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Articolo metodologico

Un modello di espianto ex vivo per lo studio delle interazioni gliali nella retina del topo

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DOI:

10.3791/68482

⸱

15 luglio 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

Qui, forniamo una metodologia dettagliata per isolare la retina dall'occhio del topo per una sperimentazione ex vivo estesa. Questo protocollo sottolinea l'importanza di rendere accessibile questo approccio tecnicamente impegnativo per i ricercatori che desiderano sfruttare le vie di ricerca offerte dal mantenimento della glia retinica in situ nel tessuto vivo.

Abstract

Il ruolo della glia nel glaucoma è un argomento di ricerca sempre più importante, ma molto rimane sconosciuto su come le popolazioni di queste cellule di supporto - vale a dire astrociti e microglia - influenzino la sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche. Sebbene i modelli in vivo e in vitro forniscano un certo grado di comprensione, entrambi gli approcci presentano limitazioni significative, come l'impatto della risposta immunitaria periferica nel primo e i cambiamenti nella funzione fisiologica indotti dall'isolamento cellulare e dalla coltura nel caso del secondo. Per ridurre al minimo questi fattori confondenti, abbiamo sviluppato un sistema di espianto retinico ex vivo in cui astrociti, microglia e altri tipi di cellule retiniche possono essere mantenuti in situ per periodi di almeno 3 giorni, consentendo un'indagine mirata a un rendimento più elevato di quanto sia tipicamente fattibile con i modelli in vivo . Fondamentalmente, questo approccio è altamente suscettibile di metodologie che sarebbero impegnative o irrealizzabili in un animale vivente, ma rimane compatibile con i comuni saggi a valle del tessuto nervoso intatto. Qui, presentiamo un protocollo adatto per l'isolamento e la coltura di espianti retinici intatti, insieme ai risultati rappresentativi della microscopia a immunofluorescenza che documentano i cambiamenti subiti dalle cellule gliali e gangliari retiniche nella retina ex vivo .

Introduzione

La retina sensibile alla luce, un'estensione del sistema nervoso centrale (SNC) situata nella parte posteriore dell'occhio, è essenziale per la vista ma vulnerabile sia alle lesioni acute che alle malattie croniche. Come in altre regioni del SNC, i neuroni della retina adulta non vengono sostituiti quando vengono persi e le cellule gangliari retiniche (RGC) che aggregano e trasmettono le informazioni visive al cervello sono particolarmente vulnerabili alla disfunzione e alla morte nel glaucoma, con conseguente perdita irreversibile della vista 1,2. Il glaucoma è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo3, ma nonostante l'impatto devastante sugli individui colpiti e i costi complessivi per la società, molto rimane sconosciuto su come le prime fasi della malattia contribuiscano alla perdita di RGC4. Il ruolo della glia è una delle principali aree di indagine nella fisiopatologia del glaucoma, poiché queste cellule di supporto non neuronale sono essenziali per la sopravvivenza dell'RGC5 ma subiscono cambiamenti fenotipici nella malattia che possono diminuire il comportamento benefico6 o addirittura guidare l'adozione di fenotipi deleteri7. Sebbene il termine glia comprenda una serie di tipi di cellule specializzate in tutto il SNC8, queste possono essere ampiamente suddivise in due categorie: quelle che condividono un lignaggio di sviluppo con i neuroni e forniscono supporto trofico, energetico e strutturale9, e quelle con un'origine mieloide, che svolgono compiti specializzati di sorveglianza e risposta immunitaria10. I rappresentanti di entrambe le categorie - astrociti e cellule di Müller nei primi, microglia nelle seconde - popolano la retina5 e subiscono importanti cambiamenti nel glaucoma che sollevano domande significative sul loro ruolo nella progressione della malattia e nella sopravvivenza alla RGC11.

