Registrazioni di array multielettrodo ad alta densità di onde retiniche utilizzando una piattaforma di elettrofisiologia

Summary

Gli array multielettrodi ad alta densità (HD-MEA) sono utilizzati per studiare le onde retiniche spontanee, che svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo dei circuiti neurali. Questo protocollo delinea i passaggi per la preparazione del tessuto retinico di topo e l'esecuzione di registrazioni elettrofisiologiche utilizzando HD-MEA su una piattaforma di elettrofisiologia.

Abstract

Le onde retiniche spontanee sono un segno distintivo dell'attività della rete retinica durante lo sviluppo, svolgendo un ruolo cruciale nella formazione del sistema visivo influenzando l'affinamento degli assoni, la permeabilità della vascolarizzazione e la maturazione complessiva dei circuiti neurali. Queste onde sono comunemente studiate in preparazioni retiniche ex vivo utilizzando array multielettrodi (MEA), che consentono registrazioni elettrofisiologiche di ampie popolazioni di attività delle cellule gangliari retiniche (RGC). L'elettrofisiologia basata sulla MEA è diventata uno strumento potente grazie alla sua facilità d'uso per raccogliere rapidamente dati ad alto rendimento, rendendola così ideale per studiare l'attività retinica in una varietà di condizioni sperimentali.

In questo protocollo, delineiamo i passaggi critici per la preparazione del tessuto retinico per l'acquisizione di dati elettrofisiologici utilizzando un MEA ad alta densità (HD-MEA) su una piattaforma di elettrofisiologia. Il processo inizia con l'attento isolamento delle retine intatte da animali neonatali in condizioni fisiologiche. Una volta preparata, la retina viene montata con cura su un chip HD-MEA, che consiste in una griglia di 26.400 elettrodi in grado di eseguire registrazioni extracellulari simultanee da almeno 1.000 RGC. Le registrazioni possono durare fino a diverse ore. In definitiva, questo approccio metodologico offre preziose applicazioni nello studio dello sviluppo retinico, delle malattie e degli studi comparativi potenzialmente interspecie, contribuendo a progressi più ampi nelle neuroscienze e nella ricerca sulla visione.

Introduction

Le onde retiniche spontanee sono esplosioni periodiche di attività correlata osservate nella retina in via di sviluppo prima dell'inizio della visione. Nei topi, i circuiti che avviano e propagano le onde retiniche cambiano rapidamente durante lo sviluppo, iniziando embrionalmente e terminando all'apertura degli occhi (giorno postnatale 14)¹. Man mano che i circuiti retinici si sviluppano, le proprietà spazio-temporali delle onde retiniche cambiano drasticamente ^2,3. Diversi studi supportano che queste specifiche proprietà spazio-temporali istruiscono lo sviluppo del sistema visivo: l'attività asincrona tra gli occhi istruisce la segregazione oculare-specifica⁴, la dimensione dell'area d'onda istruisce il raffinamento degli assoni retinotopici nelle regioni cerebrali binoculari ^5,6 e la direzione di propagazione delle onde è stata implicata per istruire i circuiti di selettività della direzione nel collicolo superiore³. Oltre ai circuiti neurali, le onde retiniche sono responsabili dello sviluppo della permeabilità del sistema vascolare sanguigno⁷. Inoltre, è stato scoperto che le onde retiniche di stadio II controllano la crescita delle aree del campo recettivo e la stabilizzano nelle cellule gangliari retiniche (RGC)⁸. Criticamente, le onde retiniche aberranti durante lo sviluppo potrebbero essere la base di vari disturbi dello sviluppo neurologico e, in effetti, le onde retiniche sono anormali in un modello murino di nistagmo congenito³. Dato il loro ruolo critico nello sviluppo precoce del sistema visivo e le implicazioni per la malattia, è necessario registrare le dinamiche spazio-temporali delle onde retiniche a qualsiasi età e in qualsiasi modello animale.

