Articolo metodologico

Sviluppo di un innovativo dispositivo di illuminazione basato su LED per l'applicazione in vitro della terapia fotodinamica con il Rose Bengal

DOI:

10.3791/68462

⸱

12 settembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto presenta un nuovo e innovativo dispositivo di illuminazione stampato in 3D per lo studio della terapia fotodinamica mediata dal Rose Bengala in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive un nuovo dispositivo di terapia fotodinamica (PDT) per valutare l'efficacia della PDT mediata da Rose Bengal (RB) in vitro. Il dispositivo, chiamato CELL-LED-550/3, è costituito da due parti stampate in 3D, una che genera una luce verde a 550 nm da un singolo LED (la parte della sorgente luminosa) e l'altra che distribuisce questa luce a una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (la parte del distributore di luce). La parte della sorgente luminosa è controllata da un driver con tre diverse modalità, che consentono alla parte del distributore di luce di erogare tre diversi livelli di irraggiamento sulla superficie esterna inferiore dei pozzetti: 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 o 0,62 mW/cm2. La parte del distributore di luce è stata progettata per illuminare i pozzetti singolarmente e contemporaneamente. Per dimostrare l'importanza del dispositivo CELL-LED-550/3, è stata valutata la sua capacità di indurre la morte cellulare mediante PDT mediata da RB su cellule di carcinoma epatocellulare HepG2. In primo luogo, le cellule HepG2 sono state trattate per 2 ore con concentrazioni crescenti di Rose Bengal, un fotosensibilizzante con un picco di assorbimento (il più alto) a circa 550 nm. Le cellule trattate sono state quindi illuminate con il dispositivo CELL-LED-550/3 impostato al massimo livello di irradianza a dosi luminose di 0,3 J/cm2, 0,6 J/cm2 e 1,2 J/cm2 (rispettivamente, con tempi di illuminazione di 8 min e 4 s, 16 min e 8 s e 32 min e 16 s). Infine, la vitalità è stata misurata utilizzando il Cell-Titer Glo a 24 ore dopo la PDT. I risultati sperimentali mostrano che la PDT mediata da RB utilizzando il dispositivo CELL-LED-550/3 è in grado di indurre una diminuzione della vitalità delle cellule HepG2, in modo dipendente sia dalla concentrazione di Rose Bengal che dalla dose di luce somministrata. Sulla base del proof of concept presentato in questo articolo, il dispositivo CELL-LED-550/3 aggiunge un ulteriore strumento allo studio della PDT mediata da RB.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con oltre 905.000 nuovi casi e 830.000 decessi nel 2020, il cancro primario del fegato è il settimo tumore più comune e la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo1. Tra i tumori primari del fegato, il carcinoma epatocellulare (HCC) è la forma più comune, rappresentando circa il 90% dei casi2. A causa della malattia epatica cronica non rilevata e della scarsa compliance alla sorveglianza, solo il 25% dei pazienti con HCC viene diagnosticato nella fase precoce della malattia3. Questi pazienti con diagnosi precoce sono tipicamente trattati mediante resezione epatica, trapianto di fegato o terapie ablative locali con intento curativo e dimostrano una buona prognosi con un tasso di sopravvivenza a cinque anni superiore al 70%4,5. Per l'altro 75% dei pazienti (quelli con HCC con diagnosi intermedia o tardiva), sebbene le modalità di trattamento innovative che includono terapie mirate, immunoterapie e regimi di combinazione portino benefici in termini di sopravvivenza6, la prognosi rimane molto sfavorevole: il tasso di sopravvivenza a cinque anni infatti non supera il 30% per questo gruppo di pazienti e scende al 2% per il sottogruppo di pazienti metastatici6. Esplorare opzioni terapeutiche alternative, quindi, è fondamentale per migliorare i risultati del trattamento e prolungare la sopravvivenza nei pazienti con HCC in stadio intermedio o avanzato. La terapia fotodinamica (PDT), che è una terapia antitumorale ampiamente praticata in dermatologia7, potrebbe essere un candidato alternativo adatto.

La PDT è un trattamento fotochimico che combina l'uso di un agente fotosensibilizzante (PS), una lunghezza d'onda appropriata della luce visibile e l'ossigeno molecolare per generare specie reattive citotossiche dell'ossigeno (ROS)8. Gli effetti antitumorali della PDT derivano da tre meccanismi indotti dai ROS9: in primo luogo, effetti citotossici diretti sulle cellule maligne10, poi danno alla vascolarizzazione tumorale che induce ipossia del tessuto tumorale, privazione e regressione dei nutrienti11 e infine induzione della reazione infiammatoria attraverso il rilascio di segnali di pericolo e antigeni tumorali da cellule tumorali danneggiate o morenti12. Per più di tre decenni, la PDT è stata oggetto di un'intensa indagine volta a valutare il suo potenziale nel trattamento di vari tipi e forme di cancro 13,14,15,16,17,18. Sulla base della sua efficacia dimostrata da queste indagini 19,20,21, la PDT è oggi attualmente utilizzata in dermatologia per il trattamento dei tumori cutanei non melanoma 7. Per le altre indicazioni, il numero di studi clinici è aumentato negli ultimi anni, a dimostrazione degli sforzi significativi per portare la PDT, usata da sola o in combinazione con trattamenti standard, nella pratica clinica 22,23,24.

