Dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo

Sommario

Questo articolo fornisce un protocollo semplificato per la dissezione e la dissociazione dell'epitelio olfattivo murino ai fini del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo.

Abstract

L'epitelio olfattivo murino è il punto di ingresso iniziale del sistema olfattivo, che ospita vari tipi di cellule che includono i neuroni sensoriali olfattivi, i loro progenitori rigeneranti e le cellule di supporto. I neuroni sensoriali olfattivi trasducono gli odori chimici in segnali neurali, ma i meccanismi alla base del modo in cui queste cellule si sviluppano e si riattivano, creano sinapsi con il bulbo olfattivo e regolano i loro recettori odorosi rimangono aree di intenso studio. Situato sulla faccia dorsale della cavità nasale, l'epitelio olfattivo aderisce a intricate strutture ossee note come turbinati. Questa anatomia pone sfide uniche per la sua estrazione e dissociazione, soprattutto nel contesto della preparazione di sospensioni monocellulari vitali. Poiché i protocolli di sospensione a singola cellula spesso comportano fasi preparatorie (ad esempio, dissociazione della papaina, FACS) che possono stressare la vitalità cellulare e/o ritardare la preparazione della libreria, è fondamentale ridurre al minimo il tempo di estrazione dei tessuti. Questo articolo presenta un metodo semplificato per la dissezione rapida dell'epitelio olfattivo e un protocollo per la generazione di sospensioni a nucleo singolo di alta qualità.

Introduzione

L'epitelio olfattivo murino (OE) è un componente essenziale del sistema olfattivo ed è responsabile della rilevazione e della trasduzione dei segnali odorosi nel sistema nervoso centrale. Il suo strato più superficiale contiene le ciglia che rilevano gli odori dei neuroni sensoriali olfattivi, che sono ricoperti da uno strato di muco e circondati dalle cellule sustentacolari e microvillari di supporto ^1,2. Gli OSN sono bipolari, estendono le loro ciglia apicalmente per formare un reticolo all'interno dello strato di muco e i loro assoni basalmente attraverso la placca cribrosa ossea per fondersi in glomeruli all'interno del bulbo olfattivo. Questi glomeruli sono il sito delle sinapsi tra gli OSN e i neuroni a valle. Sottostanti le OSN, le cellule progenitrici neuronali chiamate cellule basali globose riforniscono costantemente le OSN mentre muoiono³ in seguito all'esposizione diretta a insulti ambientali come tossine trasportate dall'aria, agenti patogeni e traumi fisici. Le cellule basali globose derivano da un pool di riserva di cellule basali orizzontali multipotenti ^4,5, situate più basalmente e aderenti alla lamina basale delle sporgenze ossee chiamate turbinati nasali. I turbinati nasali sono tortuosi, rendendo l'OE difficile da separare e omogeneizzare. Inoltre, l'OE è circondato da ossa del cranio, rendendo l'accesso all'area difficile e tradizionalmente richiede una procedura che richiede molto tempo.

Studi precedenti si sono basati su un'incubazione prolungata della papaina per rilasciare l'epitelio olfattivo dall'osso 6,7,8,9,10, che può ritardare ulteriormente l'elaborazione a valle della sospensione a singola cellula. Poiché il taglio degli assoni OSN innesca l'apoptosi¹¹, è fondamentale ridurre al minimo il tempo che intercorre tra l'estrazione del tessuto e la preparazione della libreria di cDNA. Inoltre, l'architettura dell'OE e le sue proiezioni sul bulbo olfattivo complicano l'estrazione di cellule intatte per il successo del sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Fortunatamente, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) è emerso come un potente strumento per profilare le cellule preservando la distribuzione del tipo cellulare, in particolare nei tessuti in cui la dissociazione di singole cellule è difficile o^{poco pratica.}

Mentre un certo numero di studi 6,7,8,10,14,15 hanno eseguito il sequenziamento di singole cellule dell'OE di topo, nessuno offre una procedura di dissezione dettagliata ottimizzata per una raccolta di tessuti coerente e conveniente, che è necessaria data la fragilità dell'OE e l'involucro da varie ossa del cranio. Inoltre, le guide di dissezione esistenti¹⁶ si concentrano sulla conservazione della struttura anatomica piuttosto che sulla velocità, portando a tempi di dissezione potenzialmente lunghi. Poiché una preparazione tissutale opportuna è essenziale per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA e massimizzare la qualità dei nuclei preparati^17,18, è necessario un protocollo ottimizzato per la rapida dissezione e omogeneizzazione dell'OE murino in una sospensione a nucleo singolo per l'uso in varie applicazioni a valle.

