Method Article

Un modello murino per valutare gli esiti strutturali e funzionali a lungo termine dopo l'inversione dell'ostruzione ureterapica unilaterale prolungata

DOI:

10.3791/68492

⸱

July 18th, 2025

 , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo documento fornisce istruzioni dettagliate per consentire agli investigatori di eseguire l'ostruzione ureterale unilaterale reversibile nei topi utilizzando un modello standardizzato che consente l'analisi degli esiti strutturali e funzionali a lungo termine dopo l'inversione dell'ostruzione ureterale prolungata.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La gestione clinica dei pazienti con ostruzione del tratto urinario (UTO) richiede un intervento precoce per invertire la causa dell'ostruzione, ma nonostante ciò, i pazienti con UTO prolungata sono a maggior rischio di malattia renale cronica (CKD) e danno renale acuto ricorrente (AKI). Tuttavia, a parte un'inversione precoce dell'ostruzione e la terapia generica per ritardare la progressione della CKD, nessuna terapia ha migliorato significativamente gli esiti renali a lungo termine dopo l'inversione dell'UTO. Per risolvere questo problema, un certo numero di laboratori ha sviluppato modelli di UUO reversibile (R-UUO), ma questi sono tecnicamente impegnativi e non sono stati ampiamente adottati. Inoltre, mentre i modelli murini di R-UUO sono attraenti in quanto possono essere utilizzati per sfruttare la potenza della genetica murina per studiare la fisiopatologia della malattia, questi sono stati particolarmente impegnativi in quanto i metodi utilizzati spesso portano a UUO irreversibile se l'ostruzione dura >3 giorni. Inoltre, a causa della natura di questi modelli, pochi studi hanno valutato i risultati funzionali a lungo termine dell'inversione dell'ostruzione ureterica. Per affrontare questo problema, abbiamo recentemente sviluppato un modello murino di R-UUO con nefrectomia controlaterale ritardata che consente l'analisi degli effetti a lungo termine dell'inversione dell'UTO prolungato sugli esiti strutturali e funzionali renali a lungo termine. Questi studi dimostrano che, nonostante il recupero istologico quasi completo 3 mesi dopo l'inversione, c'è stata una riduzione permanente della funzione renale e un difetto marcato e persistente nella capacità di concentrazione urinaria, indicativo di un difetto nella funzione midollare renale. Il modello richiede tre importanti interventi chirurgici di sopravvivenza, ma si traduce in una riduzione robusta e riproducibile a lungo termine della funzione renale che può essere riprodotta in diversi ceppi di topo regolando il periodo di ostruzione. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate per l'esecuzione di questi interventi chirurgici, l'ottimizzazione delle condizioni per l'uso in diversi ceppi di topo, la valutazione degli esiti funzionali renali e il prelievo di tessuti renali.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ostruzione delle vie urinarie (UTO) può essere unilaterale, che è spesso asintomatica, presentarsi tardivamente con uropatia cronica ostruttiva1, o può presentarsi acutamente con coliche renali e/o ematuria; pielonefrite acuta o danno renale acuto post-renale (AKI)2. La chiave per la gestione dell'UTO è l'inversione precoce dell'ostruzione2. Tuttavia, nonostante l'efficace inversione e l'uso di terapie generiche per ritardare la progressione della malattia renale cronica (CKD), i pazienti affetti rimangono a maggior rischio di CKD progressiva e ipertensione 3,4. Inoltre, la capacità di concentrazione urinaria a lungo termine (UCC) è spesso compromessa5, il che può predisporre i pazienti suscettibili alla disidratazione e all'AKI ricorrente, accelerando il progressivo declino della funzione renale dopo l'UTO.