Esiste una varietà di agenti fotosensibilizzanti utilizzati per la PDT25. Tra questi, il Rose Bengal (RB) ha dimostrato di agire come un efficiente agente fotodinamico contro le cellule tumorali della laringe26, le cellule del melanoma27, le cellule del cancro al seno28 e i tessuti del cancro alla prostata29. Il lavoro presentato in questo articolo si basa sulla necessità di valutare se la PDT mediata da RB sia efficiente anche per le cellule HCC.

Tale valutazione ha infatti richiesto lo sviluppo preliminare di un dispositivo basato su LED verdi dedicato all'illuminazione a 550 nm di piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti. Per questo dispositivo30 è stato implementato un design in due parti: una parte della sorgente luminosa genera una luce verde a 550 nm da un singolo LED, mentre una parte del distributore di luce distribuisce questa luce, attraverso l'uso di un fascio di fibre ottiche, ai 96 pozzetti singolarmente e lontano dal LED. Questo design in due parti impedisce in primo luogo alle cellule di subire effetti termici dannosi che possono verificarsi a causa del calore incontrollato generato all'interno del LED e, in secondo luogo, consente di illuminare le cellule all'interno di un incubatore per colture cellulari mantenendo la parte della sorgente luminosa con i suoi componenti elettronici (incluso il LED) all'esterno. Queste caratteristiche innovative conferiscono al cosiddetto dispositivo CELL-LED-550/3 grandi vantaggi rispetto ai sistemi basati su LED già pubblicati, progettati specificamente per l'illuminazione di piastre multipozzetto 31,32,33,34,35.

In questo articolo, il dispositivo CELL-LED-550/3 viene prima descritto in dettaglio. Quindi, come prova di concetto, uno studio di vitalità cellulare dimostra l'efficacia della PDT mediata da RB utilizzando CELL-LED-550/3 in un modello di coltura cellulare HCC 2D (HepG2)30. Oltre ad essere economico e portatile, il dispositivo CELL-LED-550/3 è quindi anche uno strumento particolarmente rilevante per gli esperimenti di PDT mediati da RB.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Costruzione del dispositivo

NOTA: Le due parti del dispositivo CELL-LED-550/3 sono prodotte separatamente e, solo come ultimo passaggio, sono collegate insieme.

  1. Costruzione della parte della sorgente luminosa
    1. Collegare un gruppo dissipatore di calore della ventola di dimensioni adeguate al lato posteriore del circuito stampato (PCB) su cui è montato il LED da 550 nm 3 W.
    2. Coprire il LED con una lente di collimazione in PMMA (polimetilmetacrilato) trasparente per omogeneizzare prima il fascio di luce e poi per ridurre l'angolo del fascio da 120° a 10°. Tale riduzione consente di aumentare la quantità di luce erogata alla parte del distributore di luce.
    3. Collegare il LED al driver di corrente con la dimmerazione tri-mode, che consente di erogare diversi livelli di irraggiamento.
    4. Costruire separatamente l'alloggiamento, la parte anteriore dell'alloggiamento e la chiusura dell'alloggiamento in stampa 3D (riquadri rossi nella Figura 1).
    5. Installare il driver e il LED dotati sia della lente che del dissipatore di calore della ventola nelle rispettive posizioni dedicate nell'alloggiamento (caselle blu nella Figura 1).
    6. Installare il jack di alimentazione e l'interruttore a bilanciere nelle rispettive posizioni nella chiusura dell'alloggiamento (caselle blu nella Figura 1).
    7. Collegare il driver e il gruppo dissipatore di calore della ventola al jack di alimentazione tramite l'interruttore a bilanciere.
    8. Assemblare l'alloggiamento, la chiusura dell'alloggiamento e la parte anteriore dell'alloggiamento.
    9. Verificare che il LED sia allineato con l'asse dell'apertura cilindrica del frontale dell'alloggiamento.
      NOTA: L'apertura cilindrica della parte anteriore della custodia è destinata al collegamento ottico della parte della sorgente luminosa (connettore femmina) con la parte del distributore di luce (connettore maschio).

figure-protocol-1
Figura 1: Viste tridimensionali anteriore (A), posteriore (B) ed esplosa (C) della parte della sorgente luminosa. Adattato da Lefebvre, A. et al.30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