Questo protocollo (Figura 1) presenta un metodo semplificato progettato per superare queste sfide, consentendo la rapida dissezione dell'OE murino e un'efficiente dissociazione del tessuto allo scopo di isolare i nuclei. Questo approccio facilita il sequenziamento di un singolo nucleo di alta qualità¹⁹, fornendo una tecnica affidabile per studiare le basi molecolari della biologia olfattiva.

Figura 1: Anatomia delle suture e delle ossa rilevanti del cranio di topo C57BL/6 e sezione trasversale rappresentativa dell'epitelio olfattivo. (A) Le suture del cranio sono codificate a colori. Le suture sono codificate a colori su un lato del cranio, mentre l'altro lato non è contrassegnato per riferimento (a sinistra). I nomi delle suture sono codificati a colori di conseguenza (a destra). (B) Ossa del cranio codificate a colori. Le ossa sono codificate a colori su un lato del cranio, mentre l'altro lato non è contrassegnato per riferimento (a sinistra). I nomi delle ossa sono codificati a colori di conseguenza (a destra). (C) Sezione trasversale della porzione centrale dell'OE (sezionata utilizzando il metodo descritto in questo articolo) con turbinati codificati a colori su un lato e l'over a sinistra non contrassegnato per riferimento (a sinistra). Nomi dei turbinati visualizzati (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati e condotti in conformità con il Baylor College of Medicine IACUC. Sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J (JAX:000664). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Dissezione dell'epitelio olfattivo

1. Inizia anestetizzando profondamente il topo utilizzando qualsiasi metodo preferito (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con un fermo pizzicamento delle dita dei piedi e procedere con la perfusione transcardiaca di almeno 10 ml di 1x PBS ghiacciato. Rimuovere la pelle per esporre il cranio (Figura 2A).
   NOTA: La rimozione della testa dal corpo è facoltativa. Se si decide di rimuovere la testa, si consiglia di rimuovere la pelle e gli altri tessuti molli intorno al cranio prima della decapitazione.
2. Usando un paio di forbici sottili e affilate, praticare due incisioni per rompere bilateralmente gli archi zigomatici dall'osso squamoso posizionando una punta delle forbici nell'orbita posteriore e l'altra adiacente al canale uditivo (linee verdi nella Figura 2B).
3. Praticare un'incisione superficiale da un'orbita all'altra lungo l'aspetto più anteriore dell'osso frontale. Incidere solo la superficie dorsale dell'osso frontale (~1-2 mm di profondità), facendo attenzione a non tagliare le strutture sottostanti o le ossa che compongono l'orbita (linea blu nella Figura 2B).
   NOTA: Per ottenere un'incisione poco profonda tra le orbite, tenere le forbici perpendicolari al cranio e utilizzare solo le punte affilate per tagliare.
4. Tagliare lungo la linea mediana del cranio dal forame magno, attraverso le suture sagittale e interfrontale, fino a raggiungere l'incisione interorbitale praticata nell'osso frontale nel passaggio 1.3 (linea rossa nella Figura 2B).
5. Inserire un paio di pinze nell'incisione praticata lungo la linea mediana del cranio e tirare con decisione lateralmente un emisfero della volta cranica. Questa azione rimuoverà anche le ossa dell'orbita (frontale, mascellare e lacrimale), esponendo gli aspetti laterali dei turbinati olfattivi (Figura 2D).
   NOTA: Fare attenzione a non danneggiare inavvertitamente l'OE da questo punto in poi.
6. Tenendo l'osso nasale e i denti incisivi, staccare la volta cranica controlaterale usando una pinza. Lasciare che il cervello (compresi i bulbi olfattivi) venga rimosso con l'emisfero osseo mentre viene strappato via (Figura 1E). Le uniche strutture ossee visibili che dovrebbero rimanere dopo questo passaggio sono la base del cranio e le ossa che circondano l'OE (Figura 2F).
7. Utilizzando un paio di tronchesi ossei o rongeurs, rimuovere l'osso frontale e l'osso premascellare (incisivo) rimanenti fino alla base dei denti incisivi (Figura 2G).
8. Utilizzare tronchesi ossei per tagliare lungo la sutura frontonasale per rilasciare l'osso nasale dalla placca cribrosa, prestando estrema attenzione a non danneggiare l'OE sottostante esposto o fratturare la placca cribrosa.
9. Sollevare l'osso nasale dalla placca cribrosa usando una pinza per esporre l'OE (Figura 2H). Se l'osso premascellare residuo oscura l'OE dorsale, rimuoverlo prima di procedere (cerchi neri nella Figura 1I).
10. Utilizzando una pinza a punta fine, fissare delicatamente l'aspetto dorsale del setto nasale alla sua giunzione con la placca cribrosa e tirare posteriormente (Figura 2J, K). Con una resistenza minima, l'epitelio olfattivo principale si libererà come una struttura completamente intatta (Figura 2L).
11. Procedere immediatamente con la dissociazione OE o congelare il tessuto per una successiva elaborazione.