Gli sforzi per rispondere a queste domande sono ostacolati in parte dalle caratteristiche intrinseche della glia retinica che presentano sfide sia per la ricerca in vivo che per quella in vitro. A differenza dei neuroni, sono relativamente silenziosi elettricamente, rendendo approcci come l'ERG che consentono la valutazione funzionale delle RGC e dei fotorecettori in vivo inadatti per studiare i cambiamenti nella funzione e nel comportamento gliale. E mentre sono disponibili modelli inducibili12 espontanei 13 di glaucoma, molto rimane sconosciuto sui cambiamenti nella glia nei primi momenti della malattia, che possono precedere la perdita rilevabile di RGC, un problema aggravato dalla variabilità penetranza dello stato della malattia in molti di questi modelli. Inoltre, l'evidenza del glaucoma, sia clinico che sperimentale, suggerisce contributi da parte delle cellule immunitarie periferiche che possono essere difficili da disambiguare da quelli della microglia, nonostante gli indicatori che possano agire in "direzioni" diverse per influenzare la progressione della malattia14,15.

Le sfide abbondano anche nello studio della glia retinica in vitro. Sebbene l'isolamento e la coltura degli astrociti16,17 e della microglia18 dal cervello siano ben stabiliti, lavori recenti evidenziano un'ampia eterogeneità gliale tra le regioni del SNC, specialmente negli astrociti19, e i fenotipi presenti in una regione potrebbero non essere presenti nella glia di un'altra, come la retina20,21. Tuttavia, isolare direttamente gli astrociti retinici e le microglia per lo studio è particolarmente impegnativo, poiché entrambi i tipi di cellule sono relativamente scarsi, ciascuno dei 6,5 milioni di cellule stimate nella retina del topo 22,23,24. Inoltre, a differenza dei neuroni, le glia sono altamente plastiche e si adattano rapidamente ai cambiamenti drammatici dell'ambiente circostante 16,18,25; Di conseguenza, i comportamenti osservati in queste cellule in vitro possono rappresentare adattamenti specifici al loro nuovo ambiente piuttosto che modelli fenotipici che sarebbero tipicamente osservati in salute o malattia. Dati i limiti sia della sperimentazione in vivo che della coltura primaria della glia retinica, abbiamo cercato un approccio intermedio - espianti retinici - in cui glia, RGC e altri elementi della retina sono conservati in situ in un contesto ex vivo. Rispetto ai modelli in vivo, questo approccio offre un andamento temporale sperimentale abbreviato26, consente la manipolazione sperimentale diretta della glia retinica27 ed evita l'influenza potenzialmente confondente dell'infiltrazione delle cellule immunitarie periferiche14. Al contrario, a differenza della coltura cellulare primaria, l'interruzione dell'ambiente extracellulare è minima e la glia rimane intatta e morfologicamente riconoscibile, ovviando alle sfide associate alla ricrescita e all'identificazione di queste cellule dopo l'interruzione enzimatica e meccanica16,25.

Rispetto alle metodologie di espianto retinico precedentemente descritte, questo approccio enfatizza l'attenzione all'affidabilità tecnica, alla riproducibilità e alla massimizzazione della "facilità d'uso" dell'approccio per migliorare l'accessibilità26,28. Nelle comunicazioni personali con altri ricercatori, abbiamo scoperto che le sfide tecniche associate alla gestione della retina viva rappresentano un grosso ostacolo per molti che cercano di utilizzare gli espianti, mentre il mantenimento della retina espiantata in coltura è stato relativamente semplice per i gruppi con strutture di coltura cellulare appropriate. Pertanto, questo protocollo include una serie di innovazioni volte a ridurre la curva di apprendimento associata all'isolamento della retina e consentire ai ricercatori di iniziare più rapidamente a raccogliere dati sperimentali. Infine, sebbene abbiamo posto particolare enfasi sul potenziale di questo modello di espianto per studiare il comportamento della glia retinica e caratterizzarlo principalmente con la microscopia a immunofluorescenza, anche altri tipi e strutture cellulari retiniche sono in gran parte conservati e le retine espiantate rimangono suscettibili di un'ampia gamma di tecniche investigative aggiuntive.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso lo Schepens Eye Research Institute (Protocollo # 2022N000030, approvato il 3/4/2025). Gli animali sono stati gestiti in conformità con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.

