Questo protocollo delinea un metodo per indurre la fibrosi polmonare nei topi attraverso la somministrazione ripetuta di bleomicina per via orofaringea, producendo caratteristiche patologiche molto simili a quelle della fibrosi polmonare idiopatica.
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Articolo metodologico
Modello murino raffinato di fibrosi polmonare idiopatica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli animali svolgono un ruolo cruciale nella comprensione dei meccanismi della malattia e nella sperimentazione di potenziali approcci terapeutici. Tuttavia, i modelli murini tradizionali di fibrosi polmonare idiopatica (IPF) che si basano su un'iniezione di bleomicina a dose singola non riescono a replicare accuratamente le complesse caratteristiche patologiche osservate nei pazienti con IPF. Questo studio introduce un metodo migliorato che utilizza due successive somministrazioni orofaringee di bleomicina nei topi, che imita più efficacemente la progressione dell'IPF. Questo nuovo protocollo induce cambiamenti patologici chiave, come la formazione di cisti a nido d'ape, focolai fibroblastici e bronchiolizzazione dell'epitelio alveolare, molto simili all'istopatologia osservata nell'IPF umana. Utilizzando questo modello, siamo in grado di catturare i cambiamenti fibrotici progressivi in un arco di tempo più lungo, il che fornisce informazioni più affidabili sulla patogenesi dell'IPF. Inoltre, questo approccio a due dosi offre diversi vantaggi rispetto ai modelli convenzionali a dose singola, tra cui una migliore riproducibilità e una rappresentazione più robusta dello sviluppo della malattia. Questo metodo migliora la nostra capacità di studiare i meccanismi alla base dell'IPF e di valutare potenziali interventi terapeutici. Il protocollo proposto offre un progresso significativo nella ricerca preclinica e fornisce uno strumento prezioso per studiare sia la biologia della fibrosi polmonare che l'efficacia di nuovi trattamenti.
Introduzione
La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia polmonare interstiziale progressiva e fatale caratterizzata da danni irreversibili al parenchima polmonare, che porta a sintomi debilitanti come la dispnea e un grave declino della qualità della vita 1,2. Istologicamente, l'IPF si manifesta come polmonite interstiziale abituale (UIP), caratterizzata da fibrosi spazialmente eterogenea, bronchiolizzazione dell'epitelio alveolare e focolai fibroblastici3. Nonostante la sua importanza clinica, la complessa patogenesi dell'IPF e le limitate opzioni terapeutiche evidenziano l'urgente necessità di solidi modelli sperimentali per far progredire la comprensione meccanicistica e lo sviluppo del trattamento.
I modelli esistenti di bleomicina a dose singola, sebbene ampiamente utilizzati4, non riescono a ricapitolare i principali segni patologici dell'IPF umana, come i baccelli di cellule basali KRT5+ 5,6,7 e i focolai fibroblastici persistenti, e mostrano fibrosi autorisolutiva8. La somministrazione ripetuta di bleomicina migliora la fedeltà patologica 9,10 ma è ostacolata dalla complessità tecnica, dall'elevata mortalità e dai cicli di modellazione prolungati11,12. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello murino ottimizzato con somministrazione di bleomicina orofaringea ripetuta due volte13. Questo approccio combina la completezza patologica dei modelli di lesioni ripetitive 9,10 con i vantaggi tecnici della somministrazione non invasiva, ottenendo una progressione fibrotica sostenuta oltre i 60 giorni mantenendo una bassa mortalità. Imitando da vicino la patologia umana dell'IPF, compresa la formazione di cisti a nido d'ape e la fibrosi persistente, il nostro metodo fornisce una solida piattaforma per indagare i meccanismi della malattia e valutare gli interventi terapeutici.
Il protocollo è particolarmente adatto per i ricercatori che necessitano di modelli fibrotici cronici senza complicanze chirurgiche. Offre vantaggi significativi rispetto agli approcci esistenti in termini di riproducibilità, rilevanza clinica e conformità alle linee guida sul benessere degli animali. Basandosi su tecniche orofaringee consolidate, questi perfezionamenti fanno progredire la ricerca preclinica sull'IPF colmando le lacune critiche tra i modelli sperimentali e la patologia delle malattie umane.
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Protocollo
Qui sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 4 e 6 mesi. Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto i topi sono stati condotti in conformità con il protocollo animale approvato dal Laboratory Animal Research Center dell'Università Sun Yat-sen (numero di approvazione SYSU-IACUC-MED-2021-B0076). Lo studio ha aderito alle linee guida per la cura degli animali delineate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Sun Yat-sen.
1. Preparazione per l'esperimento
- Reagenti: Acquisire polvere di bleomicina, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e isoflurano.
- Attrezzatura: Acquisire puntali per pipette (200 μl), pipetta, supporto per iniezione tracheale, scatola per puntali per pipette da 1 ml e batuffoli di cotone imbevuti di alcol.
