Modellazione dell'infezione persistente da Pseudomonas aeruginosa nelle larve di zebrafish ferite

Sommario

Attualmente mancano modelli in vivo suscettibili di screening farmacologico contro le infezioni batteriche croniche. Qui, descriviamo un protocollo per l'infezione della ferita da parte di un isolato clinico di Pseudomonas aeruginosa per generare un'infezione persistente nelle larve di zebrafish.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa è un importante patogeno per l'uomo, in particolare nelle infezioni croniche delle ferite e nelle infezioni polmonari croniche (specialmente nei pazienti con fibrosi cistica (FC)). Le infezioni batteriche croniche sono refrattarie ai trattamenti antibiotici e vi è un urgente bisogno di modelli di infezione cronica in vivo suscettibili di screening farmacologico per sviluppare terapie efficaci. Qui, descriviamo un protocollo di infezione da parte di un isolato clinico di P. aeruginosa da un paziente con FC, che esprime costitutivamente la proteina fluorescente verde (GFP), per generare un'infezione persistente della ferita nelle larve di zebrafish. Gli embrioni danneggiati dalla pinna caudale vengono immersi in una sospensione batterica per 1,5 ore, lavati e monitorati per la carica batterica per 3 giorni. La carica batterica è stata quantificata giornalmente contando le unità fluorescenti formanti colonie (CFU) da larve infette lisate, che hanno permesso un'infezione persistente. Inoltre, i batteri persistenti di P. aeruginosa erano refrattari al trattamento antibiotico. Questo nuovo modello in vivo di infezione persistente da P. aeruginosa offre l'opportunità di valutare l'efficacia di trattamenti innovativi contro le infezioni croniche.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa è un batterio patogeno Gram-negativo responsabile della colonizzazione cronica in pazienti con fibrosi cistica (FC) e ferite ^1,2. P. aeruginosa appartiene al gruppo dei patogeni ESKAPEE ed è riconosciuto dall'Organizzazione Mondiale della Sanità come una priorità fondamentale per le nuove terapie³. Le infezioni batteriche croniche sono difficili da trattare con gli antibiotici a causa della resistenza adattativa ai farmaci, che è correlata a molteplici fattori, tra cui lo stile di vita del biofilm, la crescita ridotta, la bassa attività metabolica⁴ e il ciclo di vita intracellulare⁵. I modelli in vivo sono essenziali per comprendere e trattare meglio l'infezione cronica da P. aeruginosa.

Mentre diversi modelli in vivo sono stati utilizzati per valutare la virulenza di P. aeruginosa , pochissimi modelli hanno permesso di imitare la colonizzazione persistente e testare l'efficacia dei trattamenti sull'infezione cronica⁶. I modelli animali per studiare la patogenesi cronica di P. aeruginosa si basano principalmente sulla somministrazione dei batteri incorporati nelle perle di agar nei polmoni⁷. È stato sviluppato anche un modello di infezione cutanea cronica murina⁸. Il pesce zebra (Danio rerio), che presenta numerosi vantaggi (problemi etici moderati, basso costo, elevata produzione di uova), è un attraente modello di vertebrato in vivo per la sperimentazione di farmaci, che consente anche la visualizzazione in tempo reale ad alta risoluzione di P. aeruginosa e delle cellule ospiti grazie alla trasparenza dell'embrione⁹.

Come riportato in una revisione, in studi precedenti i ceppi di laboratorio di P. aeruginosa (PAO1, PA14 e PAK) sono stati utilizzati principalmente nel modello di infezione da zebrafish, dove hanno causato un'infezione acuta⁹. Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo di infezione della ferita basato sull'immersione di embrioni amputati con la pinna caudale con il ceppo PAO1 di P. aeruginosa , che ha causato un'infezione acuta¹⁰. L'infezione per immersione di embrioni danneggiati, che riflette una modalità di infezione naturale di P. aeruginosa, è una modalità di infezione riproducibile e più facile della microiniezione.