  1. Costruzione della parte del distributore di luce
    1. Costruisci separatamente la chiusura inferiore dell'alloggiamento, l'alloggiamento e la chiusura superiore nella stampa 3D (insieme formano una scatola cava) (caselle rosse nella Figura 2).
    2. Costruisci il distanziatore a 96 pozzetti in stampa 3D bianca (riquadro rosso nella Figura 2) in modo che si adatti esattamente alla scatola cava menzionata in 1.2.1. Il colore bianco mira a massimizzare la riflessione della luce e quindi a ottimizzare la distribuzione della luce.
      NOTA: Il diametro e la spaziatura centrale delle aperture circolari presenti nel distanziatore a 96 pozzetti devono essere uguali al diametro e alla spaziatura centrale dei pozzetti della piastra a 96 pozzetti utilizzata per i saggi biologici.
    3. Praticare 96 piccoli fori nella chiusura superiore della scatola cava in modo che siano allineati con il centro delle 96 aperture circolari nel distanziatore a 96 pozzetti, quando quest'ultimo è posizionato sulla chiusura superiore.
    4. Inserire una fibra ottica di plastica di 0,5 mm di diametro, dal basso verso l'alto, in ciascuno dei 96 piccoli fori della chiusura superiore.
    5. Applicare la resina poliestere sul fondo della chiusura superiore per incollare le 96 fibre ottiche alla chiusura superiore.
    6. Dopo che la resina si è asciugata, lucidare le estremità distali delle fibre ottiche fino a quando non si adattano alla parte superiore della chiusura superiore.
    7. Raccogliere le fibre ottiche all'interno della scatola cava menzionata nel passaggio 1.2.1 in un unico fascio protetto da una guaina, che si estende per circa due metri fuori dalla scatola.
      NOTA: L'altezza della scatola deve essere sufficiente per evitare la flessione delle fibre ottiche e l'attenuazione ottica che potrebbe essere causata.
    8. Assemblare la scatola cava in modo che il fascio di fibre passi attraverso l'apertura dedicata dell'alloggiamento.
    9. Unire le estremità prossimali delle fibre ottiche in un connettore maschio stampato in 3D, consentendo il collegamento alla parte della sorgente luminosa (connettore femmina).
      NOTA: Questo connettore non dovrebbe richiedere la necessità di colla per evitare l'attenuazione della luce che questa colla potrebbe causare.
    10. Posizionare il distanziatore a 96 pozzetti sulla scatola cava.
    11. Creare uno schermo inserendo una carta da lucido tra una piastra in PMMA trasparente (faccia inferiore) e un foglio di mylar antigraffio (faccia superiore) per diffondere il fascio stretto erogato a ciascuna estremità distale della fibra ottica in un fascio grande quanto il diametro del pozzetto della piastra a 96 pozzetti utilizzata per i saggi biologici.
    12. Costruire il telaio dello schermo in stampa 3D (riquadro rosso nella Figura 2) in modo che la sua apertura centrale si adatti esattamente alle dimensioni della piastra da 96 pozzetti utilizzata per i saggi biologici e, quindi, i pozzetti si allineino perfettamente con le aperture circolari del distanziatore a 96 pozzetti.
    13. Fissare lo schermo alla parte superiore del distanziatore a 96 pozzetti con la cornice dello schermo.

figure-protocol-2
Figura 2: Viste tridimensionali della parte del distributore di luce. Adattato da Lefebvre, A. et al.30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

  1. Assemblaggio della parte della sorgente luminosa con la parte del distributore di luce
    1. Inserire il connettore maschio della parte del distributore di luce nel connettore femmina della parte della sorgente luminosa.
      NOTA: Una volta inserito il connettore maschio in quello femmina, il fascio di luce erogato dalla parte sorgente luminosa dovrebbe coprire un po' di più della superficie dell'elemento di ricezione della luce della parte del distributore di luce, garantendo così l'alimentazione di luce alle 96 fibre ottiche.