NOTA: La Figura 1 mostra i passaggi chiave nell'isolamento della retina viva dall'occhio di topo enucleato.

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Figura 1: Una rappresentazione schematica dei passaggi chiave nell'isolamento della retina viva dall'occhio di topo enucleato. I numeri dei passaggi corrispondenti dei passaggi chiave sono riportati in cerchi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione

  1. Disinfettare una pipetta da 1 ml e un paio di pinze angolate e posizionarle nella cabina di biosicurezza. Questi saranno necessari nella sezione 3 del protocollo.
  2. Modificare una pipetta di trasferimento tagliando perpendicolarmente l'albero a circa 2 cm sotto il serbatoio, dove il foro è più largo, per accorciare la pipetta e allargare l'apertura. Assicurati un taglio netto su cui la retina non si impigli.
    NOTA: Questo strumento può essere conservato per il riutilizzo se pulito e risciacquato con acqua sterile tra un utilizzo e l'altro.
  3. Preparare 50 ml di terreno di espiantaggio in modo asettico in una cabina di biosicurezza integrando 47,5 ml di terreno neurobasale con 500 μl di integratore N-2, 1 ml di integratore B-27, 500 μl di glutamax e 500 μl di miscela penicillina-streptomicina (concentrazione finale di 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina).
    NOTA: Preparare nuovi terreni di espianti per ogni serie di isolamenti; i terreni in eccesso possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana e utilizzati per la sostituzione dei terreni, se necessario. Dopo l'apertura, sostituire il terreno neurobasale inutilizzato dopo 1 mese. N-2 e B-27 devono essere conservati congelati come aliquote monouso, evitando cicli di congelamento-scongelamento.
  4. In una cappa di biosicurezza, preparare asetticamente una o più piastre di coltura aggiungendo un inserto in ciascun pozzetto da utilizzare, maneggiando tramite i "rebbi" che emergono dal bordo dell'inserto per evitare di toccare le superfici che entreranno in contatto con i terreni di coltura.
    1. Aggiungere 1 mL di terreno di espiantazione all'inserto, seguito da altri 3 mL aggiunti al pozzetto stesso. Aggiungere 2-3 ml di acqua sterile a tutti i pozzetti inutilizzati per controllare l'evaporazione.
    2. Trasferire le piastre nell'incubatore a 37 °C con CO2 al 5% per equilibrarle circa 30 minuti prima dell'isolamento tissutale.
  5. Preparare i quadrati filtranti per creare un substrato per la stabilizzazione e il trasferimento dei tessuti. Estrarre il filtro da un kit di filtrazione per bottiglie tagliando la periferia del materiale con un rasoio o un bisturi. Fare attenzione a non ferire o danneggiare il filtro a causa di piegature o strappi.
    NOTA: La rimozione del serbatoio di plastica trasparente utilizzando un rasoio robusto per tagliare la plastica opaca più malleabile nel punto in cui l'adattatore filettato incontra il serbatoio semplifica il processo di estrazione, ma è necessario prestare ulteriore attenzione per evitare lesioni.
    1. Dopo che il filtro è stato staccato mediante taglio, utilizzare una pinza per estrarlo. Notare l'orientamento del filtro durante e dopo l'estrazione; Il lato opaco (che è rivolto verso il serbatoio) deve essere in posizione verticale per il montaggio della retina nel passaggio 2.16 per il trasferimento.
    2. Tagliare il filtro in quadratini di circa 7 mm × 7 mm; Ogni espianto di retina richiederà un quadrato. Immergere i quadrati in acqua sterile in una capsula di Petri da 100 mm per almeno 20 minuti.
      NOTA: I quadrati del filtro possono rimanere immersi in acqua sterile fino a 1 settimana prima dell'uso. A causa della tendenza dei quadrati del filtro a sviluppare alti livelli di carica statica prima dell'immersione, preparare solo il numero di quadrati necessario. Il materiale filtrante secco rimanente può essere conservato a tempo indeterminato in una piastra Petri sterile da 100 mm per un uso successivo.

