Articolo metodologico

Tracciamento in vivo guidato da immagini di cellule progenitrici epiteliali polmonari distali trapiantate per la fibrosi polmonare mediante imaging con particelle magnetiche

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DOI:

10.3791/68477

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27 giugno 2025

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La terapia cellulare offre un intervento promettente per la fibrosi polmonare utilizzando cellule progenitrici per riparare i tessuti danneggiati e migliorare la funzione polmonare. Poiché l'imaging svolge un ruolo fondamentale nel tracciamento dell'integrazione cellulare, in questo articolo descriviamo il tracciamento in vivo guidato dall'imaging con particelle magnetiche della terapia cellulare per la fibrosi polmonare in un modello murino.

Abstract

La fibrosi polmonare (PF) è una malattia polmonare progressiva e cronica caratterizzata da ripetute lesioni epiteliali alveolari che portano a un'eccessiva deposizione di matrice extracellulare, con conseguente ispessimento dei tessuti, cicatrizzazione e alterato scambio gassoso, con conseguente disfunzione respiratoria. Negli Stati Uniti, ogni anno vengono segnalati circa 50.000 nuovi casi, con pazienti che affrontano gravi complicazioni come pneumotorace, ipertensione polmonare, insufficienza respiratoria e un aumento del rischio di cancro ai polmoni. Le attuali opzioni terapeutiche sono limitate in termini di efficacia e mirano principalmente a rallentare la progressione della malattia. La terapia cellulare è emersa come un intervento promettente, che offre il potenziale per rigenerare il tessuto polmonare danneggiato, modulare l'infiammazione e migliorare la funzione polmonare. Tuttavia, l'efficacia di queste terapie dipende in modo significativo dalla capacità di monitorare la distribuzione, la sopravvivenza e l'integrazione delle cellule trapiantate all'interno dei polmoni ospiti.

L'imaging con particelle magnetiche (MPI) è una nuova modalità di imaging preclinico non invasiva che utilizza nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) come traccianti. MPI offre un'elevata sensibilità, specificità e nessun segnale di fondo, consentendo il monitoraggio quantitativo e in tempo reale delle cellule marcate in vivo. In questo studio, abbiamo studiato l'uso dell'MPI per il monitoraggio delle cellule progenitrici epiteliali del polmone distale umano trapiantate nei polmoni di topi immunocompromessi. Le cellule sono state marcate con concentrazioni variabili di SPION per ottimizzare il segnale, confermato dall'immunocolorazione e dalla quantificazione del ferro. Dopo l'instillazione intratracheale, sono state acquisite scansioni MPI 2D per tracciare la distribuzione spaziale delle cellule trapiantate. L'imaging longitudinale dell'arco di 2 settimane ha permesso di visualizzare l'integrazione e la ritenzione cellulare all'interno del tessuto polmonare. L'instillazione riuscita ha mostrato segnali MPI sia nei polmoni sinistro che destro, che sono diminuiti (~65%) nel tempo. I topi sono stati successivamente sacrificati per la convalida istologica. Questo studio dimostra l'utilità dell'MPI per il tracciamento longitudinale non invasivo della terapia cellulare nella fibrosi polmonare e si basa sulle complesse tecniche utilizzate durante le procedure.