2. Saggi biologici

  1. Processo di coltura cellulare
    1. Coltivare la linea cellulare di epatocarcinoma HepG2 in terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di siero bovino inattivato termicamente e l'1% di streptomicina e penicillina.
    2. Conservare i palloni di coltura contenenti cellule HepG2 in un incubatore per colture cellulari con CO2 al 5% a 37 °C.
    3. Sostituire il terreno di coltura ogni 3 giorni aspirandolo dai matracci e sostituendolo con un terreno di coltura RPMI 1640 precedentemente riscaldato a 37 °C.
    4. Utilizzare un microscopio per controllare la confluenza delle cellule nei palloni di coltura fino a raggiungere l'80%-90% di confluenza.
  2. Processo di semina
    1. Rimuovere le cellule dall'incubatore e posizionarle sotto la stazione di sicurezza microbiologica pre-pulita.
    2. Rimuovere il terreno di coltura dai matracci.
    3. Lavare i palloni di coltura con una soluzione tampone fosfato.
    4. Applicare 3 mL di tripsina (0,25%, 0,53 mM) sulle cellule e posizionare i palloni di coltura nell'incubatore a 37 °C per 5 minuti per staccare le cellule.
    5. Dopo 5 minuti, recuperare la tripsina dai matracci di coltura con 7 mL di terreno di coltura e recuperare l'intera soluzione di terreno + tripsina + cellule in una provetta da 15 mL.
    6. Contare le celle utilizzando un contatore di celle. Per fare ciò, prelevare 20 μL della soluzione contenente le cellule e metterla in una provetta. Aggiungere 20 μl di soluzione di blu di tripano e posizionare la soluzione di cella + blu di tripano sul vetrino di conteggio e inserirla nel contatore di cellule.
    7. Una volta contate le cellule, diluirle in terreno di coltura per ottenere una soluzione di 150.000 cellule/mL e seminare le cellule in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo piatto chiaro a una velocità di 1,5x104 cellule/pozzetto. Il colore bianco ha lo scopo di massimizzare la riflessione e la distribuzione della luce all'interno dei pozzetti.
      NOTA: Il numero di celle per pozzetto deve essere regolato in base alla linea di celle utilizzata. Potrebbe essere necessario un test di densità preliminare per trovare il giusto numero di cellule da seminare.
    8. Preparare due piastre per ogni tempo di lettura di vitalità. Una targa sarà illuminata e l'altra rimarrà scura.
    9. Incubare le piastre per 24 ore prima del trattamento per consentire l'adesione delle cellule.
  3. Trattamento alla rosa del Bengala
    1. Preparare una soluzione madre di Rose Bengal ricostituendo la polvere di Rose Bengal in una soluzione salina al 10%. Questa soluzione deve essere preparata appena prima del trattamento cellulare per evitare qualsiasi degradazione del Rose Bengal a causa della sua stabilità.
    2. Preparare le soluzioni di Rose Bengal a concentrazioni crescenti (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) diluendo la soluzione madre di Rose Bengal precedentemente preparata nel terreno di coltura cellulare.
    3. Una volta preparate le soluzioni, rimuovere il terreno di coltura dalle piastre contenenti le cellule e aggiungere 100 μl di soluzioni per il trattamento del Rose Bengal.
    4. Incubare le cellule con il trattamento con Rose Bengal per 2 ore per consentire l'internalizzazione di Rose Bengal.
      NOTA: Il tempo di incubazione della soluzione di Rose Bengal può variare a seconda della linea cellulare utilizzata. Potrebbe essere necessario mettere a punto la cinetica dell'incorporazione del Rose Bengal mediante misurazione della fluorescenza al fine di trovare il giusto tempo di incubazione per ogni linea cellulare studiata.
    5. Dopo 2 ore, rimuovere le soluzioni di Rose Bengal, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere 100 μL/pozzetto di terreno di coltura privo di Rose Bengal.
      NOTA: Per concentrazioni più elevate di Rose Bengala potrebbero essere necessari ulteriori lavaggi con PBS. È possibile effettuare un controllo visivo per assicurarsi che le celle siano state lavate correttamente. Una volta sufficientemente risciacquato, il PBS non deve assumere un colore rosa a causa della Rosa Bengala presente all'esterno delle celle.
    6. Copri le micropiastre con un foglio di alluminio per proteggerle dall'esposizione alla luce. Illuminare metà delle piastre per il test PDT (vedere il passaggio 2.4). Le piastre non illuminate forniranno i dati di controllo per i risultati della PDT (condizione di buio). Forniranno inoltre dati sull'impatto del Rose Bengal non fotoattivato sulla vitalità cellulare. Le altre micropiastre verranno utilizzate per l'esposizione alla luce nel dispositivo (condizione PDT).
  4. Procedura operativa per il dispositivo CELL-LED-550/3
    1. Collegare il connettore maschio del distributore di luce al connettore femmina della sorgente luminosa. Quindi collegare la sorgente luminosa a una presa elettrica.
    2. Rimuovere due micropiastre (PDT + condizione Buio) dall'incubatrice, rimuovere l'alluminio per la condizione PDT e posizionare questa piastra sul distributore di luce.
    3. Impostare il dimmer del driver al massimo livello per massimizzare la potenza erogata dal LED e ottenere un irraggiamento medio di 0,62 mW/cm2 sui 96 pozzetti.
      NOTA: Il dimmer del driver deve essere impostato sul valore più appropriato per i saggi biologici (tra i tre disponibili). Qualunque sia il dimmer del driver, la bassa irradianza erogata non richiede l'uso di occhiali di sicurezza.
    4. Illuminare la piastra fino a raggiungere la dose di luce desiderata sulle celle. Per ottenere la dose di luce desiderata si possono regolare due parametri, Tempo e Irraggiamento, facendo riferimento alla seguente equazione:
      Dose di luce (J/cm2) = Irraggiamento (W/cm2) × Tempo (s) (equazione 1).
      L'irraggiamento può essere modulato regolando il dimmer del driver per ottenere rispettivamente 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 o 0,62 mW/cm2. Dall'irraggiamento scelto, l'equazione 1 può essere utilizzata per calcolare il tempo di illuminazione necessario per raggiungere la dose di luce target.
    5. Una volta raggiunta la dose di luce desiderata, spegnere il dispositivo. Sostituire la micropiastra PDT in alluminio e rimetterla nell'incubatore con la piastra di controllo fino all'esecuzione del test di vitalità.
    6. OPZIONALE: Illuminare le altre piastre se necessario, utilizzando la stessa procedura descritta sopra.
  5. Saggio di vitalità cellulare
    1. Dopo il test della PDT, lasciare la piastra illuminata nell'incubatore per 24 ore prima di misurare l'impatto della PDT sulle cellule illuminate misurandone la vitalità. Il tempo di incubazione può essere variato per studiare gli effetti più o meno a lungo termine della PDT sulle cellule. Per ogni tempo di incubazione post-PDT, una piastra non illuminata (condizione di buio) deve essere incubata per lo stesso periodo.
    2. Dopo il periodo di incubazione, prelevare una piastra illuminata e una non illuminata e aggiungere 100 μl di reagente dal kit del saggio di vitalità cellulare in ciascun pozzetto per misurare la vitalità cellulare in base al metabolismo mitocondriale e alla produzione di ATP da parte delle cellule.
    3. Incubare la multipiastra al buio per 10 minuti prima della misurazione della vitalità cellulare.
    4. Dopo 10 minuti di incubazione, leggere la luminescenza emessa in ciascun pozzetto utilizzando un lettore multimodale. La luminescenza emessa è proporzionale alla produzione di ATP da parte delle cellule viventi al momento dell'aggiunta della soluzione del saggio di vitalità cellulare.
    5. Considerare il valore di luminescenza della condizione non trattata (NT) come vitalità del 100% e normalizzare i valori di luminescenza delle condizioni trattate alla condizione NT per ottenere la percentuale di vitalità indotta da ciascun trattamento.
    6. Ripetere lo stesso protocollo di lettura della vitalità cellulare per ogni tempo di lettura post-trattamento PDT (ad esempio, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo il trattamento).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come mostrato nella Figura 3, il dispositivo CELL-LED-550/3 consente l'illuminazione omogenea, dal basso, di una piastra a 96 pozzetti con luce verde a 550 nm.