2. Isolamento e montaggio

  1. Eutanasia del topo con un metodo approvato prima di confermare con un approccio secondario; questo studio ha utilizzato l'asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale. Enucleare entrambi gli occhi con una pinza curva a punta smussata e metterli in PBS sterile.
  2. Preparare l'area di lavoro riempiendo una piastra di Petri da 100 mm con PBS sterile e posizionandola sul tavolino del cannocchiale di dissezione binoculare.
    1. Tagliare una striscia larga 1 cm di salvietta da laboratorio e immergerla nel piatto per fungere da substrato stabilizzante.
    2. Trasferire un occhio nella vaschetta di dissezione, lasciare l'altro nel PBS e mettere su ghiaccio o in frigorifero a 4 °C.
      NOTA: A causa della sensibilità della retina all'intervallo post-mortem prolungato, si consiglia di sopprimere un topo alla volta.
  3. Posizionare e immobilizzare l'occhio. Usa una pinza per manovrare l'occhio sulla salvietta da laboratorio sommersa, che aiuterà la stabilizzazione.
    1. Identificare un punto di tenuta appropriato, afferrarlo con una pinza angolata e ruotare delicatamente l'occhiello in modo che sia tenuto lateralmente o, idealmente, dal basso. Assicurarsi che l'asse antero-posteriore (cioè dalla cornea al nervo ottico) sia orizzontale. Questo orientamento migliora la visibilità e riduce al minimo la pressione sull'occhio durante la dissezione.
      NOTA: Se possibile, afferrare il tessuto extraorbitale per evitare di perforare o schiacciare l'occhio, favorendo il muscolo o la congiuntiva rispetto al nervo ottico o al grasso.
  4. Mantenendo la presa con la pinza angolata, assicurarsi che l'occhio sia completamente immerso e immobilizzato in modo sicuro. Praticare un'incisione con la punta del bisturi #11 parallela e circa 0,5 mm posteriormente al limbus, dove la cornea passa alla sclera.
    NOTA: Questa incisione dovrebbe essere abbastanza grande da adattarsi alla punta di una lama delle forbici a molla. Poiché l'affilatura della punta del bisturi è essenziale per perforare il globo in modo pulito, cambiare la lama ogni due retine.
    1. Inserisci una lama delle forbici a molla all'interno del globo e inizia a tagliare circonlimbamente intorno all'occhio, riposizionando delicatamente l'occhio secondo necessità usando una pinza.
      NOTA: Questo taglio deve essere il più dritto e parallelo possibile al limbus; Per riposizionare l'occhio può essere necessario posare le forbici e utilizzare un paio di pinze con ciascuna mano. Una volta esposta, mantenere la retina sommersa durante la dissezione.
  5. Una volta che il taglio ha circoscritto l'occhio, rimuovere con cautela il segmento anteriore e la lente, quindi ruotare l'oculare verso l'alto per facilitare l'ispezione visiva e la rimozione del vitreo. Se un pezzo esteso di nervo ottico rimane attaccato, tagliarlo a una lunghezza più corta (1-2 mm) per facilitare questa operazione.
  6. Ispezionare la retina per danni visibili e la camera vitreale per detriti, come cellule pigmentate dall'RPE o coroidi che potrebbero essere entrate durante la rimozione del segmento anteriore. Utilizzare una pinza angolata per immobilizzare l'oculare in questa posizione.
    NOTA: Per ottenere risultati ottimali, i detriti nella camera vitreale devono essere rimossi e i residui vitrei e aderenti del corpo ciliare alla periferia della retina devono essere ridotti al minimo. Questo può essere un processo impegnativo e ulteriori note possono essere trovate nelle sezioni "Riconoscimento e risoluzione dei problemi delle lesioni meccaniche" e "Lesioni metaboliche" dei Risultati rappresentativi.
    1. Utilizzare la pipetta di trasferimento modificata per lavare la camera vitreale con PBS per rimuovere piccoli detriti di particolato, evitando bolle d'aria mantenendo la punta della pipetta sotto la superficie del liquido e mantenendo una quantità adeguata di PBS nel bulbo del serbatoio.
