Articolo metodologico

Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

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DOI:

10.3791/68466

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11 luglio 2025

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1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

In questo articolo

Sommario

Lo sviluppo sessuale del Plasmodium avviene nell'intestino medio della zanzara. Prendere di mira le fasi sessuali del parassita è una strategia promettente per bloccare la trasmissione. Abbiamo sviluppato Ookluc, un P. berghei transgenico che esprime nanoluciferasi dopo la formazione dello zigote, consentendo lo screening ad alto rendimento di composti che bloccano la trasmissione. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi per lo screening utilizzando Ookluc.

Abstract

La malaria rimane una sfida sanitaria mondiale; Nel 2023 sono stati segnalati 263 milioni di casi e 597.000 decessi in tutto il mondo. Il ciclo di vita del parassita è complesso e sono necessari interventi mirati nelle fasi critiche dello sviluppo per controllare efficacemente la malattia. Le strategie di blocco della trasmissione (TB) mirano a interrompere la trasmissione del Plasmodium prendendo di mira il vettore della zanzara o gli stadi sessuali del parassita attraverso vaccini e farmaci. Gli interventi sulla tubercolosi possono concentrarsi sui gametociti nell'ospite umano o su altre forme nell'intestino medio della zanzara, come gameti, zigoti, oocineti e oocisti.

Lo sviluppo di nuovi approcci alla tubercolosi si trova di fronte a sfide significative. Lo studio degli stadi sessuali del parassita è intrinsecamente difficile e lo screening ad alto rendimento (HTS) per i composti gametocitocidi si basa principalmente su colture di P. falciparum . Tuttavia, i solidi strumenti in vitro per valutare gli interventi contro le fasi sessuali successive rimangono limitati. Per accelerare la scoperta di composti tubercolari, il nostro gruppo ha sviluppato un nuovo test HTS per l'attivazione e la fecondazione dei gametociti utilizzando P. berghei, un modello murino di infezione da Plasmodium . Il parassita transgenico, Ookluc, esprime nanoluciferasi esclusivamente dopo la formazione dello zigote, con picco di luminescenza durante lo sviluppo dell'oocineta. Questo saggio basato sulla luminescenza fornisce una lettura quantitativa della differenziazione tra gameti e zigoti e tra zigote e ookineti, dove l'aumento della luminescenza è direttamente correlato alla formazione di ookinet. Questo articolo video presenta i metodi per lo screening dei composti della tubercolosi della malaria utilizzando Ookluc.

Introduzione

La malaria è una malattia antica che ha profondamente plasmato la storia dell'umanità. Solo nel 2023 sono stati segnalati 263 milioni di casi in 85 paesi endemici, con 597.000 decessi1. La malattia è causata da protozoi parassiti del genere Plasmodium, appartenenti al phylum Apicomplexa. Tra le cinque specie che infettano gli esseri umani - P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale e P. malariae - P. falciparum e P. vivax rappresentano la maggior parte dei casi. P. falciparum è associato a malaria grave ed è predominante in Africa, mentre P. vivax ha la più ampia distribuzione geografica, essendo più diffuso in Sud Americae in Asia.

La complessità del ciclo di vita del Plasmodium , che coinvolge più fasi di sviluppo in due ospiti, ne facilita la trasmissione e la persistenza nelle regioni endemiche3. Un passaggio critico in questo ciclo è la transizione dall'uomo alla zanzara vettrice, che la rende un obiettivo chiave per l'intervento. La trasmissione inizia all'interno dell'ospite umano, dove si sviluppano gli stadi sessuali del Plasmodium quando i merozoiti si differenziano in gametociti maschili e femminili. Dopo l'ingestione da parte di una zanzara, i segnali ambientali innescano l'attivazione dei gametociti e la formazione di gameti, portando alla fecondazione nel lume dell'intestino medio. Lo zigote risultante si differenzia in un oocinete mobile, che invade attivamente l'epitelio dell'intestino medio e si sviluppa in un'oocisti all'interno della lamina basale. All'interno dell'oocisti vengono generati migliaia di sporozoiti che vengono successivamente rilasciati nell'emolinfa, permettendo loro di migrare verso le ghiandole salivari. Lì, gli sporozoiti invadono le cellule acinose e si spostano nel lume della ghiandola, dove rimangono fino a quando la zanzara non prende il suo prossimo pasto di sangue, trasmettendo il parassita alla pelle umana4.