figure-results-1
Figura 3: Immagini del dispositivo CELL-LED-550/3 durante un'illuminazione illustrativa di una piastra a 96 pozzetti quando la luce della stanza è accesa (A) o spenta (B). Adattato da Lefebvre, A. et al.30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Ogni pozzetto è illuminato individualmente e lontano dal singolo LED (fino a due metri) attraverso l'uso di un fascio di fibre ottiche (Figura 4).

figure-results-2
Figura 4: Il fascio di fibre ottiche che consente l'illuminazione individuale dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti lontano dal singolo LED. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Per stabilire l'efficacia del dispositivo CELL-LED-550/3, è stata valutata la sua capacità di indurre la PDT mediata da RB sulla linea cellulare di epatocarcinoma HepG2. Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di Rose Bengal, comprese tra 0 e 100 μM per 2 ore prima dell'illuminazione. L'uso di un tale intervallo di concentrazioni mirava a determinare la dose efficace (EC50) di Rose Bengal che ucciderebbe le cellule HepG2 se esposte alla luce verde. È stato studiato anche l'impatto della dose di luce erogata dal dispositivo CELL-LED-550/3 sull'induzione della morte cellulare nelle cellule HepG2. Per fare ciò, le cellule sono state esposte alla luce per 8 minuti e 9 secondi, 16 minuti e 18 secondi o 32 minuti e 36 secondi a un'intensità di 0,62 mW/cm2 per ottenere dosi di luce rispettivamente di 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 e 1,22 J/cm2.

In primo luogo, è stato osservato che l'illuminazione da sola, in assenza di Rose Bengal (Light condition, Figura 5), non ha alcun effetto sulla vitalità delle cellule HepG2, indipendentemente dalla dose di luce ricevuta. È stato anche osservato che la rosa del Bengala da sola, in assenza di luce (condizione RB, Figura 5), non ha indotto alcun cambiamento nella vitalità cellulare per nessuna delle condizioni testate. Al contrario, i risultati mostrano che la PDT mediata da RB utilizzando CELL-LED-550/3 è in grado di uccidere le cellule HepG2. Inoltre, è stato osservato un aumento dell'efficacia in correlazione con l'aumento della dose di luce, con una concentrazione massima efficace (EC50) di 34,3 μM per una dose leggera di 0,30 J/cm2, 26,6 μM per una dose di 0,60 J/cm2 e 6,8 μM per una dose di 1,2 J/cm2.

Questi risultati hanno confermato l'efficacia di questo nuovo dispositivo PDT per la PDT mediata da RB (Figura 5).

figure-results-3
Figura 5: Efficacia del dispositivo in relazione alla vitalità della linea cellulare HepG2. Percentuale di vitalità 24 ore dopo il trattamento di HepG2. NT, non trattata; RB, solo fotosensibilizzatore (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM e 100 μM); luce, illuminazione per 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 e 1,22 J/cm2; PDT, illuminazione con trattamento RB. I risultati sono presentati come mezzi ± SEM di tre esperimenti indipendenti, espressi come percentuale del NT. È stato eseguito un test ANOVA a due vie, con p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,0001 (****) considerato statisticamente significativo e p ≥ 0,05 considerato non significativo (NS). Adattato da Lefebvre, A. et al.30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive sia il protocollo per sviluppare un dispositivo di illuminazione innovativo dedicato alla PDT mediata da RB in vitro sia il protocollo per implementare un proof of concept per il dispositivo CELL-LED-550/3, così sviluppato30.

CELL-LED-550/3 è composto da due parti, ciascuna con una funzione specifica. Lo scopo della prima parte, denominata parte della sorgente luminosa, è quello di generare, da un singolo LED, un fascio di luce verde omogeneo con un diametro superiore a quello del fascio di fibre ottiche della seconda parte. Quest'ultima, chiamata parte distributore di luce, ha lo scopo di distribuire, attraverso il fascio di fibre ottiche, la luce fornita dalla parte sorgente luminosa ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti singolarmente e lontano dal LED. A una distanza dal LED fino a 2,5 m, le celle possono essere illuminate per tutto il tempo necessario senza alcun rischio di effetti termici dannosi che possono verificarsi a causa del calore incontrollato generato all'interno del LED.