    2. Rimuovere i detriti più grandi con un pennello per acquerello fine, riducendo al minimo il contatto con la superficie retinica. Se necessario, rimuovere i detriti più persistenti con una pinza a punta fine; Tuttavia, evitare il contatto diretto delle punte degli strumenti metallici con la retina per evitare danni.
  7. Dopo aver rimosso i detriti visibili, sciacquare ripetutamente (3-5 volte) la camera vitreale con PBS dalla pipetta di trasferimento, come descritto sopra. Questo rimuoverà il vitreo leggermente aderente che potrebbe rimanere dopo la rimozione dei detriti. Utilizzare la spazzola fine per sondare delicatamente la camera, in particolare vicino alla periferia se rimangono elementi del corpo ciliare. Sebbene il vitreo sia otticamente trasparente, agirà come un trascinamento sulle fibre della spazzola e può essere rilevato in questo modo.
    NOTA: Un sottile strato residuo di vitreo sulla retina non sembra avere un impatto negativo sull'isolamento o sul mantenimento della retina ex vivo, ma la presenza di quantità significative alla periferia della retina, spesso associata a strutture residue del corpo ciliare, può causare il ripiegamento retinico e la perdita di campione se non rimossa.
    1. Se rimangono sacche significative di vitreo, utilizzare lo spazzolino per rimuoverlo spazzando delicatamente verso l'esterno verso la periferia, assicurandosi che se le fibre dello spazzolino entrano in contatto con la retina, lo facciano da un angolo poco profondo e seguano lo spazzolino, tirando piuttosto che spingere il vitreo fuori dalla camera.
      NOTA: La rimozione del vitreo richiede una manipolazione particolarmente attenta per evitare danni alla retina che potrebbero non essere visibili macroscopicamente; i consigli su come riconoscere ed evitare questo danno si trovano nelle sezioni "Riconoscimento e risoluzione dei problemi delle lesioni meccaniche" e "Lesioni metaboliche" dei Risultati rappresentativi.
  8. Una volta che la camera vitreale è stata ripulita dai detriti e dai resti vitrei minimi, separare delicatamente la retina esterna dalla conchiglia oculare continuando a stabilizzare il campione con una pinza angolata. Evitare di danneggiare la testa del nervo ottico e lasciare intatta questa struttura per ancorare la retina.
    1. Prendi un paio di pinze, tenendole in posizione chiusa con le punte che si toccano, e inseriscile delicatamente tra la retina e la coroide, utilizzando uno spazio preesistente rispetto alla manipolazione precedente, se possibile. Usa le braccia piatte del forcipe, piuttosto che le punte, per allargare la tasca tra la retina e la coroide fino a quando queste strutture possono essere completamente separate.
      NOTA: Enfatizzare i movimenti laterali, piuttosto che spingere le punte, per espandere lo spazio tra la retina e la coroide. Ruotare delicatamente la pinza durante questi movimenti può migliorare la separazione riducendo allo stesso tempo lo stress dovuto all'attrito tra pinza e tessuto.
  9. Dopo aver separato la retina esterna dalla coroide, continuare a stabilizzare il campione utilizzando un secondo paio di pinze per tirare l'oculare - sclera, coroide, ecc. - verso il basso. Se la retina è stata separata con successo, dovrebbe rimanere in posizione, legata alla testa del nervo ottico, mentre la conchiglia oculare può essere tenuta da un singolo paio di pinze. Se la retina preme verso il basso con l'oculare, continuare a sondare delicatamente e separare i punti di connessione diversi dalla testa del nervo ottico.
  10. Con la retina ancorata alla testa del nervo ottico, continuare a immobilizzare il tessuto e utilizzare il secondo paio di pinze per raggruppare la coppa oculare sotto la testa del nervo ottico.