Sono emersi diversi metodi per studiare le onde retiniche. Sia l'elettrofisiologia a singola cellula ^9,10 che l'imaging del calcio 11,12,13,14,15 hanno portato a scoperte seminali sui circuiti e sulla funzione delle onde retiniche. Qui, ci concentriamo sulle registrazioni multielettrodo (MEA), un metodo che è stato utilizzato sin dalle prime indagini sulle onde retiniche¹⁶ e ha continuato a migliorare come tecnica². I MEA consentono la registrazione extracellulare simultanea di potenziali d'azione da centinaia a migliaia di RGC, consentendo ai ricercatori di monitorare l'inizio, la propagazione e la terminazione delle onde in modo simile a quanto possibile con l'imaging del calcio. Poiché i MEA registrano direttamente il potenziale d'azione degli RGC, i MEA possono essere utilizzati per studiare vari modelli genetici murini o organismi non modello senza l'aggiunta della complicazione dell'introduzione di un indicatore di calcio. Il tessuto può anche essere coltivato direttamente nel MEA, consentendo tempi di registrazione molto lunghi. I MEA sono anche altamente scalabili, con i prodotti attuali che consentono fino a sei MEA attivi contemporaneamente, il che potrebbe consentire una rapida valutazione delle retine e catalizzare la scoperta di farmaci. Forse il più grande punto di forza dei MEA è la loro capacità di campionare molte cellule a un'elevata frequenza di campionamento, il che consente ai laboratori di tutto il mondo di ottenere rapidamente ricchi set di dati, ma richiede esperienza nella post-elaborazione.

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di fornire un protocollo dettagliato e riproducibile per la preparazione del tessuto retinico e l'esecuzione di registrazioni elettrofisiologiche utilizzando un sistema MEA ad alta densità (HD-MEA) a pozzetto singolo per studiare le onde retiniche spontanee ex vivo. Questo metodo garantisce un'acquisizione di dati ad alto rendimento e di lunga durata, rendendolo adatto a un'ampia gamma di studi sullo sviluppo e sulla malattia. Il nuovo sistema HD-MEA avanzato basato su CMOS, che consente >1.000 siti di elettrodi contemporaneamente, offre diversi vantaggi rispetto agli approcci elettrofisiologici tradizionali. Il suo array di elettrodi ad alta densità (26.400 elettrodi) consente registrazioni extracellulari precise e simultanee da un massimo di 1.012 RGC, catturando modelli di attività spaziale su larga scala. Il design a pozzetto singolo fornisce condizioni di registrazione uniformi¹⁷. Inoltre, questo sistema consente registrazioni a lungo termine della durata di diverse ore, rendendo possibile lo studio della dinamica delle onde in varie condizioni fisiologiche e farmacologiche senza una significativa degradazione del segnale¹⁸. Fornendo un protocollo, questo studio mira a rendere la tecnologia HD-MEA accessibile a un pubblico più ampio di ricercatori in neuroscienze, oftalmologia e scienze della visione. Questo metodo rappresenta un significativo passo avanti nello studio delle onde retiniche, offrendo nuove strade per studiare lo sviluppo precoce del sistema visivo, i meccanismi della malattia e i potenziali interventi terapeutici.

Protocol

Questo protocollo delinea i passaggi per isolare e preparare il tessuto retinico da topi neonatali per le registrazioni MEA delle onde retiniche utilizzando la piattaforma HD-MEA di Maxwell Biosystems. La procedura è progettata per preservare le condizioni fisiologiche, garantendo che il tessuto retinico rimanga strutturalmente intatto, privo di danni e adeguatamente preparato per un contatto ottimale con gli elettrodi. Questi esperimenti sono stati approvati dal Vanderbilt Animal Care and Use Program, con il numero di protocollo M2200056-00. I topi (di 1-2 settimane, entrambi i sessi) sono stati alloggiati in un vivaio con ciclo giorno/notte di 12 ore e alimentati con una dieta a base di cibo regolare.