Il nostro obiettivo era quello di stabilire un protocollo di infezione persistente da P. aeruginosa nel pesce zebra. A questo scopo, la nostra strategia è stata quella di utilizzare ceppi clinici di P. aeruginosa, che sono stati raramente considerati nel modello di zebrafish^11,12, combinati con la via di infezione della ferita. Qui, descriviamo il protocollo che abbiamo sviluppato per modellare la colonizzazione persistente di embrioni di zebrafish sulla base di un'infezione della ferita da parte di isolati clinici di P. aeruginosa FC. Questo nuovo modello in vivo soddisfa le nostre aspettative e offre nuove opportunità per valutare l'efficacia delle terapie nel contesto della colonizzazione persistente, come descritto qui e in un articolo¹³ complementare.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sul pesce zebra descritti nel presente studio sono stati condotti presso l'Università di Montpellier seguendo i principi delle 3R (Sostituzione, Riduzione e Raffinamento) secondo le linee guida dell'Unione Europea per la manipolazione degli animali da laboratorio e sono stati approvati dalla Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault e dal Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques con il riferimento CEEA-LR-B4-172-37. Tutti gli esperimenti di infezione sono stati condotti su embrioni fino a 5 giorni dopo la fecondazione. L'allevamento di pesce zebra adulto (Danio rerio) dai pesci AB o Golden Lines ha aderito alle linee guida internazionali specificate dalla direttiva UE sulla protezione degli animali 2010/63/UE. Impianto Zebrafish dell'Università di Montpellier con condizioni standard impostate su un ciclo 12 h:12 h luce: buio, vasca in policarbonato da 3,5 L (massimo 22 pesci per vasca) collegata a un sistema di ricircolo con salinità del 4%/conducibilità 400 μS e temperatura dell'acqua di 28 °C. I pesci sono stati nutriti 2 volte al giorno con mangime per pesci.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare una soluzione di lavoro 1x per acqua di pesce con o senza blu di metilene per la crescita di embrioni di pesce zebra (vedi Tabella 1).
2. Preparare 20 volte la soluzione madre (0,4%) e 1 soluzione di tricaina anestetica funzionante come descritto nella Tabella 1. Per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti della soluzione madre, preparare 10 mL di aliquote 20x Tricaina e conservare a -20 °C.
3. Preparare una soluzione di tritoni al 2% diluita in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; Tabella 1).

2. Preparazione di inoculo di  P. aeruginosa fluorescente che esprime costitutivamente GFP

NOTA: Tutto il lavoro con P. aeruginosa viene eseguito con le precauzioni BSL-2 in una cabina di biosicurezza. I ceppi di P. aeruginosa dovrebbero essere geneticamente modificati per esprimere costitutivamente un reporter fluorescente, come la GFP (come usato qui e descritto in¹³). L'uso di ceppi con un reporter fluorescente codificato cromosomicamente è fortemente raccomandato per evitare la perdita di plasmide nel caso di un reporter fluorescente codificato da plasmidi.

1. A 2 giorni prima dell'infezione, prelevare da -80 °C uno stock di P. aeruginosa geneticamente modificato che esprime GFP su piastre di agar LB (Tabella 1) e incubare per una notte a 37 °C.
2. Controllare la fluorescenza delle colonie utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento 6x) per inoculare una colonia di GFP⁺P. aeruginosa in 1 mL di brodo LB (Tabella 1) e crescere durante la notte a 37 °C con agitazione (180 giri/min).
3. Il giorno dell'infezione, diluire la coltura notturna di P. aeruginosa di cui sopra a 1:20 in 5 ml di brodo LB fresco. Far crescere i batteri a 37 °C agitando (180 giri/min) fino a quando la coltura raggiunge un OD₆₀₀ = 0,8. Questo dovrebbe richiedere circa 2-3 ore.
4. Centrifugare la coltura batterica per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) a 3584 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 4 mL di acqua di pesce senza blu di metilene.
5. Adattare il volume di coltura con acqua di pesce per avere 7 x 10⁷ a 1 x 10⁸ CFU/mL. Ciò corrisponde a un OD₆₀₀ di circa 0,15 (da adattare per ogni ceppo).
6. Per quantificare l'inoculo, eseguire una diluizione seriale della sospensione batterica, pisolare 20 μL della diluizione ^10-4 su una piastra di agar LB e incubare per una notte a 37 °C.
7. Contare le colonie di GFP⁺ al microscopio a fluorescenza per determinare le CFU dell'inoculo.