    1. Verificare che nessuna parte della periferia retinica sia bloccata in una posizione ripiegata a causa dell'eccesso di vitreo nell'angolo tra la retina e qualsiasi corpo ciliare residuo. Se necessario, lavare la camera con PBS utilizzando la pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali detriti aggiuntivi e utilizzare delicatamente lo spazzolino per srotolare il tessuto ed eliminare il vitreo in eccesso, facendo attenzione a non tirare eccessivamente il tessuto.
  11. Con la retina esposta da entrambi i lati, utilizzare le forbici a molla per eseguire una serie di tagli di sollievo, distanziati di circa 90° l'uno dall'altro, che si estendono in linea retta dalla periferia verso la testa del nervo ottico, fermandosi a circa 1 mm dal centro. Ciò riduce al minimo la transezione degli assoni delle cellule gangliari retiniche nella retina, migliorando la qualità degli espianti coltivati.
  12. Tenendo in posizione il tessuto sommerso, rimuovere delicatamente la salvietta da laboratorio utilizzando una pinza per estrarla lateralmente dal tessuto prima di rimuoverla dal piatto. Evitare il contatto con la retina per evitare l'adesione alla salvietta e la possibile perdita di campione.
  13. Quindi, continua a tenere il tessuto e usa le forbici a molla per recidere il nervo ottico direttamente sotto la retina, quindi rimuovi il resto dell'oculare dal piatto.
  14. Una volta isolata la retina dal resto dell'occhio, riempire una piastra di Petri da 35 mm con PBS e utilizzare una pinza per posizionare un quadrato filtrante nella parte inferiore con il lato opaco più ruvido rivolto verso l'alto. Fare attenzione a evitare di piegare il filtro, in quanto potrebbe ostacolare l'uso del filtro come substrato per spostare la retina.
  15. Aspirare delicatamente la retina con la pipetta di trasferimento e trasferirla con cura nel piatto da 35 mm. Manovrare la retina con lo spazzolino per assicurarsi che la superficie interna della retina sia in posizione verticale e che il tessuto poggi direttamente sopra il quadrato del filtro.
  16. Aspirare lentamente il PBS dalla capsula con la pipetta di trasferimento per abbassare la retina sul filtro. Mettere in pausa, se necessario, per regolare nuovamente il tessuto prima di continuare fino a quando la retina non si è depositata sul filtro.
    NOTA: L'aspirazione rapida può provocare un improvviso movimento laterale della retina, con conseguente danno o perdita di tessuto. L'intera retina deve poggiare sul quadrato per evitare danni; tuttavia, se la retina si deposita in una posizione problematica, la PBS può essere aggiunta nuovamente alla parabola fino a quando la retina non viene risospesa e il montaggio può essere ritentato.
  17. Una volta che la retina si è depositata sul filtro, usa lo spazzolino per srotolare la retina periferica che potrebbe essersi ripiegata. Bilanciare attentamente il livello di PBS in modo che la retina non si sposti facilmente dal filtro, assicurandosi che ne rimanga abbastanza in modo che il campione non si asciughi e lo spazzolino possa muoversi agevolmente senza danneggiare la retina interna.
  18. Ancora una volta ispezionare la retina alla ricerca di detriti. Per evitare danni, pulire la retina senza maneggiarla direttamente utilizzando la pipetta di trasferimento per gocciolare PBS sulla retina da circa 1 cm sopra il tessuto. Questo dovrebbe eliminare tutti i detriti rimanenti, ma se viene aggiunta troppa PBS al piatto, la retina potrebbe galleggiare di nuovo. In tal caso, eseguire nuovamente l'aspirazione per rimontare il tessuto.
    NOTA: I campioni "fittizi" possono essere generati trasferendo le retine su una piastra a 24 pozzetti per la fissazione, il blocco/permeabilizzazione e la colorazione degli anticorpi come descritto altrove21. Questi controlli fittizi sono utili per la risoluzione dei problemi di lesioni meccaniche alla retina che possono verificarsi durante l'isolamento.