Figura 2: Tecnica per la dissezione rapida dell'epitelio olfattivo. (A) La testa del topo dopo la rimozione del tessuto molle circostante. (B) Guide con codice colore per incisioni della volta cranica. (C) Aspetto a seguito di incisioni della volta cranica. (D) Rimozione del primo emisfero della volta cranica insieme alla porzione dell'orbita adiacente all'epitelio olfattivo. (E) Rimozione della porzione controlaterale della volta cranica insieme al cervello. (F) La testa dopo la rimozione del cervello e della volta cranica. (G) Rimozione dell'osso frontale più anteriore e della premascella posteriore, a seguito di incisione sulla sutura frontomascellare. (H) Rimozione delle ossa nasali. (I) I cerchi neri evidenziano le aree dell'osso premascellare residuo che possono essere opzionalmente rimosse. (J) Posizionamento di pinze per la rimozione dell'epitelio olfattivo intatto. (K) Tirare posteriormente per rilasciare l'epitelio olfattivo. (L) Rilascio totale dell'epitelio olfattivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento del singolo nucleo

1. Posizionare una provetta C e due provette coniche da 15 mL per campione sul ghiaccio.
2. Preparare il tampone di lisi aggiungendo l'inibitore dell'RNAsi (a una concentrazione finale di 0,2 U/μL) al tampone di estrazione dei nuclei prefabbricati.
3. Aggiungere 4 mL di BSA all'1% a ciascuna provetta conica da 15 mL, agitare brevemente ed eliminare l'eccesso. Questo riveste ciascuna delle provette coniche da 15 mL con BSA per ridurre al minimo l'adesione dei nuclei alla provetta.
4. Per un intero OE, aggiungere 2 mL di tampone di lisi ghiacciato a ciascuna provetta C.
5. Aggiungere campioni OE ai tubi C. Usando una pinza #2, tieni ogni campione sopra il rispettivo tubo C e taglialo in piccoli pezzi usando un paio di forbici a punta fine.
6. Posizionare le provette a C contenenti ciascun campione capovolte sui blocchi dissociatori tissutali automatizzati. Nella schermata del dissociatore, il quadrato corrispondente a ciascun blocco cambierà da Libero a Selezionato.
7. Premere l'icona della cartella per accedere alla cartella Miltenyi . Utilizzando le frecce, scorrere fino al programma 4C_nuclei_1 (un programma precaricato all'interno del dissociatore). Premere OK per applicare il programma a ciascun blocco, quindi premere Avvio per iniziare il ciclo. Rimuovere i tubi C dal dissociatore immediatamente dopo il completamento del ciclo.
   NOTA: Se possibile, mantenere i tubi C ghiacciati durante il ciclo di dissociazione. È importante rimuovere i campioni dal dissociatore immediatamente dopo il completamento del ciclo e procedere con le fasi successive del protocollo per evitare un'eccessiva lisi dei nuclei.
8. Con una pipetta, aspirare la sospensione omogeneizzata dalla provetta C e filtrarla attraverso un filtro da 70 μm nella prima provetta conica rivestita in BSA. Evitare di aspirare i frammenti ossei che si sono accumulati sul fondo del tubo corbitale.
9. Sciacquare il colino con 1 ml di 1 PBS ghiacciato per garantire una filtrazione completa.
10. Centrifugare la sospensione filtrata a 500 × g per 5 minuti a 4 °C in una centrifuga a secchiello oscillante.