Questa caratteristica offre un primo vantaggio significativo di CELL-LED-550/3 rispetto agli altri sistemi basati su LED specificamente progettati per l'illuminazione di piastre a 96 pozzetti 31,32,33,34,35,36. Infatti, tutti gli altri sistemi prevedono un posizionamento del/i LED/i a pochi centimetri sotto le celle (di solito inferiore a 5 cm), che non è sufficiente per eliminare il rischio di effetti termici dannosi legati ai LED per le celle. Per limitare tale rischio, la maggior parte di questi altri sistemi (purtroppo alcuni non lo fanno) prevedono un sistema di raffreddamento a LED 32,34,35 a volte posizionato molto (troppo) vicino alle celle, che può poi essere controproducente dalle fluttuazioni termiche che ne derivano. Il design del dispositivo CELL-LED-550/3 in due parti offre un altro vantaggio significativo rispetto alla maggior parte degli altri sistemi basati su LED esistenti 31,32,33,35,36: ciò consente di illuminare le cellule all'interno di un incubatore per colture cellulari senza alcun rischio per il dispositivo. La parte del distributore di luce, che non include componenti elettronici, può infatti essere collocata all'interno dell'incubatrice, mentre la parte della sorgente luminosa, che include componenti elettronici sensibili agli ambienti umidi, viene mantenuta all'esterno per prevenire il rischio di corrosione o guasti. Alcuni sistemi esistenti basati su LED, inclusi componenti elettronici, consentono un'illuminazione all'interno di un'incubatrice, ma tale uso, in primo luogo, non è raccomandato dai progettisti/produttori e, in secondo luogo, richiede un'asciugatura "adeguata" dopo l'uso33,34. La capacità di illuminare le cellule all'interno di un incubatore e quindi di mantenere le cellule nelle stesse condizioni fisiologiche (temperatura, umidità e concentrazione di CO2) durante il protocollo è fondamentale per evitare potenziali distorsioni nella valutazione della vitalità cellulare dopo la PDT, soprattutto per i protocolli che richiedono lunghi tempi di illuminazione. Va inoltre sottolineato che il dispositivo CELL-LED-550/3 include un singolo LED per illuminare tutti i 96 pozzetti singolarmente e contemporaneamente. Questa caratteristica originale e innovativa non è disponibile con nessuno degli altri sistemi basati su LED sopra menzionati 31,32,33,34,35,36. La maggior parte di questi sistemi comprende 96 LED, con un LED posizionato sotto ogni pozzetto, e quindi eroga 96 fasci singoli 31,33,34,36 mentre i restanti sistemi erogano, da 6 a 25 LED posizionati a pochi centimetri dalla piastra del pozzetto, un fascio globale che copre tutti o parte dei pozzetti 31,32,35 . Sulla base della letteratura, non è mai stata proposta prima la generazione di 96 fasci individuali da un singolo LED, come fa CELL-LED-550/3 attraverso l'uso di un fascio di fibre ottiche.

La parte della sorgente luminosa include un LED da 550 nm 3 W selezionato in base a due criteri principali. In primo luogo, lo spettro di emissione del LED (e quindi la sua lunghezza d'onda centrale) dovrebbe sovrapporsi allo spettro di assorbimento del fotosensibilizzatore RB. Tale sovrapposizione, che si ottiene perfettamente con il LED selezionato (lunghezza d'onda centrale: 554,4 nm; FWHM: 106,4 nm; entrambi stimati seguendo la metodologia descritta in Lefebvre et al.30) (Figura 6), è essenziale per la foto-attivazione di RB e quindi per l'induzione di una PDT mediata da RB. In secondo luogo, la potenza ottica del LED deve essere inferiore a 5 W. Questa limitazione di potenza è imposta dalla potenza ammissibile della lente di collimazione inclusa nella parte della sorgente luminosa e da quella del fascio di fibre ottiche incluso nella parte del distributore di luce.

figure-discussion-1
Figura 6: Spettro di assorbimento del Rose Bengal in acqua. Lo spettro di assorbimento massimo normalizzato di Rose Bengal in acqua è tracciato in base all'asse sinistro e l'irradianza spettrale media di CELL-LED-550/3 è scalata in base all'asse destro. Il profilo dell'irradianza spettrale media è coerente con quello del LED disponibile sul sito web del produttore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

L'accoppiamento ottico tra le due parti del dispositivo è un fattore critico. Questo accoppiamento mira, da un lato, a raccogliere il massimo della luce emessa dal LED da 3 W in un fascio stretto e, dall'altro, a iniettare questo fascio nel fascio di fibre ottiche. Per quanto riguarda il primo obiettivo, una lente di collimazione asferica con una lunghezza focale corta, specificamente progettata per LED montati su PCB (Printed Circuit Board), consente di concentrare il fascio LED di 120 gradi in un fascio stretto di 10 gradi con distribuzione spazialmente uniforme. Il fascio risultante, inoltre, proietta immagini del chip LED quadrato, che mostrano una maggiore chiarezza e aberrazioni ottiche ridotte rispetto a quelle ottenute con il raggio iniziale. Per quanto riguarda l'iniezione di questo fascio stretto nel fascio di fibre ottiche, è necessario affrontare quattro punti importanti. In primo luogo, le estremità prossimali delle 96 fibre ottiche PMMA (polimetilmetacrilato) da 0,5 mm di diametro (apertura numerica: 0,2) sono riunite in un connettore fatto in casa in modo da formare una superficie quadrata ricettiva alla luce con lati di 5 mm (Figura 7). Una forma quadrata, in linea con le proiezioni quadrate del chip LED da parte del fascio, è stata preferita alla solita forma rotonda per il connettore in modo da limitare la perdita di luce. In secondo luogo, il connettore fatto in casa è stato progettato per non richiedere colla e stampato in 3D utilizzando una resina cristallina per limitare l'assorbimento della luce e quindi prevenire il surriscaldamento/carbonizzazione del materiale. In terzo luogo, la superficie ricettiva alla luce e la superficie finale del connettore sono state lucidate utilizzando una mola lucidante in modo che la massima luce passi attraverso di esse. In quarto e ultimo luogo, la distanza tra la lente e la superficie quadrata recettiva della luce è stata teoricamente determinata e poi regolata su un banco ottico in modo che la parte centrale più omogenea della proiezione LED quadrata si sovrapponga un po' di più rispetto alla superficie ricettiva della luce.