3. Raccolta e preparazione di embrioni di zebrafish

1. A 3 giorni prima dell'esperimento di immersione batterica, allestire coppie riproduttive di pesce zebra. Metti un maschio e una femmina riproduttori in una vasca di incrocio.
2. La mattina dopo, raccogli le uova dopo la fecondazione usando un colino a maglie fini. Mettere le uova raccolte in una capsula di Petri contenente acqua di pesce con blu di metilene.
3. Per evitare contaminazioni, aggiungere 1 goccia di candeggina alla capsula di Petri. Dopo 5 minuti, cambiare l'acqua del pesce con il blu di metilene per rimuovere la candeggina.
4. Scartare gli ovuli con uno sviluppo embrionale anormale (gli ovuli non fecondati sono simili a uno stadio di uovo a 1 cellula) o quelli morti (aspetto bianco).
5. La mattina dell'infezione (a 2 dpf), dechorionate gli embrioni con due pinze molto sottili sotto lo stereomicroscopio (ingrandimento 11x). Strappare il corion usando una pinza senza pizzicare l'embrione per liberarlo.
6. Mettere gli embrioni dechorionati in una capsula di Petri contenente pesce con blu di metilene. Incubare le piastre a 28 °C fino all'infezione.

4. Lesione embrionale

1. Anestetizzare embrioni di zebrafish in acqua di pesce senza blu di metilene, contenente lo 0,02% di tricaina, circa 5 minuti prima della lesione in una piastra di coltura cellulare (35 mm x 10 mm). Gli embrioni non si muovono più e non rispondono agli stimoli.
2. Posiziona gli aghi da 25G sulla parte superiore di due bacchette per facilitare la manipolazione degli aghi.
3. Sotto uno stereomicroscopio, elimina gli embrioni con sviluppo anormale o morti. Usando un movimento circolare del piatto, raccogli tutti gli embrioni al centro.
4. Isolare gli embrioni uno per uno utilizzando due aghi in posizione verticale (testa in basso - coda in alto) e posizionare l'ago sinistro sulla coda per mantenerlo dritto. Taglia la pinna sul bordo della notocorda con l'ago destro. Fai il taglio in una volta sola. Non superare i 10 minuti tra il taglio e l'immersione nella soluzione batterica.

5. Infezione di embrioni feriti

1. Sotto la cabina di sicurezza biologica di tipo II, agitare e aggiungere la soluzione di P. aeruginosa a circa 1 x 10⁷ CFU/mL in una piastra a 6 pozzetti.
2. Raccogli gli embrioni feriti con una pipetta di vetro Pasteur usa e getta e aggiungili alla soluzione batterica sotto il perno di sicurezza microbiologica. Incubare la piastra a 28 °C per 1,5 ore.
   NOTA: Se è necessario un gran numero di larve infette, creare gruppi di circa 50 larve, fare la ferita, immergerle e ripetere per il gruppo successivo.
3. Dopo l'infezione, lavare gli embrioni sotto il perno di sicurezza microbiologica come descritto di seguito.
   1. Trasferire gli embrioni con una pipetta di vetro per un lavaggio in 10 ml di acqua di pesce senza blu di metilene, aggiungendo meno liquido possibile, per 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Trasferire nuovamente gli embrioni infetti utilizzando una pipetta di vetro per un secondo lavaggio in 4 ml di acqua di pesce senza blu di metilene per alcuni minuti.
   3. Trasferire 24 embrioni infetti singolarmente in una piastra a più pozzetti con 1 mL di acqua di pesce senza blu di metilene.
4. Mettere le piastre in una scatola di plastica nell'incubatore a 28 °C. Umidificare la scatola (con carta assorbente umida, ad esempio) per limitare l'evaporazione.

6. Sopravvivenza degli embrioni infetti

1. Per gli studi sulla sopravvivenza degli embrioni, verificare la vitalità al microscopio stereoscopico a 18 ore, 24 ore e 48 ore dopo l'infezione (hpi). Un embrione è considerato morto quando il cuore e la circolazione sanguigna si fermano.
2. Rappresentare i tassi di mortalità/sopravvivenza utilizzando le rappresentazioni grafiche delle scale Kaplan-Meier (GraphPad Prism 8.3.0) e analizzare i dati con un log-rank o altri test statistici appropriati.