1. Preparazione del tessuto retinico

1. Isolamento della retina
   NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sui materiali, le apparecchiature e i reagenti utilizzati in questo protocollo (vedere anche la Figura 1).
   1. Preparare l'area di lavoro
      1. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF): 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucosio, bollito con carbogeno: 95% O₂/5% CO₂ (pH 7,4, osmolarità 290 ± 10 mOsm) e conservarlo a 5 °C. Tenere l'aCSF in ghiaccio mentre viene ossigenato per 10 minuti prima della dissezione.
         NOTA: Il CaCl₂ deve essere aggiunto per ultimo, dopo che la soluzione è stata fatta bollire con carbogeno per 10 minuti.
      2. Iniziare l'ossigenazione dell'aCSF fresco e ghiacciato (per almeno 10 minuti).
      3. Impostare gli strumenti di dissezione e il microscopio.
   2. Eutanasia dell'animale secondo le linee guida istituzionali.
   3. Enuclea gli occhi usando le forbici a molla curve-
      1. Poiché i cuccioli postnatali hanno gli occhi chiusi fino a P11-13 (nel topo) e le palpebre devono essere aperte con cura, utilizzare micro pinze per afferrare le palpebre e forbici a molla per rimuoverle. Estrarre con cura gli occhi usando le forbici a molla, evitando danni agli occhi.
      2. Tagliare il nervo ottico e posizionare gli occhi in aCSF ossigenato. Utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare delicatamente l'occhio tra le piastre di Petri.
         NOTA: Per il resto del protocollo di dissezione, rinfrescare con aCSF ossigenato ogni 10 minuti.
   4. Al microscopio da dissezione,
      1. Fai una piccola incisione nella cornea usando un ago mentre stabilizzi l'occhio con una pinza.
      2. Sezionare senza mezzi termini la cornea strappandola delicatamente lungo il perimetro sclerale.
      3. Rimuovere il diaframma e l'obiettivo. Se la retina è attaccata al cristallino negli animali giovani, separarla delicatamente con una pinza.
         NOTA: Negli animali giovani, la retina è talvolta attaccata al cristallino. Usa la pinza per estrarre delicatamente la lente dalla retina usando un paio di pinze per tirare la lente e l'altra appoggiata sui bordi esterni della retina per mantenere la retina in posizione mentre la lente viene rimossa.
   5. Orientare la retina.
      1. Identificare il lato ventrale utilizzando il tessuto coroide (vedi Sondereker et ^al.19 per un protocollo dettagliato sull'orientamento) e posizionarlo di fronte al ricercatore con lo strato RGC rivolto verso l'alto.
      2. Utilizzare un bisturi curvo per eseguire un taglio di riferimento di 45° in senso antiorario rispetto all'asse ventrale.
      3. Usando una pinza fine, separare delicatamente la retina dall'epitelio pigmentato retinico (RPE) e dalla sclera.
         NOTA: Nei topi più giovani, l'RPE si stacca facilmente dalla retina. Nei topi più anziani, l'RPE è più attaccato alla retina. Se, dopo aver rimosso l'RPE dalla maggior parte della retina, l'RPE è ancora ancorato alla retina tramite il nervo ottico, utilizzare le forbici a molla per recidere tale connessione. In questo modo si evitano danni al tessuto retinico vicino al nervo ottico.
   6. Le retine neonatali non hanno quasi nessun corpo vitreo, ma le retine più vecchie lo fanno (appare come un filamento marrone lungo il bordo della retina, ma le fibre si collegano tra loro anche all'interno dell'umor vitreo). Usando la pinza fine, rimuovere il tessuto vitreo che si trova sopra lo strato di RGC.
      NOTA: Questo strato fibroso a volte si stacca quando la lente viene rimossa. In caso contrario, è importante rimuoverne il più possibile, altrimenti impedirà il corretto contatto degli RGC con gli elettrodi.
   7. Usando un bisturi, fai quattro tagli in rilievo per aiutare la retina a rimanere piatta nel piatto. Per conoscere e mantenere l'orientamento in seguito, taglia i due angoli del quadrante ventrale con un bisturi.