La ricerca di nuove strategie di blocco della trasmissione (TB) è fondamentale, dati i limiti dei farmaci disponibili e la crescente resistenza agli antimalarici5. I metodi di screening tradizionali, come le infezioni da zanzare, l'analisi microscopica manuale o l'incorporazione di ipossiantina radioattiva, sono laboriosi, difficili da standardizzare e inadatti per applicazioni ad alto rendimento 6,7. Approcci più recenti che utilizzano il rilevamento basato sulla fluorescenza (ad esempio, la colorazione del DNA o i reporter GFP) hanno migliorato l'efficienza, ma rimangono sfide significative nella valutazione dei composti che prendono di mira gli stadi sessuali del parassita 6,7,8.

Per affrontare queste sfide, è stata sviluppata una linea transgenica di P. berghei che esprime nanoluciferasi (nLuc), denominata Ookluc 8. In questo sistema, il gene nLuc è posto sotto il controllo del promotore della proteina correlata a Circumsporozoite e TRAP (CTRP) specifico per l'oocinete, che viene attivato negli zigoti, portando alla produzione di nLuc che inizia circa 6 ore dopo l'attivazione dei gameti e raggiunge il picco 24 ore dopo il saggio di conversione8. Questo design consente la quantificazione automatizzata e basata sulla luminescenza della vitalità del parassita poco dopo la fecondazione, eliminando la necessità di manipolazione diretta del vettore, e facilita lo screening ad alto rendimento di migliaia di composti8.

Sebbene l'espressione di nLuc avvenga indipendentemente dalla vitalità dell'oocineta, limitando il rilevamento di composti che influenzano specificamente le fasi successive come la morfogenesi dell'oocineta, Ookluc rimane altamente efficace per identificare i composti della TB che mirano alla gametogenesi, alla ricombinazione sessuale o alla sopravvivenza del parassita all'interno della zanzara, compresi gli agenti che inducono la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Studi precedenti hanno convalidato questo sistema identificando con successo composti noti per inibiregli stadi sessuali 9,10,11,12,13,14,15 del Plasmodium. Pertanto, Ookluc rappresenta una piattaforma solida e innovativa per lo screening ad alto rendimento degli stadi sessuali del Plasmodium, facilitando la scoperta di nuovi composti della TBC e facendo avanzare gli sforzi verso l'eliminazione della malaria nei prossimi anni8. Questo protocollo delinea l'applicazione del sistema Ookluc per lo screening farmacologico e la determinazione della concentrazione inibitoria del 50% (IC50).

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida etiche e sono stati approvati dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo (CEUA-ICB/USP). Gli animali sono stati alloggiati e mantenuti nel rispetto degli standard stabiliti da questo comitato. Gli esperimenti sui parassiti geneticamente modificati Plasmodium , nonché la loro conservazione crioconservata a -80 °C, sono stati condotti in conformità con le normative stabilite dal Comitato Istituzionale di Biosicurezza dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo (CIBio-ICB/USP). In questo studio sono stati utilizzati un totale di tre topi femmina BALB/c, di età compresa tra 3 e 5 settimane, due infetti e uno non infetto.

1. Materiali e reagenti

  1. Preparare il terreno ookinete integrando RPMI 1640 con 0,025 M di HEPES, penicillina-streptomicina-neomicina (PSN), 50 mg/L di ipoxantina e 100 μM di acido xanturenico. Regolare il pH a 8,3 8,16.
  2. Preparare la soluzione di lavoro per il saggio di luminescenza mescolando 1 volume di substrato con 50 volumi del tampone di lisi fornito nel sistema di dosaggio della luciferasi.
  3. Impostare l'incubatrice a 21 °C.

2. Infezione e raccolta di sangue parassitato

  1. Infettare due topi femmina BALB/c (4-6 settimane di età) con 150 μL di ceppo crioconservato di Ookluc tramite iniezione intraperitoneale (IP) (Giorno 0).
    NOTA: In questo protocollo, raccomandiamo l'uso di topi BALB/c a causa della loro pronta disponibilità e dell'uso diffuso nelle strutture per animali. Tuttavia, qualsiasi ceppo di topo wild-type che sia suscettibile all'infezione da P. berghei e supporti la gametocitogenesi dovrebbe essere adatto per l'uso.
  2. A partire dal giorno 3, valutare la parassitemia e la gametocitemia mediante esame microscopico degli strisci di sangue colorati con Giemsa.
  3. Quando la parassitemia e la gametocitemia raggiungono circa il 5% e lo 0,5%, rispettivamente (di solito il giorno 4), raccogliere il sangue tramite puntura cardiaca utilizzando siringhe eparinizzate e raccogliere il sangue da entrambi i topi infetti.
    NOTA: Sebbene si tratti di una linea transgenica di P. berghei, il suo profilo di crescita e gametocitemia, sono simili a quelli osservati nel ceppo ANKA. In questo contesto, la proporzione di gametociti rispetto alla parassitemia totale è circa 10 volte inferiore.
    NOTA: Idealmente, la piastra composta (vedi sotto) viene preparata prima della raccolta del sangue parassitato, quindi il sangue viene pipettato sulla piastra immediatamente dopo la raccolta. Se il sangue del topo deve essere raccolto in un altro locale o non può essere immediatamente pipettato sulla piastra del composto per qualsiasi altro motivo, il sangue raccolto deve essere conservato a 37 °C per non più di 30 minuti.