2. Procedura sperimentale
- Preparare una soluzione madre di bleomicina a una concentrazione di 1,5 mg/mL utilizzando PBS come solvente. Aliquotare 600 μL della soluzione madre in provette per microcentrifuga da 2 mL e diluirla con 1200 μL di PBS per ottenere una diluizione di 3 volte (concentrazione finale: 0,5 mg/mL).
NOTA: La soluzione madre di bleomicina è stata conservata a -20 °C ed è rimasta stabile per un massimo di 3 mesi. - Pesare ciascun topo prima della somministrazione orofaringea. Calcolare il volume richiesto di soluzione di bleomicina in base al peso corporeo del topo. Il dosaggio è di 1,5 mg/kg e il volume di iniezione (in μL) è uguale al peso del topo (in grammi) moltiplicato per 3 (a causa della diluizione di 3 volte).
- Posizionare diversi batuffoli di cotone imbevuti di alcol sul fondo di una scatola di puntali per pipette da 1 ml. Aggiungere 1 mL di liquido isoflurano sul batuffolo di cotone posto nella parte inferiore della scatola del puntale della pipetta. Posizionare immediatamente il mouse all'interno della scatola del puntale della pipetta per indurre l'anestesia. Monitorare il mouse fino a quando la sua respirazione non rallenta, indicando un'anestesia adeguata, quindi rimuoverlo immediatamente.
NOTA: Durante l'induzione dell'anestesia con isoflurano in una scatola sigillata per pipette, i topi mostrano una caratteristica transizione respiratoria dalla tachipnea iniziale alla successiva bradipnea. La rimozione immediata all'inizio della bradipnea è fondamentale per prevenire il sovradosaggio di anestetico. La rimozione prematura durante la tachipnea può portare a un'eccitazione prematura durante la somministrazione di bleomicina orofaringea. - Fissare il mouse sul supporto per iniezione tracheale agganciando i denti. Estrarre delicatamente la lingua con una pinza e tenerla con il pollice e l'indice (evitare di usare le pinze per ridurre al minimo il disagio). Copri il naso del mouse con il dito medio per garantire una consegna corretta.
- Utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl, aspirare il volume calcolato di soluzione diluita di bleomicina, quindi somministrare lentamente la soluzione di bleomicina nell'orofaringe del topo senza inserire in profondità il puntale della pipetta. Questo approccio riduce al minimo il danno tissutale e garantisce un'erogazione efficace.
- Ascolta un gorgoglio distinto, che indica l'ingresso riuscito della soluzione nei polmoni. Una volta cessato il suono, rimuovi il mouse dal supporto e posizionalo su un termoforo per il recupero.
NOTA: Un caratteristico gorgoglio funge da indicatore affidabile del successo della somministrazione di bleomicina nell'orofaringe. L'assenza di questo segnale acustico suggerisce una deposizione esofagea, a quel punto il soggetto è escluso dalle successive procedure sperimentali a causa della mancata somministrazione. - Ripetere la procedura di somministrazione orofaringea 7 giorni dopo la dose iniziale.
3. Raccolta dei tessuti
- Eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale nei punti temporali predeterminati (14 e 60 giorni dopo la somministrazione finale di bleomicina).
- Eseguire una sternotomia della linea mediana per esporre la cavità toracica. L'appendice atriale sinistra è stata incisa chirurgicamente. Successivamente, perfondere i polmoni attraverso il ventricolo destro con 10 ml di PBS ghiacciato per rimuovere le cellule del sangue circolanti.
- Incannulare la trachea e gonfiare i polmoni con paraformaldeide (PFA) all'1% per garantire la completa fissazione dei tessuti.
- Asportare i polmoni e immergerli in PFA all'1% per 1 ora a temperatura ambiente per consentire una corretta fissazione.
- Per la lavorazione dei tessuti, sciacquare i fazzoletti fissati in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Disidratare i tessuti in sequenza utilizzando una serie di etanolo graduato: 70% etanolo, 95% etanolo ed etanolo 100%, garantendo la completa disidratazione ad ogni fase. Dopo la disidratazione, eliminare i tessuti in xilene per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, incorporare i tessuti in cera di paraffina fusa a 60 °C per almeno 2 ore, o fino a completa infiltrazione. Infine, sezionare i tessuti incorporati a uno spessore di 7 μm utilizzando un microtomo rotante.
4. Valutazione del campione
- Eseguire l'ematossilina e l'eosina (H&E) e la colorazione tricromica di Masson per valutare la gravità della fibrosi.
- Per la colorazione H&E, eseguire la deparaffinazione sequenziale dello xilene per 5 minuti, 2 volte e la reidratazione graduata dell'etanolo con etanolo al 100% per 5 minuti, seguita da etanolo al 100% per 1 minuto, quindi etanolo al 95% per 1 minuto e infine etanolo all'80% per 1 minuto. Risciacquare con acqua distillata. Tinteggiare con ematossilina per 5 minuti, quindi risciacquare con acqua di rubinetto 3 volte e immergere per 5 minuti. Quindi, eseguire l'immersione con etanolo all'80% per 1 minuto e la controcolorazione con eosina per 45 s. Eseguire la disidratazione con etanolo graduato utilizzando etanolo al 95% per 5 immersioni, quindi con etanolo al 100% per 5 immersioni e, infine, immergere in etanolo al 100% per 2 minuti. Cancellare con xilene immergendo per 5 minuti, 2 volte e poi eseguire il montaggio del balsamo neutro.
