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Articolo metodologico

Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

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DOI:

10.3791/68494

⸱

19 agosto 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo utilizza la modellazione computazionale per quantificare le soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili utilizzando la distribuzione spaziale delle cellule trasfettate all'interno di un imitatore tissutale tridimensionale per l'analisi ad alto rendimento dei protocolli di elettroporazione.

Abstract

L'elettroporazione è una tecnologia promettente che utilizza impulsi elettrici per la somministrazione di macromolecole e l'ablazione dei tessuti molli, con applicazioni che includono la profilassi di nuova generazione e il trattamento di malattie genetiche come il cancro. Questo studio dimostra un modello di coltura tissutale 3D ad alto rendimento per la quantificazione delle soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili per un determinato protocollo di elettroporazione. Utilizzando un campo elettrico non uniforme e analizzando la distribuzione spaziale delle cellule trasfettate, è possibile identificare soglie reversibili e irreversibili all'interno di un singolo campione, aumentando l'efficienza con cui è possibile caratterizzare i protocolli di elettroporazione, in particolare per la traduzione in vivo . Per dimostrare questa capacità, i imitatori tissutali 3D contenenti cellule HEK293 sono stati trasfettati utilizzando un anello e un elettrodo a spillo per fornire un plasmide codificante GFP. Le soglie di elettroporazione sono state quindi derivate sulla base di immagini al microscopio fluorescente dei campioni trasfettati. Questo modello dimostra il potenziale per l'uso come mezzo per la valutazione ad alto rendimento dei protocolli di elettroporazione, un vantaggio chiave rispetto ai metodi attuali per valutare queste soglie, che tendono ad essere dispendiose in termini di tempo e sono meno rappresentative delle condizioni in vivo .

Introduzione

L'elettroporazione reversibile (RE) è una metodologia consolidata per la somministrazione di una varietà di composti e molecole normalmente impermeabili alla membrananelle cellule 1,2,3. Qui, i campi elettrici pulsati (PEF) vengono utilizzati per ottenere un'intensità di campo elettrico critica che induce nanopori transitori e localizzati lungo porzioni della membrana cellulare. Il RE è stato utilizzato per fornire una varietà di molecole e composti che vanno dai coloranti e acidi nucleici ai chemioterapici e altri farmaci 4,5,6,7,8,9,10. Tuttavia, se l'intensità del campo elettrico viene aumentata a sufficienza, può raggiungere una soglia critica più elevata, che si traduce in un rapido declino della vitalità cellulare 1,2,11,12. Questo processo è noto come elettroporazione irreversibile (IRE) ed è stato studiato per l'ablazione dei tessuti molli, anche come trattamento per tumori altrimenti inoperabili e aritmie cardiache 11,12,13,14,15,16. Per comprendere i risultati del trattamento e informare i trattamenti futuri, la quantificazione di queste soglie RE e IRE è una pratica comune nella ricerca sull'elettroporazione 12,17,18,19,20. Tuttavia, le soglie RE e IRE variano a seconda di molti fattori, tra cui il tipo di cella, la tensione applicata, la durata dell'impulso, il numero di impulsi e la velocità di erogazione degli impulsi 1,17,18,21,22.

I protocolli di elettroporazione hanno una serie di parametri che si traducono in soglie RE e IRE variabili 1,17,18,21,22. Le tensioni e le forme d'onda ottimali del trattamento sono state a lungo studiate. La maggior parte delle tecnologie di elettroporazione disponibili in commercio utilizza protocolli con PEF monopolari dell'ordine di 100 μs-10 ms23. Sebbene questi protocolli raggiungano risultati clinicamente rilevanti, inducono intense contrazioni muscolari in vivo 24,25,26. Per questo motivo, gli impulsi bipolari di microsecondi più brevi, che alleviano questa stimolazione, sono diventati un recente argomento di interesse 1,11,24. Tuttavia, questi impulsi introducono nuovi fattori che influenzano le soglie RE e IRE, tra cui la simmetria degli impulsi, la durata del burst e la dipendenza dalla temperatura 1,17,22,27. Inoltre, è stato dimostrato che il tipo di cellula e le proprietà dei tessuti influenzano in modo significativo gli esiti sia di RE che di IRE 19,28,29. Poiché il campo continua ad evolversi, è necessario caratterizzare ulteriormente il modo in cui questi fattori e le loro interazioni reciproche e altri possibili fattori ambientali influenzano le soglie RE e IRE, rendendo sempre più necessario migliorare l'efficienza sperimentale per consentire una sperimentazione a più alto rendimento.