In parte, questa incapacità di identificare approcci terapeutici per migliorare gli esiti a lungo termine nei pazienti con UTO è il risultato della nostra dipendenza dall'uso di modelli di ostruzione ureterale unilaterale irreversibile (UUO) per esplorare la patobiologia dell'UTO. Tuttavia, questi modelli non replicano la situazione clinica in cui i pazienti subiscono l'inversione subito dopo la diagnosi e non possono essere utilizzati per esplorare i meccanismi e gli approcci terapeutici che potrebbero essere utilizzati per migliorare la riparazione a lungo termine dopo che l'ostruzione è stata invertita. Per risolvere questo problema, sono stati sviluppati modelli UUO reversibili (R-UUO), ma questi sono tecnicamente più impegnativi dei modelli UUO irreversibili, più difficili da riprodurre da diversi laboratori e, di conseguenza, non sono stati adottati così ampiamente dalla comunità scientifica. I modelli murini sono attraenti poiché possono essere utilizzati per sfruttare la potenza della genetica murina per studiare la fisiopatologia della malattia, ma sono stati particolarmente difficili da ottimizzare poiché i metodi spesso portano a UUO irreversibile se l'ostruzione dura più di 3 giorni6. Per affrontare questo problema sono stati implementati diversi approcci, tra cui la multichirurgia, il posizionamento sequenziale di morsetti lungo l'uretere ogni 2 giorni 6,7; UUO seguita da reimpianto vescicale 8,9,10,11; e utilizzare morsetti e tubi non dannosi per ostruire l'uretere 12,13,14. Studi di esito a lungo termine su ratti e topi hanno mostrato un miglioramento della funzionalità renale, una riduzione della fibrosi e/o un danno glomerulare dopo l'inversione dell'ostruzione, ma solo un recupero parziale se l'UUO dura più di 2 giorni 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 . Inoltre, mentre il midollo renale (RM) è particolarmente suscettibile ai danni causati da UTO 20,21 fino a poco tempo fa, non ci sono stati studi a lungo termine sui roditori in cui sono stati studiati gli effetti di R-UUO prolungato sulla struttura e la funzione della RM. Ciò è significativo poiché l'UCC e la capacità di espellere carichi di sale senza aumentare la pressione sanguigna (la cosiddetta risposta alla natriuresi da pressione) dipendono dal mantenimento dell'integrità anatomica del RM 22,23,24, quindi la riparazione incompleta del RM dopo l'inversione dell'UTO può spiegare perché i pazienti hanno una maggiore suscettibilità all'AKI ricorrente e all'ipertensione dopo l'inversione dell'UTO. Tuttavia, molte delle tecniche necessarie per valutare questo richiedono più cicli di interventi chirurgici (cinque interventi chirurgici maggiori per 6 giorni di ostruzione 6,7), richiedono competenze chirurgiche difficili da insegnare (ad esempio, reimpianto chirurgico dell'uretere nella vescica 8,9,10,11), e poiché l'ostruzione è unilaterale, rende difficile per gli investigatori valutare i cambiamenti nella funzione renale dopo l'inversione dell'ostruzione.

Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato un modello murino di R-UUO che è relativamente semplice da eseguire e insegnare, richiede un numero più limitato di interventi chirurgici rispetto ad altre tecniche (due interventi chirurgici per 5-7 giorni di ostruzione) e consente l'analisi del recupero funzionale renale senza la necessità di studi invasivi e/o costosi studi di funzionalità renale divisa25. Per questo, i topi si sottopongono a tre interventi chirurgici principali: 1) posizionamento di un morsetto vascolare non traumatico sull'uretere sinistro prossimale; 2) rimozione del clamp vascolare da 5 a 7 giorni dopo, a seconda del ceppo del topo; e 3) rimozione del rene controlaterale 10 giorni dopo per valutare la funzionalità renale. Circa il 20-40% dei topi muore entro 2-3 giorni dalla nefrectomia, indicando che l'UUO non si inverte in tutti i topi. Il follow-up a lungo termine dei topi sopravvissuti mostra che, nonostante il recupero istologico quasi completo del midollo renale (RM), 3 mesi dopo R-UUO. La funzionalità renale è ridotta, misurata dalla velocità di filtrazione glomerulare transdermica (tGFR)26. Inoltre, vi è una marcata riduzione dell'UCC, determinata misurando l'osmolalità urinaria dopo la restrizione idrica, suggerendo che esiste un difetto permanente nella funzione RM. Gli studi sul decorso temporale mostrano che mentre c'è un miglioramento del tGFR tra i giorni 28 e 56 dopo RUUO, questo si stabilizza tra i giorni 56 e 84. Al contrario, non vi è alcun miglioramento dell'UCC tra i giorni 28 e 84 dopo l'R-UUO25. Utilizzando scRNA-Seq di RM isolati, convalidati da studi di lineage cellulare e immunoistochimica, abbiamo identificato forti risposte rigenerative che hanno ripristinato le dimensioni della RM dopo R-UUO, ma che tutti i principali compartimenti cellulari nella RM hanno mostrato cambiamenti permanenti nel numero di cellule e nelle firme geniche che probabilmente influenzeranno il recupero funzionale dopo R-UUO. Ciò includeva risposte proinfiammatorie persistenti nel dotto collettore RM e nell'ansa delle popolazioni di cellule di Henle 84 giorni dopo R-UUO, simili alle firme infiammatorie e di senescenza delle cellule epiteliali tubulari prossimali di riparazione fallite dopo AKI e UUO 27,28,29,30. Cambiamenti simili sono stati osservati anche nei dotti di raccolta della RM da pazienti con malattia ricorrente della calcolosi renale31, suggerendo che esiste una risposta comune al danno da RM sia nell'uomo che nei topi. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate su come eseguiamo questi interventi chirurgici, come ottimizziamo le condizioni per il suo utilizzo in diversi ceppi di topo, come determiniamo se l'uretere è ancora ostruito dopo l'inversione, come valutiamo i principali risultati funzionali e come raccogliamo i tessuti renali per valutare le strutture midollari renali.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene descritto il protocollo in quattro fasi utilizzato per gli studi a lungo termine (Figura 1). Come discusso alla fine di questo manoscritto, i ricercatori possono scegliere di eseguire solo tre di questi (sezioni 1, 2 e 4) o tutti e quattro se interessati a studiare i risultati a lungo termine. Tutti gli esperimenti sui topi in questo manoscritto sono stati approvati dal Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee e aderiscono alle linee guida per l'uso degli animali.

1. Posizionamento del morsetto ureterale (10 - 15 min/mouse)

NOTA: Affidarsi alla conoscenza dell'anatomia del rene del topo per localizzare l'uretere poiché non è possibile vederlo direttamente senza il tessuto connettivo circostante. L'uretere corre lungo la parte posteriore inferiore del tessuto ilare quando il rene è esposto (Figura 2). La scelta del morsetto vascolare è importante. Questi possono essere costosi ma possono essere puliti, sterilizzati in autoclave e riutilizzati più volte. Questi morsetti possono essere riutilizzati almeno 100 volte senza problemi.