- Per la colorazione di Masson, dopo la deceratura come fatto al punto 4.1.1, sciacquare i vetrini in ddH2O e colorare con Ponceau S-fuchsin per 5 s, seguito da una soluzione acida debole allo 0,2% (acido acetico/acqua) risciacquare per 1 minuto. Eseguire la differenziazione in soluzione di acido fosfomolibdico per 5 minuti con successivo risciacquo acido debole per 1 minuto, seguito da controcolorazione blu all'anilina per 1 minuto e lavaggio finale con acido debole per 1 minuto. Disidratare le sezioni attraverso etanolo graduato iniziando con etanolo al 95% per 2-3 s seguito da etanolo assoluto per 5-10 s, 2x. Trasparente in xilene e montare con resina.
- Condurre la colorazione immunoistochimica (IHC) e immunofluorescenza (IF) per marcatori come α-SMA, KRT5 e ΔN-p6314,15 per valutare il rimodellamento fibrotico ed epiteliale.
- Per la colorazione immunoistochimica, eseguire la deceratura e la reidratazione delle sezioni di tessuto incluse in paraffina prima del recupero dell'antigene in un tampone citrato di sodio 0,1 M bollente (pH 6,0) contenente lo 0,5% di Tween-20 per 90 s. Estinguere l'attività endogena della perossidasi con il 3% di H2O2, seguita dalla permeabilizzazione della membrana con Triton X-100/PBS allo 0,5% e dal blocco non specifico. Incubare in anticorpo primario a 4 °C per una notte, seguito da 1 ora di incubazione a temperatura ambiente con anticorpi secondari specie-corrispondenti e coniugazione streptavidina-HRP di 30 minuti. Per lo sviluppo cromogenico, utilizzare il substrato Vector SK-4100 DAB con controcolorazione dell'ematossilina, disidratazione dell'etanolo e montaggio di balsamo neutro per completare il protocollo.
- Per la colorazione in immunofluorescenza, dopo il trattamento immunoistochimico standard (deceratura, recupero dell'antigene, blocco, incubazione di anticorpi primari e secondari), etichettare i bersagli biotinilati con Alexa Fluor 594 o 647 coniugato con streptavidina (diluizione 1:500, 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente). Eseguire la controcolorazione nucleare utilizzando DAPI (concentrazione finale di 20 μg/mL) per 5 minuti, seguita dal montaggio con terreno antidissolvenza per preservare i segnali di fluorescenza.
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Risultati
Rispetto alla tradizionale somministrazione di bleomicina orofaringea a dose singola, questo metodo ricapitola con successo le caratteristiche patologiche distintive dell'IPF, inclusi i focolai fibroblastici (Figura 1B), l'honeycombing (Figura 1G) e la bronchiolizzazione dell'epitelio alveolare (Figura 1H). È importante sottolineare che il modello dimostra la persistenza di queste caratteristiche nel tempo (Figu...
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Discussione
In questo studio, presentiamo un modello murino raffinato di IPF che utilizza la somministrazione orofaringea di bleomicina ripetuta due volte. Questo approccio affronta i limiti critici dei tradizionali modelli a dose singola, che non riescono a ricapitolare i principali segni patologici dell'IPF umana, come i pod di cellule basali KRT5+ e p63+ 7,14,15, i focolai fibroblastici persistenti
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dal Programma di Scienza e Tecnologia di Shenzhen (Grant #JCYJ20230807110800002 a CL), dalla Fondazione di Scienze Naturali del Guangdong (da #2024A1515011087 a CL) e dal Programma di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (# 202201020299 a Z.L.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente utilizzato | |||
| Bleomicina | MCE | HY-17565 | |
| H& Kit di colorazione E | Distretto di Solarbio | G1120 | |
| isoflurano | RWD | R510-22-10 | |
| Kit di colorazione Masson | Distretto di Solarbio | G1340 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| Anticorpi utilizzati | Diluizione | ||
| &alfa;-SMA | Abcam | ab5694 | 1:100 |
| Citocheratina 5 | Immunoway | YT1271 | 1:100 |
| DeltaN p63 | CST | 67825 | 1:100 |
| Capra Anti-Coniglio IgG H& L(biotina) | Abcam | AB6720 | 1:800 |
| Idrossiprolina | CST | 73812 | 1:100 |
| Streptavidina coniugata con perossidasi | Jackson | 016-030-084 | 1:100 |
| Streptavidina / AF594 | Bioss | bs-0437P-AF594 | 1:500 |
Riferimenti
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