3. Trasferimento ai terreni di coltura e manutenzione

  1. Chiudere il coperchio della capsula da 35 mm per il trasporto alla cappa di biosicurezza, mantenendo la capsula in piano per evitare di staccare la retina dal filtro. In tal caso, rimontare come sopra.
  2. Posizionare la capsula chiusa da 35 mm contenente la retina nella cabina di biosicurezza, facendo attenzione a non toccare alcuna attrezzatura o superficie all'interno della cabina prima di disinfettare o cambiare i guanti.
  3. Decontaminare i guanti con etanolo e/o sostituirli, quindi spostare la piastra a 6 pozzetti precaricata con il terreno di espianto dall'incubatore alla cappa di biosicurezza. Eseguire i passaggi 3.4 e 3.5 all'interno della cabina di biosicurezza, utilizzando gli strumenti posizionati durante il passaggio 1.1.
  4. Rimuovere il coperchio del piatto da 35 mm contenente la retina e utilizzare una pinza angolata per sollevare con cautela il quadrato del filtro senza toccare direttamente la retina. Rimuovere il coperchio della piastra a 6 pozzetti e posizionare il filtro al centro dell'inserto di un pozzetto appropriato, quindi abbassarlo lentamente nel supporto. La retina si staccherà dal filtro durante questo passaggio e galleggerà appena sotto l'interfaccia aria-liquido.
  5. Una volta che la retina e il filtro si sono separati, allontanare lentamente il filtro dalla retina e rimuoverlo dal supporto. Utilizzando la pipetta da 1 mL, rimuovere 500 μL di terreno dall'inserto per garantire che la retina sia piatta intrappolandola tra il pavimento dell'inserto e l'interfaccia aria-liquido.
  6. Riposizionare il coperchio sulla piastra e rimetterla nell'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5%, avendo cura di mantenere la retina vicino al centro del pozzetto. È possibile conservare fino a 6 retine in una singola piastra.
    NOTA: Se si conservano gli espianti per 24 ore o meno, possono essere lasciati nell'incubatrice fino alla fine dell'esperimento. Se conservato per periodi più lunghi, si raccomanda il 50% di cambi di terreno dopo 1 giorno in vitro e successivamente a giorni alterni.

4. Fissazione per l'immunocolorazione (opzionale)

  1. Se si esegue l'immunocolorazione, fare riferimento ai seguenti passaggi per la fissazione; Mentre l'immunocolorazione può essere eseguita utilizzando parametri precedentemente dettagliati per le retine montate piatte21, la fissazione della retina espiantata richiede considerazioni specifiche.
  2. Rimuovere gli inserti per colture cellulari con espianti e terreni dalla piastra di coltura a 6 pozzetti e posizionarli su una superficie non porosa (come il coperchio di plastica della piastra di coltura) che può essere smaltita correttamente dopo il fissaggio, poiché gli inserti sono leggermente porosi e piccole quantità di fissativo passeranno attraverso questa superficie sottostante.
  3. Rimuovere delicatamente i terreni di coltura dagli inserti, quindi aggiungere 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% a ciascuno. Lasciare che le retine si fissino per 15 minuti in una cappa aspirante, quindi rimuovere il PFA e smaltirlo secondo la politica istituzionale.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è pericolosa e un precursore della formaldeide, un noto cancerogeno. Prestare attenzione ed eseguire il fissaggio in una cappa aspirante con le dovute precauzioni.
  4. Lavare le retine 3 volte (per 5 minuti ciascuna) con PBS per rimuovere il PFA, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento modificata per trasferire le retine in PBS in pozzetti individuali in una piastra a 24 pozzetti per il blocco, la permeabilizzazione e l'immunocolorazione come descritto altrove21. Smaltire la plastica contaminata da PFA (puntali per pipette, inserti e superficie non porosa utilizzata durante il fissaggio) secondo la politica istituzionale.
    NOTA: La pipetta di trasferimento può essere conservata per trasferire le retine fissate e colorate su un vetrino per il montaggio e l'imaging. Sebbene non avrebbe dovuto avere un contatto diretto con il PFA, si consiglia di utilizzare pipette di trasferimento diverse per la manipolazione di tessuti vivi e fissati.