  1. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento a 121 °C per 30 min. Se si eseguono interventi chirurgici su più topi, rimuovere il sangue e i detriti dagli strumenti tra l'uso e sterilizzare per 10-15 secondi utilizzando lo sterilizzatore a perline calde. Lasciare raffreddare gli strumenti prima di riutilizzarli.
  2. Pesa il mouse.
  3. Anestetizzare il topo utilizzando 5-10 mg/kg di xilazina con 90-120 mg/kg di ketamina per iniezione intraperitoneale (vedere la tabella dei materiali). Questo di solito richiede 3-5 minuti per avere effetto.
  4. Somministrare analgesia preoperatoria se si utilizza un agente anestetico diverso, come l'isoflurano, poiché, a differenza della xilazina, questo non ha effetti analgesici.
  5. Radere il sito chirurgico dai fianchi alla gabbia toracica e intorno ai lati, con un bordo sufficiente per evitare che i peli contaminino il sito dell'incisione. Eseguire in un'area preparatoria, non nel luogo in cui viene eseguito l'intervento chirurgico.
  6. Coprire il campo operatorio riscaldato con un telo chirurgico sterile. Aiuterà a prevenire l'ingresso di peli randagi nel campo chirurgico e fornirà un'area per posare strumenti sterili.
  7. Applicare un unguento lubrificante oftalmico sugli occhi.
  8. Applicare la preparazione asettica utilizzando una garza imbevuta di betadine: strofinare dal centro del sito verso la periferia 3 o 4 volte, ogni volta seguite da una pulizia con un tampone imbevuto di alcol. Rimuovere tutta la betadina dal campo chirurgico prima dell'incisione.
  9. Praticare un'incisione dorsale longitudinale di 1,5 cm sulla linea mediana attraverso la pelle e gli strati sottocutanei utilizzando forbici e pinze.
  10. Fai una piccola incisione attraverso il muscolo del fianco sinistro e la fascia sopra il rene ed esteriorizza il rene sinistro.
  11. Sezionare con cura il grasso del polo inferiore e parte del tessuto connettivo intorno a dove dovrebbe essere l'uretere. Non è possibile vedere direttamente l'uretere senza il tessuto connettivo circostante. Quindi, separare l'uretere con il tessuto connettivo circostante dal peduncolo renale, che contiene la vena renale e l'arteria, in modo che il peduncolo renale non sia incluso nel morsetto ureterale (Figura 2).
  12. Utilizzare gli applicatori a morsetto per aprirlo e posizionarlo sull'uretere direttamente sotto il bacino. Utilizzare i segni sul morsetto vascolare per assicurarsi che siano posizionati con la stessa pressione sull'uretere per ciascun topo (Figura 3). Non applicare, quindi rimuovere il morsetto per riposizionarlo, poiché ciò può danneggiare l'uretere.
  13. Una volta posizionato il morsetto, spingere delicatamente il rene con il morsetto nello spazio retroperitoneale utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione salina.
  14. Chiudere lo strato muscolare utilizzando una sutura riassorbibile.
  15. Chiudere il livello della pelle utilizzando le clip della pelle.
  16. Somministrare buprenorfina 3,25 mg/kg di analgesia, come indicato nella sezione sui farmaci, e somministrare 0,5 ml di soluzione fisiologica normale sterile per via sottocutanea per idratare i topi.
  17. Lascia il mouse sul campo chirurgico del cuscinetto rigido riscaldato o trasferiscilo nella gabbia di casa con un cuscinetto isotermico riscaldato sotto metà della gabbia fino a quando il mouse non si sveglia.
  18. Riporta il topo nella stanza degli animali.
  19. Monitorare attentamente il topo e somministrare dosi aggiuntive di Buprenorfina per il dolore o il disagio per 48-72 ore. I segni clinici di dolore e angoscia che indicano che i topi hanno bisogno di ulteriore analgesia includono depressione o altri cambiamenti comportamentali, aspetto anormale o posture come piloerezione, postura curva, mancanza di cura e alimentazione o immobilità.

2. Rimozione del morsetto ureterale (10 - 15 min/mouse)

  1. Seguire i passaggi 1.1-1.10 della procedura di posizionamento del morsetto utilizzando le incisioni cutanee e muscolari originali per iniziare la rimozione del morsetto. Rimuovere le clip della ferita prima di pulire l'area chirurgica. Di solito non è necessario radersi di nuovo poiché i peli non sono ricresciuti.
  2. A causa delle aderenze tissutali sviluppate, utilizzare una pinza per posizionare con precisione il morsetto nello spazio retroperitoneale senza prima esternalizzare il rene. Utilizzare gli applicatori del morsetto per aprire delicatamente il morsetto mentre si utilizza la pinza per tirare il tessuto verso il basso intorno alla testa del morsetto per rimuovere il morsetto.
  3. Ora, esteriorizza il rene in modo che la pelvi renale possa essere visualizzata per determinare l'ostruzione. La pelvi renale dovrebbe essere gonfia, indicando idronefrosi.
  4. Una volta ispezionato il rene, spingerlo delicatamente nello spazio retroperitoneale utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica.
  5. Segui i passaggi 1.13-1.18, come descritto sopra.