Introduzione

La terapia cellulare 1,2 offre un potenziale rigenerativo, promuovendo la riparazione dei tessuti, riducendo l'infiammazione e migliorando gli esiti in malattie croniche come leucemia e linfoma 3,4 (cellule staminali ematopoietiche), osteoartrite 5,6 (cellule staminali mesenchimali), diabete di tipo 17 (trapianto di cellule insulari), lesioni del midollo spinale 8,9, malattie neurodegenerative10,11,12 (cellule staminali neurali) e fibrosi polmonare 13,14,15,16 (cellule progenitrici polmonari). Queste terapie offrono un potenziale significativo, anche se rimangono ancora sfide come il rigetto immunitario e l'efficacia a lungo termine17,18. La fibrosi polmonare (PF) è una malattia polmonare cronica e progressiva caratterizzata da un'eccessiva cicatrizzazione del tessuto polmonare, che porta a una compromissione della funzione polmonare19. La terapia cellulare per la PF mira a rigenerare il tessuto polmonare danneggiato e a ridurre la fibrosi introducendo cellule rigenerative, come le cellule staminali mesenchimali o le cellule progenitrici del polmone distale, nei polmoni colpiti20. Le cellule progenitrici del polmone distale, che includono popolazioni come le cellule basali, le cellule alveolari di tipo II, le cellule staminali bronchioalveolari e altre cellule progenitrici multipotenti, hanno la capacità di promuovere la riparazione dei tessuti, ridurre l'infiammazione, potenzialmente rigenerare il tessuto polmonare danneggiato e invertire parte del danno polmonare ripristinando la normale funzione polmonare21. Diversi studi clinici preclinici e in fase iniziale hanno dimostrato che il trapianto di cellule progenitrici polmonari in polmoni fibrotici può aiutare a rigenerare le strutture alveolari, promuovere il rimodellamento dei tessuti e ridurre l'infiammazione 13,22,23. Inoltre, queste cellule possono secernere vari fattori di crescita e citochine che modulano l'ambiente fibrotico, promuovendo ulteriormente la riparazione. Nonostante i risultati incoraggianti nel miglioramento della funzione polmonare, permangono sfide nell'ottimizzazione della somministrazione cellulare, tra cui l'isolamento, l'espansione e l'integrazione efficienti di queste cellule nel tessuto polmonare danneggiato, garantendo la sicurezza a lungo termine e prevenendo effetti collaterali indesiderati. È necessaria una continua ricerca per perfezionare i protocolli e valutare la sicurezza e l'efficacia a lungo termine delle terapie cellulari progenitrici per la fibrosi polmonare.

Il trapianto di cellule nei polmoni per la fibrosi polmonare comporta diverse tecniche, ciascuna progettata per migliorare la consegna cellulare, la sopravvivenza e l'integrazione nel tessuto polmonare danneggiato. I metodi comuni includono l'iniezione endovenosa24,25, la somministrazione endobronchiale26,27 e l'instillazione intratracheale 28,29,30,31, ciascuno con vantaggi e sfide specifici. La somministrazione endovenosa di cellule staminali è ostacolata da un homing polmonare non ottimale, dal sequestro in organi fuori bersaglio, dalla limitata vitalità post-infusione e dal rischio di risposte immunogeniche. La somministrazione endobronchiale, sebbene più localizzata, è limitata dalla distribuzione cellulare eterogenea, dalla potenziale occlusione delle vie aeree, dalle risposte infiammatorie e dalle sfide procedurali all'interno dell'architettura polmonare fibrotica. Allo stesso modo, l'instillazione intratracheale, nonostante consenta la deposizione polmonare diretta, può portare a una dispersione cellulare incoerente, a un'inadeguata penetrazione polmonare distale, a irritazione localizzata e alla variabilità dell'uniformità della dose tra i compartimenti polmonari. Sebbene tutte queste tecniche mirino a migliorare la sopravvivenza cellulare, l'integrazione e l'efficacia nella rigenerazione del tessuto polmonare, la scelta della tecnica ottimale dipende da fattori come il tipo di cellule trapiantate, lo stadio della fibrosi e la salute generale del paziente.

Nonostante le sue sfide, l'instillazione intratracheale rimane uno dei metodi più comunemente usati per fornire le cellule direttamente ai polmoni, soprattutto nel contesto della fibrosi polmonare. In questa tecnica, le cellule vengono introdotte nel polmone tramite un catetere inserito nella trachea32. Le cellule vengono quindi depositate nello spazio alveolare, dove possono potenzialmente riparare il tessuto polmonare danneggiato. Questo metodo è minimamente invasivo e relativamente facile da eseguire rispetto ad altri approcci di somministrazione come la perfusione polmonare ex vivo . Poiché le cellule si depositano direttamente nei polmoni, può migliorare le possibilità di un'integrazione e di una riparazione efficaci. A differenza dell'iniezione endovenosa, l'instillazione intratracheale evita la circolazione sistemica, riducendo il rischio che le cellule rimangano intrappolate in altri organi come il fegato o la milza, portando a un effetto terapeutico più mirato nei polmoni. Nonostante questi benefici, il metodo deve ancora affrontare sfide in termini di distribuzione e ritenzione cellulare non ottimali e sopravvivenza all'interno dei polmoni, che possono limitare l'efficacia terapeutica. La ricerca in corso sta lavorando per perfezionare questo approccio per ottenere risultati clinici più efficaci. I ricercatori possono determinare se l'instillazione intratracheale è adatta alle loro applicazioni valutando diversi fattori. Questi includono il tipo di cellule che vengono consegnate, la loro capacità di sopravvivere e integrarsi nel tessuto polmonare e la gravità del modello di malattia (ad esempio, fibrosi polmonare).