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Risultati

Su scala macroscopica, le retine espiantate rimangono sostanzialmente invariate sia a 1 che a 3 giorni, anche se da quest'ultimo momento diventano relativamente fragili, richiedendo un'attenta manipolazione prima della fissazione o di altri endpoint sperimentali. Le retine devono essere relativamente piatte, senza ripiegamento (che può causare un'interruzione localizzata della diffusione dell'ossigeno e dei nutrienti) e devono essere sospese nel terreno tra l'interfaccia aria-liquido e l'inserto di coltura cellulare. Ent...

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Discussione

Gli approcci di coltura organotipica32 come gli espianti retinici sfruttano la flessibilità sperimentale e i rapidi tempi di risposta delle colture cellulari, preservando gran parte del contesto in situ degli studi in vivo , rendendoli una potente via per studiare le interazioni complesse tra i tipi di cellule. Presentiamo questo protocollo come un punto di ingresso per i ricercatori che possono avere una notevole esperienza con l'occhio e sentir...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

M.A.M. è stato sostenuto da NIH/NEI R01EY035312, dal Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award, dalla Melza M. e Frank Theodore Barr Foundation, dalla Robert M. Sinskey, MD, Foundation, dalla Ruettgers Family Charitable Foundation e dalla B.L. Manger Foundation. P.F.C. è stato supportato da NIH/NEI 2T32EY007145. Questo lavoro è stato reso possibile anche da un NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176.  La Figura 1 è stata generata con Biorender. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Nasir Uddin per il feedback sul manoscritto e il Dr. Qiurong Zhu per l'assistenza e il supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#11 Lame per bisturiBard-Parker3,71,311
Pipetta da 1 ml ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
Piastra di Petri da 100 mmFalcon351029
16% ParaformaldeideTed Pella Inc18.505Diluito al 4% per il fissaggio
Piastra a 24 pozzettiFalcon353047Per fissaggio, blocco e incubazione di anticorpi
piastra Petri da 35 mmFalcon351008
kit di piastre e inserti a 6 pozzettiGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-545-152Diluizione 1:800
Alexa Fluor 594 Asino anti-Rat IgG (H+L) Altamente adsorbitoInvitrogenA-21209Diluizione 1:800
Alexa Fluor 594-F(ab')2 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-586-150Diluizione 1:800
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.706-605-148Diluizione 1:800
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Asino Anti-pollo IgY (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.703-606-155Diluizione 1:800
Pinze angolate ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anticorpo anti-Brn3a (topo)ChemiconMAB1585diluizione 1:200
Anticorpo anti-CD206 (ratto)BioradMCA2235diluizione 1:200
Anticorpo anti-GFAP (pollo)Abcamab4674diluizione 1:1000
Anti-Iba1 anticorpo (coniglio)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-19741Diluizione 1:500
Anticorpo Anti-Tmem119 (cavia)Synaptic Systems400 004Diluizione 1:500
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Pinza curva smussata ("Extra Fine Graefe)FST11152-10
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA9647Utilizzare l'1% p/v per il blocco e l'incubazione degli anticorpi
Kit filtro (0,2 & micro; m aPES, filtro per bottiglia da 150 mL) FisherscientificPennello FB12566508
fine, misura 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Salviette da laboratorio (Salviette Kim) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, meno rosso fenoloGibco (Thermofisher)12349015
Siero d'asino normaleJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.017-000-121Utilizzare al 10% per il blocco e l'incubazione di anticorpi
Penicillina-StreptomicinaGibco (Thermofisher)15140122
Punte per pipette, 1000 &; LTipOne1126-7810
Forbici a molla ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Acqua sterile ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
PBS a filtro sterileGibco10010-023
Pinza dritta ('mini')FST / Dumont11200-14
Pipetta di trasferimento, 5,8 mLfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. APUtilizzare allo 0,5% per il blocco e l'incubazione degli anticorpi

Riferimenti

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