3. Saggio di conversione - screening in piastre a 96 pozzetti

NOTA: Per garantire risultati coerenti, l'intero esperimento deve essere ripetuto tre volte in giorni diversi per confermare i risultati.

  1. Preparare i campioni composti utilizzando il terreno ookinete come diluente (una concentrazione finale di 10 μM). Diluire il materiale composto a 1 mM e preparare i campioni di lavoro diluendo il materiale da 1 mM 1:100 v:v in Ookinete Medium. Per un saggio in duplicato, preparare un volume finale di 200 μl di campione di lavoro.
  2. Se il composto è diluito in un solvente diverso dall'acqua, includere un campione di controllo contenente il solvente diluito in mezzo di ookinete nella stessa proporzione del campione da analizzare, in modo da garantire che l'eventuale inibizione osservata sia attribuibile al composto e non al solvente.
    NOTA: A titolo di esempio, esamineremo 90 composti.
  3. Utilizzando due piastre da 96 pozzetti, posizionare 80 μl dei campioni in ciascun pozzetto, come segue e illustrato nella Figura 1, in duplice (due piastre): Controllo positivo: 80 μl di terreno di ookinete; Controllo negativo: 80 μL di terreno ookinete; Controllo del solvente: 80 μl di terreno ookinete con DMSO all'1%; Campioni: 80 μL di 10 μM di ciascun composto in terreno ookinete.

figure-protocol-1
Figura 1: Rappresentazione schematica di un layout di piastra a 96 pozzetti progettato per lo screening dei composti. Il layout della piastra include controllo positivo (C+), controllo negativo (C-), controllo più solvente di diluizione (C+S) e 90 composti di prova (S1-S90). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Aggiungere 4 μL di sangue di topo parassitato a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con un rapporto v:v di 1:20, ad eccezione del controllo negativo (C-). Omogeneizzare delicatamente mediante pipettaggio.
    NOTA: Considerando le perdite, calcoliamo il fabbisogno di ~400 μL di sangue parassitato per ogni piastra.
  2. Per il controllo negativo, aggiungere sangue di topo non infetto in rapporto 1:20 (v:v, sangue:campione). Omogeneizzare delicatamente.
  3. Incubare a 21 °C per 6 ore o 24 ore.
    NOTA: l'attività di nLuc è rilevabile con 6 ore di incubazione e raggiunge il picco a 24 ore dal saggio8. Il test non è in grado di identificare i composti con attività dopo la formazione dello zigote, come i composti che inibiscono la morfogenesi dell'oocineta, perché gli zigoti formati accumuleranno nLuc indipendentemente dal completamento della morfogenesi. Pertanto, 6 ore di incubazione sono sufficienti per rilevare tutti i composti che bloccano l'attività di nLuc inibendo la gametogenesi, la ricombinazione sessuale o hanno citotossicità precoce. Tuttavia, normalmente preferiamo incubazioni di 24 ore per avere segnali più forti e un migliore rapporto segnale/rumore.

4. Saggio di luminescenza

  1. Dopo il periodo di incubazione, omogeneizzare i campioni pipettandoli su e giù per garantire un'accurata miscelazione del mezzo sanguigno.
  2. Preparare la miscela tampone di lisi/substrato di luciferasi immediatamente prima dell'uso in un rapporto 1:50 (v:v, substrato:tampone di lisi).
  3. Miscelare la miscela di substrato con i campioni in un rapporto 1:1 (v:v), garantendo una miscelazione delicata per evitare bolle. Incubare a 37 °C per 3-5 min.
    NOTA: In questo esempio, abbiamo aggiunto 84 μL di tampone substrato:lisi a ciascun pozzetto.
  4. Trasferire i campioni su una piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti. Misura la luminescenza utilizzando un lettore di piastre. Utilizzare la seguente configurazione dei parametri: filtro di emissione: lente; intervallo di misurazione: 1 s per pozzetto.