L'imaging è uno strumento indispensabile per tracciare le cellule, valutarne la vitalità, la distribuzione e gli effetti, migliorare il monitoraggio della terapia cellulare e ottimizzare le strategie di trattamento33. I ricercatori hanno valutato l'efficienza della somministrazione attraverso l'imaging e l'analisi post-consegna per monitorare la distribuzione e la ritenzione cellulare. Varie tecniche come la fluorescenza, la risonanza magnetica (MRI), la tomografia computerizzata (CT), la tomografia a emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e gli ultrasuoni sono state utilizzate per tracciare le cellule staminali marcate per la fibrosi polmonare. Tuttavia, devono affrontare limitazioni come la bassa penetrazione in profondità (fluorescenza), la scarsa sensibilità (MRI), l'esposizione alle radiazioni (CT, PET, SPECT) e la bassa risoluzione (ultrasuoni)34. Sebbene l'ottimizzazione del contrasto, della risoluzione e della biocompatibilità dell'imaging possa aiutare a superare queste sfide in una certa misura, l'esplorazione di nuove tecniche di imaging può anche rivelarsi essenziale per un accurato tracciamento delle cellule staminali nei polmoni. Negli ultimi anni, l'imaging con particelle magnetiche (MPI) si è affermato come una modalità di imaging promettente e priva di radiazioni, che offre immagini quantitative ad alta sensibilità, in tempo reale e con contrasto elevato senza interferenze di fondo.

MPI utilizza nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPION) per la visualizzazione diretta e il suo principio di funzionamento si basa sulla risposta di magnetizzazione non lineare di questi SPION quando esposti a un campo magnetico variabile nel tempo35,36. Gli elettromagneti vengono utilizzati per creare una regione libera da campo (FFR), in cui solo le particelle all'interno di questa regione mostrano una magnetizzazione non lineare e generano un segnale quando eccitate da un campo magnetico oscillante. D'altra parte, la magnetizzazione delle particelle al di fuori di questa FFR è satura e non partecipano alla produzione del segnale. Spostando sistematicamente la FFR in tutto il volume di imaging, MPI costruisce mappe spaziali della distribuzione delle nanoparticelle e delle immagini successive. MPI offre diversi vantaggi rispetto alle modalità di imaging tradizionali 37,38. A differenza della risonanza magnetica o della TC, l'MPI fornisce il segnale solo dal tracciante, con conseguente assenza di rumore di fondo e contrasto eccezionale. Offre immagini in tempo reale con un'elevata risoluzione temporale, che lo rende ideale per il monitoraggio di processi dinamici come la migrazione cellulare o la perfusione. Inoltre, l'MPI è altamente sensibile, consentendo il rilevamento di piccole quantità di SPION senza radiazioni ionizzanti, a differenza della PET o della CT. Inoltre, dimostra anche un'eccellente quantificazione lineare, consentendo una valutazione accurata della concentrazione del tracciante. Nel complesso, MPI combina i punti di forza di sensibilità, sicurezza e quantificazione, rendendolo un potente strumento per l'imaging biomedico. L'MPI è promettente per il tracciamento delle cellule staminali nei polmoni, consentendo un monitoraggio preciso della migrazione, della ritenzione cellulare e degli effetti terapeutici. Fornisce un eccellente contrasto senza interferenze del segnale tissutale, consentendo così una localizzazione precisa delle cellule staminali marcate 39,40,41,42. Le sezioni seguenti delineano i protocolli intrapresi per questi studi, dimostrando l'uso dell'instillazione intratracheale per fornire le cellule marcate ai polmoni di topo e la conferma tramite MPI.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e che coinvolgono soggetti umani sono state approvate da Corewell Health IRB n. 2017-198. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima della partecipazione allo studio.

Campioni di espianto polmonare umano da pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF) sottoposti a trapianto di polmone sono stati raccolti da Corewell Health. Prima della procedura di trapianto, tutti i pazienti soddisfacevano i criteri diagnostici per la fibrosi polmonare idiopatica (IPF), caratterizzata da ipossiemia, dispnea e riduzione del volume polmonare43. L'analisi patologica del tessuto prelevato dall'estremità distale del lobo polmonare ha confermato la presenza di fibrosi.