2. Montaggio della retina sul chip MEA

1. Montaggio della retina-
   1. Trasferire delicatamente la retina dalla capsula di Petri al chip MEA utilizzando la pipetta di trasferimento con la punta tagliata. Assicurati che ci sia abbastanza aCSF nel chip per coprire il fondo del pozzo.
   2. Utilizzare la spazzola a pelo singolo per manovrare delicatamente la retina da posizionare sopra gli elettrodi, lo strato RGC rivolto verso gli elettrodi.
   3. Utilizzando la pipetta da 10 μl, rimuovere delicatamente l'aCSF in eccesso attorno al tessuto retinico. Inclina il chip di un angolo per eliminare l'aCSF in eccesso.
      NOTA: Non toccare mai gli elettrodi o gli amplificatori con la punta della pipetta. Man mano che l'aCSF viene rimosso, la retina si appiattisce di più. Se una parte della retina è piegata sotto se stessa, usa la spazzola per capelli singoli per raccogliere delicatamente sotto il foglietto desiderato per aprirlo. Per evitare che la retina si muova mentre si apre qualsiasi parte dei lembi, è possibile utilizzare una seconda spazzola a pelo singolo per applicare una leggera pressione al centro della retina, dove si collega il nervo ottico.
   4. Asciugare il pozzetto il più possibile inclinando il truciolo a un angolo di 45° e rimuovendo l'ultimo aCSF che si accumula nella parte inclinata del truciolo.
      NOTA: Questo aumenterà la connessione tra la retina e gli elettrodi.
   5. Usa la carta da filtro per tamponare e asciugare delicatamente i bordi della retina. Posizionare il chip MEA in una camera di registrazione.
2. Migliorare il contatto con l'elettrodo-
   1. Utilizzare un inserto portafazzoletti sostituibile per spingere delicatamente la retina sugli elettrodi, garantendo un contatto ottimale e migliorando il rapporto segnale/rumore.
      NOTA: L'inserto del supporto del fazzoletto deve smettere di essere abbassato non appena entra in contatto con la retina (una chiara "macchia bagnata" sarà visibile nel punto di contatto). Un ulteriore abbassamento del portaelettrodo rischia di danneggiare il tessuto retinico. Passare rapidamente dal passaggio 2.1.4 al 2.2.1 per ridurre al minimo la durata della permanenza della retina senza aCSF ossigenato; Questo passaggio è fondamentale e deve essere completato il più rapidamente possibile. È importante muoversi velocemente quando si appiattisce la retina sul chip, tuttavia, è anche importante che la maggior parte dell'aCSF proveniente dalla dissezione sia asciugata in modo che la retina abbia un buon contatto con l'elettrodo. Andare troppo veloce per far ossigenare la retina rischia di non avere un buon contatto con gli elettrodi di registrazione, e andare troppo lentamente rischia che le cellule retiniche diventino ipossiche e muoiano. Scopriamo che 30-60 s portano a un buon contatto e a retine sane (cioè, osserviamo onde retiniche tipiche).
   2. Utilizzando il sistema di perfusione di riferimento, iniziare a riempire il pozzetto del chip MEA con aCSF ossigenato a una velocità di flusso di 2 mL/min.
      NOTA: Si consiglia un sistema di perfusione aperto, poiché il rumore elettrico rimane basso e fornisce aCSF fresco alla retina. Assicurarsi che un sistema di riscaldamento in linea sia collegato all'impianto di perfusione per riscaldare l'aCSF alle condizioni fisiologiche.
   3. Accendere il riscaldatore in linea del sistema di perfusione per riscaldare l'aCSF a 32-34 °C.

3. Registrazioni elettrofisiologiche

1. Registrazioni extracellulari-
   1. Accendere il sistema di registrazione.
   2. Sul computer di acquisizione, fare doppio clic prima sull'icona Server e poi su Ambito per aprirlo.
   3. Fare clic sull'icona Inizializza nell'interfaccia Scope e inserire l'ID del chip MEA per avviare le registrazioni extracellulari utilizzando il sistema MEA.
   4. Fare clic sull'icona Offset nell'interfaccia Scope per impostare l'offset.
   5. Regola le impostazioni del guadagno e del filtro per ottimizzare il rilevamento del segnale. Utilizzare le impostazioni predefinite di 512 di guadagno e un passa-alto di 300 Hz; impostare la frequenza di campionamento a 20 kHz.
   6. Selezionare la configurazione di registrazione appropriata. L'area attiva totale che può essere campionata è di 3,85 x 2,1 mm². Il software consente agli utenti di scegliere come configurare la spaziatura degli elettrodi; Per seguire questo protocollo, utilizzare l'impostazione predefinita che distribuisce equamente gli elettrodi di registrazione sull'area attiva massima, in quanto campiona la maggior parte possibile della retina. Ciò porta a una spaziatura di 87,5 μm per elettrodo di registrazione.
   7. Lasciare che la retina si acclimati alla camera di registrazione per 60 minuti.
   8. Avvia le registrazioni spontanee delle attività dagli RGC accedendo alla scheda Saggio e selezionando l'icona Crea nuovo saggio . Scegliere il tipo di test di rete , assegnare un nome file appropriato e fare clic su OK per salvare la configurazione. Impostare la durata desiderata per la registrazione regolando il parametro Tempo di registrazione (sec ). Abilita l'opzione Solo picchi per concentrarti sui dati dei picchi, quindi fai clic sull'icona Esegui saggio per iniziare la sessione di registrazione.
      NOTA: Per le registrazioni di onde retiniche di 10 minuti e oltre, si consiglia di utilizzare l'impostazione solo picchi , che salva solo i timestamp dei potenziali d'azione utilizzando uno strumento di rilevamento dei picchi integrato invece della traccia elettrofisiologica grezza completa per canale. Ciò è dovuto al fatto che una registrazione prolungata (>10 minuti) su 1.024 canali può facilmente portare a file di dati di dimensioni TB che sono tecnicamente difficili da analizzare e rallentano drasticamente i progressi della ricerca. Abbiamo confermato che i dati grezzi che utilizzano i tempi di picco replicano solo le note proprietà spazio-temporali delle onde retiniche: per le onde di stadio II, osserviamo grandi onde che coprono la maggior parte della retina e si verificano a frequenze che corrispondono ai rapporti precedenti (vedi Figura 2). Notiamo che se il progetto di ricerca richiede un'analisi più approfondita delle forme d'onda spike, allora la registrazione della traccia elettrofisiologica grezza è una necessità.
   9. Monitorare periodicamente la registrazione in corso per assicurarsi che l'acquisizione dei dati proceda come previsto e che il sistema funzioni correttamente.