5. Analisi dei dati - screening

  1. Dopo il test di luminescenza, prendere nota dei dati grezzi visualizzati (Figura 2).
    NOTA: Le unità di luce relativa (RLU) ottenute dipendono dal luminometro utilizzato. Nel nostro caso, i valori di RLU per il controllo positivo variavano da 10.000 a 500.000 in un test di incubazione di 24 ore. Tempi di incubazione più brevi (6 ore) si tradurranno in valori di RLU più bassi.

figure-protocol-2
Figura 2: Risultati ottenuti da una lettura simulata di un saggio di conversione per lo screening dei composti. L'immagine mostra le letture di luminescenza simulate da un saggio eseguito dopo la conversione di oocinetes in presenza di un pannello di 90 composti. Valori più bassi dell'unità di luce relativa indicano una ridotta formazione di ookinete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Utilizzando un foglio di calcolo, calcola la media di ogni misurazione utilizzando la formula seguente. Sostituire XX con l'indirizzo della prima cella di misura e YY con l'indirizzo della seconda cella di misura. Ripetere la formula per tutti i campioni.
    =(MEDIA(XX:AA)
  2. Converti i dati in % di inibizione per una migliore analisi dei risultati. Nel foglio di calcolo, utilizza la formula seguente. Sostituire A con il valore RLU di esempio e B con il valore RLU di controllo. Ripetere la formula per tutti i composti testati:
    = 1 - (A/B) x 100
    NOTA: I dati appariranno come mostrato nella Figura 3.

figure-protocol-3
Figura 3: Risultati ottenuti da una lettura simulata di un saggio di conversione per lo screening dei composti rappresentati come % di inibizione per ciascun composto. Percentuale di inibizione della conversione per ciascun composto testato, calcolata come descritto sopra. I quadrati evidenziati indicano composti che promuovono oltre il 95% di inibizione della conversione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Identificare i composti che mostrano un'inibizione superiore al 95%.
    NOTA: Questi composti mostrano un'elevata attività contro gli stadi sessuali a una concentrazione di 10 μM. Nel nostro esempio, abbiamo trovato cinque composti con un'elevata attività contro gli stadi sessuali.
  2. Per i composti identificati, eseguire una determinazione IC50 come descritto di seguito.

6. Saggio di conversione - determinazione dell'IC 50

  1. Infettare i topi con Ookluc e raccogliere il sangue parassitato, come descritto nel paragrafo 2.
  2. Preparare i campioni utilizzando il terreno ookinete come diluente. Utilizzare una concentrazione iniziale alla quale si osserva un'inibizione del 100% della conversione da parte del composto.
    NOTA: Poiché i composti attivi sono stati identificati in uno screening con una concentrazione di 10 μM, utilizziamo 20 μM come concentrazione iniziale per la prima curva dose-risposta. Per una curva dose-risposta accurata, è importante che il test includa concentrazioni iniziali che determinano un'inibizione della conversione del 100% e concentrazioni finali che portano a un'inibizione dello 0%. Questo approccio garantisce un calcolo preciso dell'IC50 . La prima curva dose-risposta informerà le concentrazioni più basse del composto con un'inibizione del ~100%. In questo protocollo, utilizzeremo come esempio PyAz90, recentemente identificato utilizzando Ookluc13.
  3. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere in triplicato (vedi Figura 4): Controllo positivo (C+): 80 μl di terreno ookinete; Controllo negativo (C-): 80 μl di terreno ookinete; Prima diluizione del campione (Cpd D1): 160 μL di composto a una concentrazione iniziale in terreno di ookinete che si traduce in un'inibizione della conversione del 100%; Pozzetti da D2 a D12: 80 μL di terreno di ookinete.
  4. Effettuare due diluizioni seriali pipettando 80 μL di pozzetto D1 in D2, omogeneizzare e pipettare 80 μL di pozzetto D2 in D3 e così via. Assicurarsi che tutti i pozzetti abbiano 80 μL di volume totale, quindi scartare gli ultimi 80 μL rimossi dal pozzetto D12.
    NOTA: Eseguire l'esperimento con almeno tre repliche per tutti i campioni, come indicato nella Figura 4. Per garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati, l'intero esperimento deve essere ripetuto in tre giorni separati utilizzando ogni volta animali appena infetti.
    NOTA: Se nella prima schermata i risultati non mostrano alcun impatto del solvente nella conversione, non è necessario includere questi controlli nelle diluizioni seriali. In caso contrario, devono essere incluse anche le diluizioni seriali del solvente.