Con un tale accoppiamento, si ottiene una potenza di 1,25 W per il fascio stretto di 10 gradi, mentre la potenza totale trasmessa dal fascio di 96 fibre ottiche è di 0,12 W (è stato utilizzato un sensore a fotodiodo adatto per la luce LED (OPHIR)).

figure-discussion-2
Figura 7: Superficie quadrata ricettiva alla luce ottenuta raccogliendo le 96 fibre ottiche in un connettore fatto in casa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

CELL-LED-550/3 eroga un'irradianza media di 0,62 mW/cm2 (deviazione standard: 0,09 mW/cm2) (Figura 8) sulla superficie esterna inferiore dei pozzetti. Questo valore medio, che tiene conto della suddetta efficienza di accoppiamento, è stato stimato e si è dimostrato stabile nel tempo (coefficiente di variazione inferiore allo 0,6%) secondo le metodologie descritte in dettaglio in Lefebvre e al.30. Con un irraggiamento così basso (inferiore a quello fornito dagli altri sistemi basati su LED sopra discussi specificamente progettati per l'illuminazione di piastre a 96 pozzetti), è stato dimostrato che l'illuminazione da sola non ha alcun effetto sulla vitalità delle cellule HepG2, mentre è stata raggiunta un'efficienza molto elevata per la PDT mediata da RB. Per i protocolli PDT che richiedono irraggiamento più elevato per garantire l'efficienza, è possibile utilizzare più LED e quindi implementare più parti di sorgenti luminose, a condizione che la potenza luminosa iniettata in ciascuna fibra ottica non superi la potenza ammissibile di alcune decine di milliwatt.

figure-discussion-3
Figura 8: Istogramma che rappresenta la distribuzione delle irradianze erogate ai 96 pozzetti di una piastra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Sostituendo solo il LED nella parte della sorgente luminosa con un altro adatto è possibile ottenere un altro dispositivo CELL-LED. Un LED è da considerarsi idoneo se emette una potenza ottica inferiore a 5 W (per i motivi sopra citati) nel campo visibile (secondo le specifiche del fascio di fibre ottiche). Poiché esiste un numero significativo di tali LED, è stato possibile sviluppare un'ampia varietà di dispositivi CELL-LED e, quindi, molti protocolli PDT potrebbero essere valutati in vitro. Dato un protocollo PDT, il LED che fornisce la migliore sovrapposizione con lo spettro di assorbimento del fotosensibilizzatore considerato dovrebbe ovviamente essere preferito tra tutti i LED adatti. In caso di sostituzione del LED, è necessario prestare particolare attenzione al gruppo dissipatore di calore della ventola. Infatti, questo gruppo deve essere opportunamente dimensionato per evitare il surriscaldamento e il conseguente degrado sia del LED che del driver. Inoltre, sarà necessaria una nuova caratterizzazione ottica e termica per qualsiasi cambio di LED.

Sia la possibilità di fotoattivare la maggior parte dei fotosensibilizzatori mediante la semplice sostituzione di un singolo LED, sia la possibilità di illuminare le celle all'interno di un incubatore forniscono un reale valore aggiunto a questo dispositivo rispetto a quelli esistenti.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare l'Ospedale Centrale di Lille, in Francia, e l'INSERM per il loro sostegno al nostro studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
550  nm 3  W LED montato su circuito stampato OSRAMOSTAR KP CSLPM1. F1
Pallone per celle di coltura da 75 cm2Sarstedt3911002
Fascio di 100 fibre ottiche in plastica (diametro 0,5 mm)ARCENCIEL LEDin fibra05EGMEstremità a incandescenza PMMA 0,5 dia - Lng  200 metri quadrati       http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Contatore di celleThermoFisherAMQAF2000Opzionale, si può contare sotto il microfono
Incubatore per colture cellulariPHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Titolo cellulare GloPromegaG7571
Lente di collimazione in PMMA trasparenteNegozio GleccObiettivo da 14 mm 10 gradiAliexpress - Lente di collimazione DEL con supporto da 14 mm
Colorfab Ngen NeroColorfab  Codice SKU 020014Conformità FDA al contatto con gli alimenti
Colorfab Ngen BiancoColorfab  Codice SKU 020013Conformità FDA al contatto con gli alimenti
Driver di corrente con dimmerazione tri-mode (CDM Driver)CDM DriverBD392200 mA
Resina epossidica Clé opacoDiamante di cristalloCristal Diamante 150 mL
Gruppo dissipatore di calore della ventolaBOYD
Cellule HepG2ATCCHB-8065
Lettore multimodale (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
Soluzione tampone fosfatoThermoFisher20012-068
Fibre ottiche PMMA (polimetilmetacrilato) (apertura numerica: 0,2)Guangzhou Mayki Illuminazione Limitata
Jack di alimentazioneRSpro907-5680
RMPI 1640ThermoFisher21875-091
Interruttore a bilanciere RSpro419-744
Rosa BengaleThermoFisher / MerckA17053.14 / 330000-1G
Foglio di mylar antigraffioRSproCodice: 785-0802
GuainaAUPROTECTØ 8,5 mm / &Ø esterno 11 mmPP Polipropilene ne Guaina ondulata nera a prova di raggi UV non spaccata
SVFEurobioCVF SVF00-01
Carta da lucidoCanson79368730
Piastra in PMMA trasparenteRSproCodice: 284-6269
Tripan bluThermoFisher15250061
TripsinaThermoFisher25200-072
Ultimaker 2+Ultimaker
Piastra a 96 pozzetti bianca con fondo trasparenteDutscher655098