3. Nefrectomia controlaterale (10 - 15 min/topo)

  1. Radere l'area se c'è una crescita di peli.
  2. Utilizzare una miscela di isoflurano/aria all'1-5% per l'anestesia per consentire un recupero più facile a causa di precedenti eventi anestetici. Rimuovere le clip della ferita prima di pulire l'area chirurgica.
  3. Somministrare analgesia alla buprenorfina prima dell'intervento (vedere Tabella dei materiali).
  4. Seguire i passaggi della procedura 1.1-1.9 utilizzando l'incisione cutanea originale per iniziare.
  5. Fai una piccola incisione attraverso il muscolo del fianco destro e la fascia sopra il rene ed esteriorizza il rene destro.
  6. Tenere delicatamente il rene con una pinza liscia e curva e sezionare con cura i poli superiore e inferiore del rene liberi dal tessuto circostante.
    NOTA: Il tessuto intorno al polo superiore contiene la ghiandola surrenale, che trasporta il proprio afflusso di sangue, che può essere estratto dal rene ma ovviamente non deve essere rimosso dal topo (vedi Figura 2).
  7. Dopo aver liberato il rene dal tessuto circostante, legare la sutura di seta 4-0 completamente attorno ai vasi renali e all'uretere utilizzando un doppio nodo chirurgico. Se lasciato per ~30 s, il rene si scurisce. Tenere il rene con una pinza liscia e curva e rimuovere il rene tagliandolo distalmente al nodo con le forbici curve.
  8. Spingere delicatamente il peduncolo renale rimanente nello spazio retroperitoneale utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica.
  9. Segui i passaggi 1.13-1.18, come descritto sopra.