I tipici esperimenti di elettroporazione in vitro testano i protocolli trattando le cellule in una cuvetta con piastre conduttive parallele, il che si traduce in una distribuzione uniforme del campo elettrico all'interno della cuvetta durante il trattamento 19,30,31,32,33,34. Come accennato in precedenza, è necessario identificare le soglie RE e/o IRE di un protocollo per identificare una tensione applicata ottimale per un determinato trattamento. Affinché ciò possa essere ottenuto negli studi sulle cuvette, è necessario trattare più cuvette, ciascuna con tensioni applicate discrete. Ciò richiede un numero significativo di campioni che devono essere preparati, trattati e analizzati separatamente, limitando la produttività sperimentale. Per migliorare questo processo, sono stati sviluppati modelli di coltura 2D35,36 e 3D 13,20,27,37,38,39 per valutare un continuum di intensità di campo in un singolo campione utilizzando elettrodi che creano distribuzioni di campo non uniformi 13,20,27,37,38,39. Le soglie RE e IRE sono quindi derivate da modelli computazionali della distribuzione del campo elettrico 13,20,27,37,38. Ciò riduce notevolmente il numero di campioni necessari, consentendo un approccio più ad alto rendimento alla quantificazione delle soglie.

Questo articolo mira a dimostrare questo approccio per la quantificazione del campo RE e IRE in un modello 3D in vitro per dimostrare il suo potenziale come mezzo per una valutazione efficiente dei protocolli di elettroporazione in diversi ambienti (ad esempio, tipi di cellule, parametri di trattamento, molecole da consegnare).

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Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione delle cellule

  1. In una cappa di biosicurezza, la piastra 1 × 105 cellule/mL della linea cellulare HEK293 in un volume di 10 mL per coltura tissutale T75 in Minimum Essential Medium di Eagle integrata con il 10% (v/v) di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Incubare le cellule HEK293 in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 in ambiente.
  3. Raccogliere le cellule per gli esperimenti 2 giorni dopo la semina rimuovendo il terreno di coltura e trattando le cellule con 4 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%.
  4. Incubare le cellule e la tripsina per 3-5 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 o fino a quando le cellule non si staccano dalla superficie di coltura.
  5. Inattivare l'attività enzimatica della tripsina aggiungendo 4 mL di terreno di coltura.
  6. Pellettare le cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 180 × g e risospendere in terreno di coltura fino a una concentrazione finale di 8 × 106 cellule/mL.

2. 3D creazione di modelli di tessuto

NOTA: Utilizzare il pipettaggio inverso per questi passaggi per evitare l'introduzione di bolle d'aria nella miscela.

  1. In una cabina di biosicurezza, miscelare accuratamente la sospensione di cellule preparata da 8 × 106 cellule/mL con la soluzione di collagene bovino di tipo I (3 mg/mL) in rapporto 1:1. Mettere su ghiaccio o in un bagno di perline fredde per evitare la polimerizzazione prematura mentre si lavora con la miscela.
  2. Pipettare 500 μl della soluzione combinata per rivestire il fondo di ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Assicurati che il gel ricopra il fondo in modo uniforme iniziando a erogare la soluzione al centro del pozzetto e poi spiraleggiando delicatamente verso l'esterno.
  3. Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che i bordi del gel entrino in contatto con le pareti del pozzetto.
  4. Incubare i gel in un'incubatrice umidificata a 37 °C con CO2 al 5% per 6 ore o fino a quando i gel diventano sodi e non si muovono quando si inclina la piastra.
  5. Inclinare la piastra a pozzetti e aggiungere delicatamente 500 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra almeno 1 ora prima del trattamento. I gel devono essere trattati entro 48 ore dalla creazione.