I topi maschi NOD/SCID sono stati acquistati a 8 settimane di età e lasciati acclimatare per 1 settimana e poi invecchiati fino a 12 settimane prima della procedura.

1. Isolamento ed espansione di cellule epiteliali delle vie aeree umane

  1. Posizionare il campione polmonare espiantato su ghiaccio per preservare l'integrità cellulare durante la dissezione. Identificare i bronchi/grandi vie aeree presenti nel campione; Le piccole vie aeree si trovano nelle porzioni distali del campione polmonare, più lontane dalle grandi vie aeree. Utilizzando strumenti sterilizzati, asportare la parte distale del campione polmonare e trasformarla in porzioni più piccole per facilitare la digestione del tessuto. Sciacquare il campione nella soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbco per rimuovere il sangue e i liquidi in eccesso, quindi digerire il tessuto polmonare espiantato contenente le piccole vie aeree in un tampone costituito da proteasi di Streptomyces griseus, 1x penicillina/streptomicina, DNasi I e 1x gentamicina in una provetta da 50 ml. Mettere il fazzoletto in un bagnomaria a 37 °C a dondolo per circa 4 ore, o fino a quando il tessuto non è sufficientemente digerito.
  2. Passare il contenuto della provetta da 50 mL attraverso un colino sterile da 100 μm. Sciacquare il fazzoletto 3 volte con DPBS e passare i lavaggi attraverso il colino. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura pipettando la sospensione cellulare 50 volte con una pipetta impostata a 500 μL.
  3. Aggiungere la sospensione cellulare a un pallone di coltura da 75cm2 contenente il terreno di crescita epiteliale delle vie aeree. Coltura delle cellule a 37 °C, 5% di CO2 per circa 2 settimane.

2. Marcatura delle cellule epiteliali delle vie aeree con nanoparticelle (tracciante di ossido di ferro)

  1. Quando le colture epiteliali sono confluenti all'80%, marcare le cellule con tracciante di ossido di ferro a una concentrazione finale di 250 μg/mL. Aggiungere il volume appropriato di tracciante di ossido di ferro a 10 mL di terreno di coltura per pallone di cellule epiteliali e incubare per 48 ore.
    NOTA: Sono state valutate diverse concentrazioni di tracciante di ossido di ferro (50, 100, 200 e 250 μg/mL) per la marcatura cellulare, seguite dalle scansioni MPI 2D (Figura 1A). La concentrazione di 250 μg/mL, insieme a 50.000 cellule per il trapianto, è stata finalizzata per questo studio.
  2. Dopo 48 ore, lavare le cellule 3 volte con DPBS per rimuovere le nanoparticelle in eccesso.
  3. Staccare le cellule utilizzando il reagente distaccante e incubare le cellule a 37 °C per 15 minuti, o fino a quando le cellule iniziano a sollevarsi dalla superficie del pallone.
  4. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml contenente 1 ml di siero fetale bovino. Sciacquare il pallone 3 volte con 5 mL di DPBS e aggiungere i lavaggi alla provetta da 50 mL contenente le cellule.
  5. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura pipettando la sospensione cellulare 50x con una pipetta impostata a 500 μL.
  6. Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare e determinare il volume di sospensione cellulare necessario per il trapianto in vivo .
  7. Aliquotare 100 μL della sospensione cellulare e fissarla in paraformaldeide al 4%.