11. Aspirare delicatamente ed eliminare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere completamente il pellet di nuclei in 1 mL di 1x PBS ghiacciato mediante pipettaggio delicato.
12. Passare i nuclei risospesi attraverso un filtro da 30 μm nel secondo tubo conico rivestito in BSA. La concentrazione dei nuclei può essere quantificata utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
13. Procedere immediatamente con il protocollo a valle scelto (con o senza FACS) per preservare l'integrità del campione e prevenire la degradazione (Figura 3).
    NOTA: Si consiglia vivamente agli utenti di eseguire le prove dell'intero protocollo per garantire un completamento continuo e tempestivo.

Figura 3: Flusso di lavoro di dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento a nucleo singolo. Dopo la dissezione, l'epitelio olfattivo viene dissociato meccanicamente e chimicamente. Il lisato viene quindi filtrato attraverso un colino da 70 μm, risciacquato con 1x PBS e centrifugato a 500 × g per 5 minuti. Il pellet viene risospeso in 1x PBS prima di essere filtrato attraverso un filtro da 30 μm. La sospensione di nuclei risultante è disponibile per varie applicazioni di sequenziamento a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Per fornire un contesto anatomico per la dissezione e l'analisi, le suture e le ossa del cranio di topo C57BL/6, nonché la porzione centrale dell'epitelio olfattivo (OE), sono state visualizzate e codificate a colori (Figura 1). Un lato di ogni immagine è stato annotato per evidenziare suture, ossa e turbinati rilevanti, mentre l'altro lato è stato lasciato non contrassegnato come riferimento. La sezione trasversale OE è stata preparata seguendo i protocolli stabiliti²⁰

Discussione

La procedura qui descritta consente la rimozione coerente di un OE intatto dopo la perfusione intracardiaca 1x PBS. Ciò rappresenta un notevole miglioramento della velocità rispetto ai metodi precedenti¹⁶ ed è di particolare importanza dato che gli OSN iniziano a degenerare dopo l'assotomia², che si verifica durante la rimozione del cervello.

Un'attenta rimozione delle ossa frontali, premascellari e nasali è fond...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta da centrifuga da 15 ml	Celltreat	229411
Tronchesino d'osso	Strumenti per la scienza	16102-11
Forbici per iride in miniatura Bonn	Miltex	18-1392
Soluzione di albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	Codice: A1595
Pinze Dumont #3	Strumenti per la scienza	11231-30
Topi femmina C57BL/6J	Il laboratorio Jackson	JAX:000664
delicati tubi MACS C	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Dissociatore Octo	Miltenyi Biotec	130-096-427
Filtri MACS SmartStrainer 30 um	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers 70 um	Miltenyi Biotec	130-098-462
Micro Friedman-Pearson Rongeurs	Strumenti per la scienza	16220-14
Tampone di estrazione dei nuclei	Miltenyi Biotec	130-128-024
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x senza calcio e magnesio, PH 7,4 ± 0.1	Corning	21-040-CV
Inibitore dell'RNAsi protettore	Millipore Sigma	3335402001
Centrifuga refrigerata Sorvall Legend XTR	Termo Scientifico	50119927-5