati. Per la risoluzione dei problemi specifici dello strumento, consultare il manuale del produttore MALDI-ToF MS o un tecnico qualificato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

La taratura è un passaggio fondamentale per garantire l'accuratezza delle misure di massa. Possono essere impiegate sia calibrazioni esterne che interne, ma è fondamentale che i calibranti utilizzati rientrino nell'intervallo di massa dell'analita polimerico. Una corretta taratura garantisce che la massa dell'analita sia determinata correttamente.

L'analisi dei dati viene eseguita dove viene aperto lo spettro di massa MALDI-ToF MS e il prelievo dei picchi può essere selezionato per ulteriori analisi. La massa delle macromolecole monodisperse, così come dei polimeri a bassa, moderata e alta dispersione di un n-mero specificato, può essere confermata confrontando la massa osservata con i valori teorici calcolati utilizzando un software di disegno chimico. Questi confronti aiutano a verificare la massa totale di una macromolecola monodispersa o, nel caso di polimeri a bassa, moderata e alta dispersione di un n-mero specificato, i gruppi terminali vengono identificati e la massa unitaria ripetuta viene confermata.

In sintesi, l'ottimizzazione della matrice, delle condizioni di cationizzazione e dei rapporti sperimentali è fondamentale per ottenere dati MS MALDI-ToF ad alta risoluzione. La taratura garantisce misurazioni di massa accurate. L'analisi dei dati mediante il peak picking e il confronto teorico della massa consente una caratterizzazione approfondita del polimero, compresa l'identificazione dei gruppi terminali e della massa unitaria ripetuta. Questa tecnica può essere utilizzata per macromolecole monodisperse, oltre a polimeri sintetici a bassa dispersione, moderatamente e altamente dispersi. Le direzioni future includono l'espansione della caratterizzazione di architetture polimeriche complesse come miscele di polimeri a film sottile, polimeri ciclici e polimeri iperramificati attraverso metodi di preparazione dei campioni privi di solventi e spettrometria di massa tandem (MS/MS)36,37,38. Le combinazioni di strumenti, come l'utilizzo della cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per frazionare un campione, seguita da MALDI-ToF MS per l'analisi strutturale, possono essere utilizzate per identificare strutture a bassa massa, determinare la dispersione frazionaria e caratterizzare i gruppi terminali in campioni di polimeri altamente dispersi 39,40,41. Inoltre, nuovi approcci di analisi dei dati, tra cui l'input manuale o la generazione assistita da software di grafici di difetti di massa Kendrick, consentono la conversione degli spettri di massa in mappe bidimensionali, facilitando l'identificazione di più gruppi terminali all'interno di un campione ^2,42.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato	Prodotti chimici TCI	D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-Tris(idrossimetil)propano	Millipore Sigma	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-Triazabiciclo[4.4.0]dec-5-ene	Millipore Sigma	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-esanditiolo 98% (HDT)	TCI	H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
acido 2-(4-idrossifenilazo)benzoico) (HABA)	Millipore Sigma	H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
Acido 2,2-bis(idrossimetil)propionico	Millipore Sigma	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-dimetossi-2-fenilacetofenone 99% (DMPA)	Sigma-Aldrich	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
Acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB)	Millipore Sigma	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(dimetilammino)piridina	Millipore Sigma	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& sort=rilevanza& term=522821 & tipo=prodotto
Acido 6-bromoesanoico	Millipore Sigma	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1 e perpage=30& sort=rilevanza& term= 6-bromohexanoic%20acid& tipo=prodotto
Benzaldeide dimetil acetale	Millipore Sigma	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
Acido benzoico	Millipore Sigma	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
Bruker UltraFlextreme	Daltonici Bruker		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
Cloroformio	Fisher Scientifico	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=true& searchTerm= cloroformio-acs-99-8-termo-scientifico & searchType=Rapido& abbinatoCatNo =AA32614M6
Ditranolo, BP, 98,5-101% (DT)	Fisher Scientifico	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
Etilene brassilato	Millipore Sigma	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= cpc& utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
Galvinoxyl, radicale libero	Millipore Sigma	G307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
Metanolo	Fisher Scientifico	A456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
Palladio, 10% su carbonio, Tipo 487, secco	Fisher Scientifico	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
Poli(etilene  glicole) etere monometilico 350  Mn  (MeO-PEG-OH 360)	Fisher Scientifico	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
Trifluoroacetato di potassio (KTFA)	Millipore Sigma	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
Alcool propargillo	Fisher Scientifico	A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
Propargyl bromuro 97% (80% p/p in toluene stabilizzato con MgO)	Fisher Scientifico	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80%%20w/w%20in%20toluene%20stabilizzato%20con%20MgO)
Aziduro di sodio	Millipore Sigma	Episodio 2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
Dispersione di idruro di sodio al 60% in olio minerale	Millipore Sigma	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
Trifluoroacetato di sodio (NaTFA)	Oakwood	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt Ricerca=1549& ExtHyperLink=1
Kit SpheriCal Neat a bassa gamma (250 - 7.500 Da)	Fabbrica di polimeri	PFS-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
Tetraidrofurano (THF)	Fisher Scientifico	T427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
trans-2-[3-(4-terz-butilfenil)-2-metil-2-propenilidene]malononitrile (DCTB)	TCI	B3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
Acido &alfa;-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA)	TCI	C1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768