figure-protocol-4
Figura 4: Layout della piastra a 96 pozzetti progettato per la determinazione del composto IC50 . Il layout della piastra include diluizioni a controllo positivo (C+), a controllo negativo (C-) e composto (Cpd) (da D1 a D12). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Aggiungere sangue di topo parassitato alla piastra a 96 pozzetti a un v:v:1 di 1:20. Omogeneizzare delicatamente mediante pipettaggio.
    NOTA: A ciascun pozzetto verranno aggiunti un totale di 4 μL di sangue parassitato, ad eccezione del controllo negativo (C-). Considerando le perdite, calcoliamo la necessità di ~200 μL di sangue parassitato per ogni composto da testare.
  2. Nei pozzetti di controllo negativo, aggiungere sangue di topo non infetto con un rapporto 1:20 (v:v, sangue:campione). Omogeneizzare delicatamente.
  3. Incubare a 21 °C per 6 ore o 24 ore.
  4. Eseguire il test di luminescenza, come descritto nella sezione 4.

7. Analisi dei dati - Determinazione IC 50

NOTA: IC50 è definito come la concentrazione di un composto necessaria per inibire il 50% dell'attività/inibizione biologica. In questo test, l'inibizione si riferisce alla riduzione della conversione dell'ookinete. I dati sono rappresentati come una curva dose-risposta sigmoidale, dove l'asse X rappresenta la concentrazione del composto (log-trasformata) e l'asse Y rappresenta la % di inibizione.

  1. Calcolare la % di inibizione come descritto nella sezione 5, passaggio 5.3.
  2. Apri il software e crea una tabella XY.
  3. Impostare le opzioni dell'asse Y su Immettere 3 valori di replica in sottocolonne affiancate.
  4. Incollare i dati, con X che rappresenta la concentrazione del composto e Y che rappresenta la % di inibizione (Figura 5A).
  5. Nella barra dei menu, fare clic su Analizza e selezionare Regressione non lineare (adattamento della curva) e quindi Curve dose-risposta - Inibizione e [inibitore] rispetto alla risposta normalizzata - pendenza variabile; fare clic su OK.
  6. Nel pannello di sinistra, osservare la curva dose-risposta dei dati. Applica la personalizzazione desiderata, come i cambi di colore e i formati dei punti.
  7. Individuare la tabella di adattamento Nonlin per trovare l'IC50 calcolato e l'intervallo di confidenza al 95% (IC 95%) (Figura 5B).

figure-protocol-5
Figura 5: Curva dose-risposta di PyAz90. La % di inibizione è stata misurata in funzione della concentrazione di PyAz90 (μM) su scala logaritmica. La curva sigmoidale rappresenta i dati approssimati utilizzati per determinare l'IC50, che era 0,013 μM (intervallo di confidenza al 95%: 0,012-0,014 μM). I punti dati rappresentano la media ± l'errore standard della media delle repliche sperimentali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

La generazione di parassiti Ookluc consente la valutazione di nuovi candidati farmaci per la TB da una prospettiva non offerta dai test esistenti, in particolare nella valutazione degli effetti dei composti sull'attivazione dei gameti, sulla fecondazione e sulla formazione di zigoti8. La Figura 2 e la Figura 3 illustrano la capacità del metodo di esaminare un pann...

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Discussione

La maggior parte dei metodi HTS utilizzati per sviluppare nuovi composti della TBC si concentrano sull'inibizione della gametocitogenesi o sull'attività gametocitocida. Ad oggi, sono stati sviluppati solo due modelli di P. berghei che consentono di valutare la funzione dei gametociti, la gametogenesi, la formazione degli zigoti e la morfogenesi degli oocineti5.

Uno di questi modelli è simile a Ookluc, in quanto utilizz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) e dell'Instituto Serrapilheira (sovvenzione G-1709-16618).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GraphPad Prism versione 10.0.0 per WindowsSoftware GraphPad, Boston, Massachusetts, Stati Uniti
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suinaSigma-AldrichH3393
HEPES (1 M)Termo Scientifico15630106
IpoxantinaSigma-AldrichH9636
Topi------Topi femmina BALB/c, di età compresa tra 3 e 5 settimane
Sistema di dosaggio della luciferasi nano-GloPromegaN1110
Penicillina & meno; Streptomicina − Soluzione di neomicina stabilizzataSigma-AldrichP4083
Lettore di micropiastre POLARStar OmegaBMG Labtech----
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementoTermo Scientifico61870036
Acido xanturenicoSigma-AldrichD120804

Riferimenti

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