4. Raccolta dei tessuti

  1. Anestetizzare con una miscela di isoflurano/aria al 5% per ottenere un piano stabile di anestesia chirurgica prima della procedura terminale.
  2. Aprire la cavità addominale per esporre il rene sinistro
  3. Ispezionare il rene per vedere qualsiasi gonfiore della pelvi renale (vedere passaggio 2.3).
  4. Se sembra che la pelvi renale sia ancora gonfia, inserire un ago a farfalla di piccolo calibro collegato a una siringa contenente 0,5 ml di una diluizione 1 su 5000 di blu di metilene in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Se l'uretere è pervio, la soluzione blu sarà visibile mentre viaggia dalla pelvi renale alla vescica. In caso contrario, la pelvi renale si gonfierà con una soluzione blu e non apparirà nella vescica.
  5. Per fissare i reni in perfusione, aprire la cavità toracica ed esporre il cuore.
    1. Mentre il cuore batte ancora, inserire un ago a farfalla da 23-25 G nel ventricolo sinistro, iniziare un'infusione di soluzione fisiologica normale e tagliare l'atrio o il ventricolo destro per sostituire il volume del sangue con soluzione fisiologica.
    2. Dopo circa un minuto, assicurati che i reni siano bianchi. Continuare l'infusione di soluzione salina per un altro minuto o sostituirla con un'infusione di soluzione di formalina al 10% per altri 1-2 minuti per fissare i tessuti.
    3. A questo punto, il topo sarà morto; raccogliere i tessuti. Se i tessuti vengono raccolti per studi su RNA o proteine, non fissarli per perfusione.
  6. Dopo la rimozione dei reni dall'animale (indipendentemente dal fatto che la perfusione sia stata fissata o meno), utilizzare una lama di rasoio per tagliare fino a tre fette sagittali spesse 2-3 mm attraverso il centro del rene (Figura 4). In questo modo si ottengono sezioni rappresentative che includono il midollo renale e la corteccia e si fornisce tessuto sufficiente per i saggi istologici, proteici o di RNA.
  7. Procedere con la correzione/congelamento dei campioni in base ai requisiti dello studio.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per gli studi a lungo termine, generalmente valutiamo la funzionalità renale misurando l'azoto ureico sequenziale nel sangue (BUN) e le velocità di filtrazione glomerulare transdermica (tGFR) nei topi coscienti (fare riferimento a un articolo pubblicato in precedenza che descrive questo26), oltre a misurare la capacità di concentrazione urinaria (UCC) valutando l'osmolarità urinaria da campioni di urina spot raccolti dopo 18 ore di privazione di acqua. Sebbene eseguiamo sempre studi sull'azotemia,...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rispetto ad alcuni degli approcci che sono stati utilizzati per studiare l'inversione dell'UUO prolungata nei topi6,7,8,9,10,11,12,13,14, il protocollo qui descritto è relativamente sempli...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) nell'ambito dei premi RO1DK128823 e UC2DK126122.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% Cloruro di sodioFarmacia VUMCmultiplo
Sutura riassorbibile Vicryl 6-0Med Vet International- ETHICONJ492G
Tamponi imbevuti di alcolTamponi di alcol isopropilico di marca BDBD 326895
Soluzione di betadinaHanna Pharmaceutical Supply Co., Inc67618015017
Pinze per l'applicazione del morsetto: S& T CAF-4Strumenti per la scienza00071-14
Piattaforma isotermica DeltaphaseBraintree ScientificoDPIP
Decespugliatore elettricoOstermultiplo
ENCORE Guanti chirurgici testurizzati in latticeAnsell5785003
Ethiqa XR Buprofenor (CIII) VI 1,3 mg/mLVeterinario di Patterson- Ethiqa86084010030
Clip EZ 9 mmBraintree ScientificoEZC-CSo 7 mm
Applicatore EZ Clip 9 mm Braintree ScientificoEZC-APLo 7 mm
Dispositivo di rimozione clip EZ 9 mmBraintree ScientificoEZC-RMVo 7 mm
Spugne di garza 2 ´ 2Fisher Scientifico22-362178
Graefe punta seghettata angolata o curvaStrumenti per la scienza11049-10
Graefe punta dritta seghettataStrumenti per la scienza11050-10
Pad rigido riscaldato 15 & acuto; 24Braintree ScientificoHHP 2
Connettori della pompa a cuscinetto rigido riscaldatoBraintree ScientificoConnettore HHP Gaymar
Sterilizzatore a cordoni caldiStrumenti per la scienza18000-45
Siringa da insulina 0,5 mL 29 gExel International26028
Isoflurano Veterinario di Patterson- Pivetal78949580
Ketamina 100 mg/mLFarmacia VUMC
Sutura non assorbibile Silk 4-0Med Vet International- ETHICON683G
Porta-aghi Olsen Hegar: con taglia-suturaStrumenti per la scienza12002-12
Optixcare Lubrificante per gli occhi 20 gMed Vet InternazionalePHOPTIXCARE
Forbici-Lexer smussato-bambinoStrumenti per la scienza14078-10
Forbici-Affilato curvoStrumenti per la scienza14005-12
Applicatori sterili in cotonePuritano25806 2WC
Spugne di garza sterili 4 & acute; 4Fisher Scientifico22-415-469
Telo chirurgico sterile monouso 18 & acute; 26Med Vet Internazionale20001
Custodia per strumenti di sterilizzazione 5 & acute; 10Fisher Scientifico01-812-54
T / pompa Riscaldamento Pompa di raffreddamentoBraintree ScientificoTP-700
Pinze Taylor curve, lisceStrumenti per la scienza11017-17
Morsetto vascolare: S & T Pressa da 5 a 15 gStrumenti per la scienza00396-01
Xilazina 100 mg/mLVeterinario di Patterson - CronoCR04305

References

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