Registrazioni di array multielettrodo ad alta densità di onde retiniche utilizzando una piattaforma di elettrofisiologia

Summary

Gli array multielettrodi ad alta densità (HD-MEA) sono utilizzati per studiare le onde retiniche spontanee, che svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo dei circuiti neurali. Questo protocollo delinea i passaggi per la preparazione del tessuto retinico di topo e l'esecuzione di registrazioni elettrofisiologiche utilizzando HD-MEA su una piattaforma di elettrofisiologia.

Abstract

Le onde retiniche spontanee sono un segno distintivo dell'attività della rete retinica durante lo sviluppo, svolgendo un ruolo cruciale nella formazione del sistema visivo influenzando l'affinamento degli assoni, la permeabilità della vascolarizzazione e la maturazione complessiva dei circuiti neurali. Queste onde sono comunemente studiate in preparazioni retiniche ex vivo utilizzando array multielettrodi (MEA), che consentono registrazioni elettrofisiologiche di ampie popolazioni di attività delle cellule gangliari retiniche (RGC). L'elettrofisiologia basata sulla MEA è diventata uno strumento potente grazie alla sua facilità d'uso per raccogliere rapidamente dati ad alto rendimento, rendendola così ideale per studiare l'attività retinica in una varietà di condizioni sperimentali.

In questo protocollo, delineiamo i passaggi critici per la preparazione del tessuto retinico per l'acquisizione di dati elettrofisiologici utilizzando un MEA ad alta densità (HD-MEA) su una piattaforma di elettrofisiologia. Il processo inizia con l'attento isolamento delle retine intatte da animali neonatali in condizioni fisiologiche. Una volta preparata, la retina viene montata con cura su un chip HD-MEA, che consiste in una griglia di 26.400 elettrodi in grado di eseguire registrazioni extracellulari simultanee da almeno 1.000 RGC. Le registrazioni possono durare fino a diverse ore. In definitiva, questo approccio metodologico offre preziose applicazioni nello studio dello sviluppo retinico, delle malattie e degli studi comparativi potenzialmente interspecie, contribuendo a progressi più ampi nelle neuroscienze e nella ricerca sulla visione.

Introduction

Le onde retiniche spontanee sono esplosioni periodiche di attività correlata osservate nella retina in via di sviluppo prima dell'inizio della visione. Nei topi, i circuiti che avviano e propagano le onde retiniche cambiano rapidamente durante lo sviluppo, iniziando embrionalmente e terminando all'apertura degli occhi (giorno postnatale 14)¹. Man mano che i circuiti retinici si sviluppano, le proprietà spazio-temporali delle onde retiniche cambiano drasticamente ^2,3. Diversi studi supportano che queste specifiche proprietà spazio-temporali istruiscono l....

Protocol

Questo protocollo delinea i passaggi per isolare e preparare il tessuto retinico da topi neonatali per le registrazioni MEA delle onde retiniche utilizzando la piattaforma HD-MEA di Maxwell Biosystems. La procedura è progettata per preservare le condizioni fisiologiche, garantendo che il tessuto retinico rimanga strutturalmente intatto, privo di danni e adeguatamente preparato per un contatto ottimale con gli elettrodi. Questi esperimenti sono stati approvati dal Vanderbilt Animal Care and Use Program, con il numero di protocollo M2200056-00. I topi (di 1-2 settimane, entrambi i sessi) sono stati alloggiati in un vivaio con ciclo gior....

Results

Registrazioni e analisi ad alto rendimento delle onde retiniche con HD-MEA
Abbiamo eseguito una registrazione HD-MEA di un'ora delle onde retiniche spontanee (Figura 2). Un grafico raster dell'attività neuronale mostra il modello strutturato delle onde retiniche, dove ogni punto rappresenta un potenziale d'azione rilevato da un singolo elettrodo (Figura 2A, in basso). La somma dell'attività tra gli elettrodi si traduce in una.......

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo riproducibile e ad alto rendimento per la preparazione del tessuto retinico e l'esecuzione di registrazioni HD-MEA, offrendo un metodo robusto per studiare l'attività della rete retinica. La tecnologia HD-MEA offre vantaggi significativi rispetto alle tradizionali tecniche elettrofisiologiche e di imaging, in particolare nell'acquisizione di dati ad alto rendimento. HD-MEA fornisce registrazioni accurate in tempo reale, su scala di milliseco.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipetta di trasferimento monouso da 3 mL (con estremità tagliata)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Aiuta a spostare la retina tra le piastre di Petri.
Liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)			Mantiene le condizioni fisiologiche del tessuto retinico; composto da NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucosio e bollato con carbogena.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)Apporto di
carboidrati (95% O2, 5% CO2)			Utilizzato per ossigenare l'aCSF e mantenere la vitalità dei tessuti.
Bisturi a lama curva (#10)	Integra	4-110	Utilizzato per tagliare i tessuti con precisione.
Microscopio da dissezione (stereoscopio)	Zeiss	Stemi 508	Essenziale per la visualizzazione e la manipolazione del tessuto retinico.
glucosio	Fisher Chemicals	BP350-1	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Riscaldatore in linea	Sistema multicanale	TC02	Riscalda l'aCSF a 32-34 gradi; C per condizioni ottimali.
Sistema di perfusione Ismatec Ismatec		ISM4208	Mantiene un flusso continuo di aCSF ossigenato.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)Unità
registrazione	MaxOne Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Interfaccia tra il chip MaxOne e il sistema
MaxOne System	Maxwell Biosystems	Sistema core MX1-SYS	per ricodificazioni elettrofisiologiche basate su MEA.
MaxOne Tissue Holder con micromanipolatore a 3 assi e inserti sostituibili	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Assicura un posizionamento preciso della retina sul chip MEA.
Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Array di microelettrodi ad alta densità per la registrazione dell'attività neuronale.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Per preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF)
Ago (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Aiuta a praticare incisioni nella cornea.
Animali neonatali (P1-P14; topo)			Organismi modello come topi, ratti o altri utilizzati per studi sulla retina.
PC con software MaxLab Live Scope	HP	Z4	Utilizzato per l'acquisizione dei dati e l'analisi delle registrazioni.
Piastra di Petri (35 mm o 60 mm)	Pyrex	3483E12	Utilizzato come spazio di lavoro per la dissezione.
Roboz micro Adson dadipe (RS-5232, 4,75" di lunghezza, 1 x 2 denti, punta da 0,5 mm)	Roboz	RS-5232	Pinze specializzate per la dissezione fine.
Forbici a molla Roboz (RS-5671, tagliente 10 mm, larghezza punta 0,15 mm, 3¾	Roboz	RS-5671	Forbici di precisione per il taglio di tessuti delicati.
Pennello			Piccolo pennello modificato in un singolo pelo per la manipolazione di tessuti delicati.
Due pinze a punta fine	Roboz	RS-5060	Utilizzato per la delicata manipolazione dei tessuti.
Carte da filtro Whatman (#1), tagliate in piccoli pezzi	GE Healthcare	1001-042	Utilizzate per la manipolazione e l'essiccazione di tessuti retinici.