4. Procedura di bonifica

1. Una volta completata la registrazione e salvati i dati, spegnere il riscaldatore in linea e quindi spegnere il sistema di perfusione.
2. Rimuovere con cautela l'inserto del portafazzoletti ed estrarre il chip MEA. Pulisci il truciolo sciacquandolo prima con etanolo al 70%, seguito da acqua deionizzata (DI).
3. Per evitare l'intasamento del tubo, sciacquare il sistema di perfusione con acqua deionizzata per 15 minuti.

Results

Registrazioni e analisi ad alto rendimento delle onde retiniche con HD-MEA
Abbiamo eseguito una registrazione HD-MEA di un'ora delle onde retiniche spontanee (Figura 2). Un grafico raster dell'attività neuronale mostra il modello strutturato delle onde retiniche, dove ogni punto rappresenta un potenziale d'azione rilevato da un singolo elettrodo (Figura 2A, in basso). La somma dell'attività tra gli elettrodi si traduce in una...

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo riproducibile e ad alto rendimento per la preparazione del tessuto retinico e l'esecuzione di registrazioni HD-MEA, offrendo un metodo robusto per studiare l'attività della rete retinica. La tecnologia HD-MEA offre vantaggi significativi rispetto alle tradizionali tecniche elettrofisiologiche e di imaging, in particolare nell'acquisizione di dati ad alto rendimento. HD-MEA fornisce registrazioni accurate in tempo reale, su scala di milliseco...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipetta di trasferimento monouso da 3 mL (con estremità tagliata)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Aiuta a spostare la retina tra le piastre di Petri.
Liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)			Mantiene le condizioni fisiologiche del tessuto retinico; composto da NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucosio e bollato con carbogena.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)Apporto di
carboidrati (95% O2, 5% CO2)			Utilizzato per ossigenare l'aCSF e mantenere la vitalità dei tessuti.
Bisturi a lama curva (#10)	Integra	4-110	Utilizzato per tagliare i tessuti con precisione.
Microscopio da dissezione (stereoscopio)	Zeiss	Stemi 508	Essenziale per la visualizzazione e la manipolazione del tessuto retinico.
glucosio	Fisher Chemicals	BP350-1	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Riscaldatore in linea	Sistema multicanale	TC02	Riscalda l'aCSF a 32-34 gradi; C per condizioni ottimali.
Sistema di perfusione Ismatec Ismatec		ISM4208	Mantiene un flusso continuo di aCSF ossigenato.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)Unità
registrazione	MaxOne Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Interfaccia tra il chip MaxOne e il sistema
MaxOne System	Maxwell Biosystems	Sistema core MX1-SYS	per ricodificazioni elettrofisiologiche basate su MEA.
MaxOne Tissue Holder con micromanipolatore a 3 assi e inserti sostituibili	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Assicura un posizionamento preciso della retina sul chip MEA.
Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Array di microelettrodi ad alta densità per la registrazione dell'attività neuronale.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Ago (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Aiuta a praticare incisioni nella cornea.
Animali neonatali (P1-P14; topo)			Organismi modello come topi, ratti o altri utilizzati per studi sulla retina.
PC con software MaxLab Live Scope	HP	Z4	Utilizzato per l'acquisizione dei dati e l'analisi delle registrazioni.
Piastra di Petri (35 mm o 60 mm)	Pyrex	3483E12	Utilizzato come spazio di lavoro per la dissezione.
Roboz micro Adson dadipe (RS-5232, 4,75" di lunghezza, 1 x 2 denti, punta da 0,5 mm)	Roboz	RS-5232	Pinze specializzate per la dissezione fine.
Forbici a molla Roboz (RS-5671, tagliente 10 mm, larghezza punta 0,15 mm, 3¾	Roboz	RS-5671	Forbici di precisione per il taglio di tessuti delicati.
Pennello			Piccolo pennello modificato in un singolo pelo per la manipolazione di tessuti delicati.
Due pinze a punta fine	Roboz	RS-5060	Utilizzato per la delicata manipolazione dei tessuti.
Carte da filtro Whatman (#1), tagliate in piccoli pezzi	GE Healthcare	1001-042	Utilizzate per la manipolazione e l'essiccazione di tessuti retinici.