7. Conteggio della carica batterica negli embrioni infetti (Figura 1)

1. Eseguire la determinazione delle CFU da embrioni infetti in quattro diversi punti temporali: 1,5 hpi, cioè subito dopo l'infezione, e dopo ogni lavaggio a 24, 48 e 72 hpi con 5 embrioni/punto temporale. Eseguire tutti i passaggi sotto il palo di sicurezza microbiologica.
2. Preparare per ogni larva infetta provette da microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 95 μL di 1x PBS. Il volume delle larve è di circa 5 μl.
3. Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti con 4 mL di acqua di pesce senza blu di metilene per eseguire un lavaggio ed eliminare i batteri planctonici.
4. Metti ogni embrione in una provetta da microcentrifuga contenente PBS, aggiungendo meno liquido possibile. Basta toccare la pipetta di vetro contenente le larve sulla superficie del PBS per permettere alle larve di affondare nella provetta della microcentrifuga senza aggiungere liquido.
5. Schiacciare gli embrioni singolarmente usando un pestello sul lato della provetta della microcentrifuga. Tenere il pestello all'interno del tubo. Determinare il punto finale quando non è rimasto alcun embrione intatto.
6. Sollevare il pestello e aggiungere 100 μL di PBS-Triton 2% per sciacquare eventuali batteri residui dal pestello (la concentrazione finale è dell'1%). Vortice e attendi 10 min. Non elaborare più di cinque embrioni contemporaneamente.
7. Versare 3 volte 10 μl di lisati non diluiti su piastre di agar LB per ogni embrione. Eseguire una diluizione seriale dei lisati in una piastra a 96 pozzetti fino a raggiungere una diluizione di ^10-3 utilizzando una pipetta multicanale. Versare 3 μl di diluizione ^10-1, ^10-2 e ^10-3 accanto a quelle non diluite su piastre di agar LB e incubare le piastre per una notte a 37 °C.
8. Contare le colonie fluorescenti di ogni diluizione al microscopio e calcolare le CFU per embrione infetto.

Figura 1: Cronologia sperimentale per valutare la virulenza e la persistenza batterica nell'embrione di zebrafish. Abbreviazioni: CFU = Unità formanti colonie, hpi = ore dopo l'infezione. Il disegno è stato creato con BioRender.com. La cifra è stata modificata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Test del trattamento contro l'infezione persistente (Figura 2)

1. Preparare soluzioni antibiotiche a 40 volte la concentrazione inibitoria minima (MIC) per il ceppo di P. aeruginosa . Prima dell'esperimento, verificare che la concentrazione di antibiotico scelta non sia tossica per l'embrione.
2. Seguire i passaggi 7.1 e 7.2. Mettere 1 mL di acqua di pesce con antibiotici in una piastra a 24 pozzetti ed eseguire un controllo senza antibiotici.
3. Trasferire cinque embrioni dalla fase di lavaggio per trattamento nella piastra a 24 pozzetti, aggiungendo meno liquido possibile.
4. Incubare con gli antibiotici per 30 minuti a temperatura ambiente. Tornare al passaggio 7.3. per quantificare la carica batterica dopo il trattamento.

Figura 2: Procedura sperimentale utilizzata per valutare l'efficacia dei trattamenti antibiotici su embrioni infetti. Abbreviazioni: ATB 30' = trattamento antibiotico per 30 min, CFU = Unità formanti colonie, hpi = ore dopo l'infezione. Il disegno è stato creato con BioRender.com. La cifra è stata modificata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

L'embrione di pesce zebra è un modello appropriato per monitorare un'infezione persistente da isolati di P. aeruginosa FC
Abbiamo utilizzato la modalità di immersione di embrioni danneggiati per valutare in vivo la virulenza di tre isolati di FC (A6520, B6513 e C6490)⁹. Abbiamo anche valutato il comportamento di un isolato di FC tardiva ben caratterizzato, RP73, noto per la colonizzazione a lungo termine nelle vie aeree del t...

Discussione

La modellazione dell'infezione batterica cronica in vivo è essenziale per comprendere la patogenesi e valutare l'efficacia del trattamento. Qui, abbiamo stabilito un modello di infezione persistente della ferita nel pesce zebra adatto per testare farmaci contro P. aeruginosa. Ciò colma la lacuna della metodologia attuale con la mancanza di modelli in vivo suscettibili di screening farmacologico contro le infezioni batteriche croniche. In particolare, questo mod...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etil-3-amminobenzoato metanosolfonato	Sigma	E50521
Pellet a pistone	Eppendorf, Dutscher	33522
sali marini	Oceano istantaneo, sistemi di acquari	218035
Tritone	Euromedex	2000-B