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primer. 7 (1), 1-28 (2021).
  3. Erstad, D. J., Tanabe, K. K. Hepatocellular carcinoma: Early-stage management challenges. J Hepatocell Carcinoma. 4, 81-92 (2017).
  4. Tabori, N. E., Sivananthan, G. Treatment options for early-stage hepatocellular carcinoma. Semin Intervent Radiol. 37 (5), 448-455 (2020).
  5. Tsuchiya, N., et al. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 21 (37), 10573-10583 (2015).
  6. Puisieux, M. F., et al. Therapeutic management of advanced hepatocellular carcinoma: An updated review. Cancers. 14 (10), 2357(2022).
  7. Morton, C. A., et al. European dermatology forum guidelines on topical photodynamic therapy 2019 Part 1: treatment delivery and established indications - actinic keratoses, Bowen's disease and basal cell carcinomas. Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (12), 2225-2238 (2019).
  8. Plaetzer, K., Krammer, B., Berlanda, J., Berr, F., Kiesslich, T. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: Fundamental aspects. Lasers Med Sci. 24 (2), 259-268 (2009).
  9. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: An update. CA Cancer J Clin. 61 (4), 250-281 (2011).
  10. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: Part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2 (1), 1-23 (2005).
  11. Krammer, B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 21 (6B), 4271-4277 (2001).
  12. Falk-Mahapatra, R., Gollnick, S. O. Photodynamic therapy and immunity: An Update. Photochem Photobiol. 96 (3), 550-559 (2020).
  13. Mosaddad, S. A., et al. Photodynamic therapy in oral cancer: A narrative review. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 41 (6), 248-264 (2023).
  14. Guidolin, K., et al. Photodynamic therapy for colorectal cancer: A systematic review of clinical research. Surg Innov. 29 (6), 788-803 (2022).
  15. Osuchowski, M., Bartusik-Aebisher, D., Osuchowski, F., Aebisher, D. Photodynamic therapy for prostate cancer - A narrative review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102158(2021).
  16. Gustalik, J., Aebisher, D., Bartusik-Aebisher, D. Photodynamic therapy in breast cancer treatment. J Appl Biomed. 20 (3), 98-105 (2022).
  17. Domka, W., et al. Photodynamic therapy in brain cancer: mechanisms, clinical and preclinical studies and therapeutic challenges. Front Chem. 11, 1250621(2023).
  18. Crous, A., Abrahamse, H. Photodynamic therapy of lung cancer, where are we. Front Pharmacol. 13, 932098(2022).
  19. Calzavara-Pinton, P. G., et al. Methylaminolaevulinate-based photodynamic therapy of Bowen's disease and squamous cell carcinoma. Br J Dermato. 159 (1), 137-144 (2008).
  20. Basset-Seguin, N., et al. Topical methyl aminolaevulinate photodynamic therapy versus cryotherapy for superficial basal cell carcinoma: A 5 year randomized trial. Eur J Dermatol. 18 (5), 547-553 (2008).
  21. Szeimies, R. M., et al. A clinical study comparing methyl aminolevulinate photodynamic therapy and surgery in small superficial basal cell carcinoma (8-20 mm), with a 12-month follow-up. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22 (11), 1302-1311 (2008).
  22. The IMmunotherapy Pleural 5-ALA PDT. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04400539 (2025).
  23. Blue-Light Photodynamic Therapy and Sonidegib for Multiple Basal Cell Carcinomas. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT06623201 (2025).
  24. Neoadjuvant PDT in the Treatment of Cholangiocarcinoma. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04824742 (2025).
  25. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  26. Bartusik-Aebisher, D., Ożóg, Ł, Domka, W., Aebisher, D. Rose Bengal and future directions in larynx tumor photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 97 (6), 1445-1452 (2021).
  27. Srivastav, A. K., et al. Photosensitized rose Bengal-induced phototoxicity on human melanoma cell line under natural sunlight exposure. J Photochem Photobiol. B, Biology. 156, 87-99 (2016).
  28. Uddin, M. M. N., et al. Encapsulated Rose Bengal enhances the photodynamic treatment of triple-negative breast cancer cells. Molecules (Basel, Switzerland). 29 (2), 546(2024).
  29. Osuchowski, M., et al. Photodynamic therapy-adjunctive therapy in the treatment of prostate cancer. Diagnostics (Basel, Switzerland. 12 (5), 1113(2022).
  30. Lefebvre, A., et al. Photodynamic therapy using a Rose-Bengal photosensitizer for hepatocellular carcinoma treatment: Proposition for a novel green LED-based device for in vitro investigation. Biomedicines. 12 (9), 2120(2024).
  31. Bounds, A. D., Bailey, R. D., Adams, C. T., Callaghan, D. C., Girkin, J. M. LightBox: A multi-well plate illumination system for photoactive molecule characterization. J Biophotonics. 14 (5), e202000481(2021).
  32. Zhang, K., Timilsina, S., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An open-source LED array illumination system for automated multi-well plate cell culture photodynamic therapy experiments. Sci Rep. 12 (1), 1-10 (2022).
  33. optoWELL. , opto biolabs. at https://optobiolabs.com/products/optowell/ (2025).
  34. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 31 (10), 107737(2020).
  35. Hopkins, S. L., et al. An in vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochem Photobiol Sci. 15 (5), 644-653 (2016).
  36. Hadis, M. A., et al. Development and application of LED arrays for use in phototherapy research. J Biophotonics. 10 (11), 1514-1525 (2017).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Photodynamic TherapyRose BengalLED Illumination DeviceIn Vitro PDTHepG2 CellsCell Viability Assay96 Well PlatePhotosensitizer ApplicationGreen Light IrradiationCancer Cell Treatment

Articoli correlati