3. Immunocolorazione e microscopia in vitro

  1. Caricare l'aliquota di 100 μl di sospensione cellulare in una cartuccia cytospin contenente un vetrino e un filtro e centrifugare per 5 minuti a 1.000 giri/min.
  2. Delinea le cellule sul vetrino usando una penna idrofobica.
  3. Lavare i vetrini per 2 x 15 minuti con DPBS.
  4. Permeabilizzare le cellule sul vetrino incubando con Triton X-100 allo 0,1% in DPBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Lavare le celle per 2 x 2 minuti con DPBS.
  6. Bloccare i vetrini con il 5% di albumina sierica bovina (BSA)/1% di siero di capra in DPBS per 2 ore.
  7. Incubare i vetrini in anticorpi primari (anti-destrano) in siero di capra 2,5% BSA/0,5% in DPBS per una notte a 4 °C.
  8. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare i vetrini 3 x 5 minuti in 1x soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST).
  9. Incubare i vetrini con anticorpo secondario 1:1.000 in siero di capra 2,5% BSA/0,5% in DPBS per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
  10. Lavare i vetrini per 3 x 5 minuti con 1x TBST.
  11. Aggiungere un agente colorante nucleare, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), al vetrino a una concentrazione di 1:1.000 in DPBS e lasciare incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  12. Lavare i vetrini 2 x 5 min con 1x TBST. Rimuovere l'eccesso di 1x TBST dal vetrino.
  13. Aggiungere il supporto di montaggio con DAPI e posizionare un vetrino coprioggetti in vetro sul vetrino, facendo attenzione a evitare bolle d'aria.
  14. Dopo che il vetrino si è solidificato, sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con uno smalto trasparente.
  15. Visualizzare i vetrini su un microscopio confocale.

4. Trapianto di cellule mediante instillazione intratracheale

  1. Preparazione
    1. Pesare il topo per calcolare la dose di bleomicina (BLM) necessaria per ciascun topo.
    2. In una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL, preparare la soluzione BLM desiderata (diluita in soluzione fisiologica sterilizzata) in un volume non superiore a 50 μL.
      NOTA: La concentrazione del farmaco varierà a seconda degli obiettivi sperimentali. Per questa procedura è stato utilizzato BLM a 0,6 U/kg.
    3. Caricare la soluzione BLM in una pipetta. Inoltre, precaricare una siringa con 200 μL di aria per assicurarsi che tutto il volume del liquido venga espulso nella trachea.
      NOTA: Dopo 72 ore di trattamento con BLM, la sospensione cellulare marcata verrà somministrata in modo simile.
    4. Utilizzare il conteggio delle cellule ottenuto dal passaggio 2.6 per calcolare il volume della sospensione cellulare, contenente 50.000 cellule, da somministrare.
    5. Anestetizzare il topo inserendolo in una scatola di induzione collegata all'unità di anestesia che fornisce isoflurano (2,5-3%) fino a sedazione.
      NOTA: I topi vengono anestetizzati due volte durante l'intera procedura: (1) il giorno della somministrazione di BLM e (2) il giorno dell'instillazione intratracheale delle cellule, che è 72 ore dopo la dose di BLM.
    6. Impostare il kit di intubazione con fibra ottica come mostrato nella Figura 2A con la sonda in fibra ottica che passa attraverso il laringoscopio e il catetere.
      NOTA: L'estremità illuminata della fibra deve essere posizionata appena fuori (1-2 mm) dal tubo del catetere.
  2. Instillazione intratracheale
    1. Confermare l'anestesia controllando il riflesso del pedale pizzicando l'alluce in una delle zampe posteriori. Una volta confermata un'adeguata anestesia, sospendere il topo per gli incisivi in posizione supina su un supporto angolato per l'intubazione dei roditori (Figura 2B-D).
    2. Usando una pinza smussata, afferrare con cura la lingua e, con un movimento verso l'alto e verso sinistra, posizionare la lingua per ottenere un'adeguata visualizzazione della laringe.
    3. Accendere la sonda in fibra ottica ed entrare nella bocca per avvicinarsi alla trachea. Utilizzare la lente d'ingrandimento del laringoscopio per una migliore visualizzazione della laringe e individuare le corde vocali in corrispondenza dell'apertura tracheale.
    4. Inserire il catetere nell'apertura tracheale e staccare con molta attenzione il laringoscopio ed estrarlo. Posizionare una minuscola goccia di soluzione fisiologica (20 μL) all'estremità superiore del catetere.
      NOTA: Il livello del liquido si sposterà su e giù, allineato con la frequenza respiratoria del mouse. Questo confermerà il posizionamento del catetere nella trachea e non erroneamente nell'esofago.
    5. Inserire una siringa con 200 μL di aria precaricata e spingere la gocciolina all'interno. Posizionare la sospensione cellulare (≤50 μL) nel catetere e instillarla utilizzando la siringa caricata ad aria come in precedenza.
    6. Per evitare che il liquido instillato fuoriesca dalla trachea, lasciare il catetere in posizione per 5-7 s. Quindi, estrarre delicatamente il catetere.
    7. Mantenere il mouse nella stessa posizione sul supporto per intubazione per almeno 30 s.
    8. Rimuovere il mouse e metterlo in una gabbia di recupero posta su un termoforo. Monitorare fino al completo recupero dall'anestesia.

5. Imaging con particelle magnetiche

  1. Anestetizzare il topo inserendolo in una scatola di induzione collegata all'unità di anestesia che fornisce isoflurano (2-2,5%) fino a sedazione.
  2. Installare il letto del mouse in uno scanner MPI con la linea di anestesia che passa sotto il letto attraverso apposite connessioni.
  3. Mentre il mouse viene sedato, preparare lo scanner MPI per l'imaging. Avviare il software collegato e definire un nome di cartella in Progetto e la scansione nel dominio del nome dell'esame per l'identificazione, quindi impostare i parametri di scansione in base ai requisiti. Per seguire questa procedura, utilizzare i seguenti parametri di scansione: Tipo di scansione: scansione 2D; Modalità di scansione: Standard; Canali di trasmissione: multicanale (isotropo); Medie per proiezione: 2.
  4. Controllare l'anestesia come descritto al punto 4.2.1. Posizionare saldamente il mouse sul letto MPI come illustrato nella Figura 2E.
    NOTA: Assicurarsi che il muso sia correttamente allineato con il cono nasale integrato del letto per un corretto mantenimento dell'anestesia durante la scansione.
    ATTENZIONE: Un'anestesia insufficiente durante la scansione può causare la riattivazione del mouse durante l'esecuzione della scansione.
  5. Una volta posizionato il mouse nello scanner, spingere il piano all'interno del foro e fare clic su Avvia scansione.
  6. Al termine della scansione, rimuovere il mouse dal letto MPI e metterlo in una gabbia di recupero posizionata su un termoforo. Monitorare fino al completo recupero dall'anestesia.
  7. Analizza le immagini utilizzando un software di analisi delle immagini.

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Risultati

Lo studio pilota è stato intrapreso con sei topi. Di questi, solo un topo è morto prima del completamento dello studio, al giorno 10. Le intensità del segnale MPI 2D per diverse concentrazioni di marcatura sono state valutate in funzione del numero di cellule (Figura 1A). È stato osservato che l'intensità del segnale era direttamente proporzionale alla concentrazione del tracciante di ossido di ferro. Pertanto, la concentrazione di 250 μg/mL è stata consider...

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Discussione

L'instillazione intratracheale nei topi è una tecnica precisa per somministrare sostanze direttamente nei polmoni. È necessaria un'attenzione particolare durante i molteplici passaggi critici di questa procedura. A partire dal garantire un'adeguata profondità dell'anestesia per prevenire disagio e movimento e posizionando il topo supino con il collo esteso per allineare le vie aeree per un libero accesso all'apertura tracheale. L'uso di un abbassalingua può aiutare a mantenere aperte le ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Il finanziamento per questo studio è stato fornito in parte dalla sovvenzione da R01HL153165-01A1 a X.P.L. e R21AI159928-01 a P.W.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMTPer la raccolta di cellule e preparazione delle diluizioni BLM
Anti-Dextran antibdoySTEMCELL Technologies60026Anticorpo primario
BD Luer-Lok SeringaBecton, Dickinson309628Per iniezioni d'aria durante l'instillazione intratracheale
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbeccos phosphate-buffered saline (DPBS -/-) Gibco14190250
Fetal Bovine Serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamicina Gibco15750060
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568ThermoFisher ScientificA-11004Anticorpo secondario
Goat SerumMillipore-SigmaG9023
IsofluraneCovetrus11695067772Anestesia gassosa
Isoflurane vaporizerSOMNI ScientificVS6002Apparecchio per l'anestesia
MomentumMagnetic Insight IncScanner MPI (Magnetic Particle Imaging) preclinico
Mouse intubation kitOHANOhan-201Kit di intubazione completo con tutti gli accessori necessari
NOD/SCID MiceJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303Modello di topo immunocompromesso
Penicillin/Streptomycin Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI InvitrogenP36962Medium di montaggio per vetrini immunocolorati
Protease from Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Surgical kitForcipi ad estremità smussata utilizzate per tenere la lingua del topo
Tris-Buffered Saline with Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01Tracer di ossido di ferro per l'etichettatura cellulare in vitro e successiva MPI

Riferimenti

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