3. Fabbricazione di elettrodi

  1. Rimuovere la connessione Luer in plastica su due aghi per siringa con punta smussata in acciaio inossidabile 304 da 1,64 mm. Metti da parte un ago che funga da elettrodo a spillo. Per l'altro ago, appiattire gli ultimi 5 mm di un'estremità.
  2. Creare l'elettrodo ad anello tagliando una sezione di tubo in acciaio inossidabile 316 di diametro esterno di 19 mm, sufficientemente lunga da essere posizionata a filo contro il fondo della piastra a pozzetti.
  3. Progettare un portaelettrodo come mostrato nella Figura 1 con il software CAD. Assicurarsi che il supporto abbia un foro centrale per l'elettrodo a spillo, una scanalatura per l'elettrodo ad anello e un foro che interseca la scanalatura in modo che l'ago appiattito possa essere inserito per creare un accoppiamento a pressione che tenga in posizione l'elettrodo ad anello.
    1. Inoltre, assicurarsi che il supporto abbia un labbro progettato per adattarsi perfettamente a una piastra a 12 pozzetti e per centrare gli elettrodi ad anello e a perno nel pozzetto in modo che gli elettrodi e il pozzetto siano tutti coassiali38.
  4. Fabbricare il portaelettrodo in acrilico utilizzando tecniche di taglio laser consolidate40.
  5. Assemblare l'elettrodo inserendo gli elettrodi ad anello e a perno nel portaelettrodo.
  6. Fissare l'elettrodo ad anello inserendo a pressione l'ago con un'estremità appiattita nel supporto.

4. Trattamento del modello tissutale 3D con elettroporazione

  1. In una cappa di biosicurezza, inclinare la piastra e aspirare 400 μL di terreno di coltura da ciascun pozzetto. Fare attenzione a non entrare in contatto con il gel. 100 μL di terreno devono essere lasciati in ogni pozzetto aspirato per mantenere l'idratazione del gel. Se ci sono meno di 400 μl di liquido da aspirare (la pipetta non lascia liquido/aspira aria), aggiungere 100 μl di terreno di coltura.
  2. Aggiungere 20 μL di soluzione plasmidica GFP da 5 μg/μL a questi pozzetti aspirati (per un volume totale di 120 μL per pozzetto) inclinando la piastra e aggiungendo il reagente al fluido che si accumula contro la parete di ciascun pozzetto. Agitare delicatamente per assicurarsi che si distribuisca uniformemente sulla superficie del gel.
  3. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per 10 minuti.
  4. Inserire la sonda di temperatura in fibra ottica nell'elettrodo a spillo e iniziare a leggere la temperatura.
  5. Collegare il cavo positivo dell'elettroporatore all'elettrodo a spillo e il cavo negativo all'ago che fissa l'elettrodo ad anello.
  6. Accendi la piastra calda e riscalda i gel in modo che mantengano una temperatura di 37 °C.
  7. Inserire l'elettrodo ad anello e pin con sonda di temperatura in fibra ottica nel pin nel pozzetto. Assicurarsi che il perno sia perpendicolare alla piastra e che entrambi gli elettrodi siano completamente a contatto con il gel.
  8. Assicurarsi che il gel sia a 37 °C.
  9. Erogare il trattamento di elettroporazione.
  10. Aggiungere 100 μl di terreno a tutti i gel che appaiono asciutti.
  11. Ripetere i passaggi 4.7-4.10.
  12. Una volta completati tutti i trattamenti, incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% in ambiente per 10 minuti.
  13. Inclinare la piastra a pozzetti e aggiungere delicatamente 500 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra.
  14. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per 24 ore.

5. Lavaggio e imaging

  1. Inclinare la piastra e aspirare i terreni di coltura da ciascun pozzetto. Fare attenzione a non entrare in contatto con il gel.
  2. Inclinare la piastra e aggiungere delicatamente 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra.
  3. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per 5 minuti.
  4. Inclinare la piastra e aspirare il PBS da ogni pozzetto. Fare attenzione a non entrare in contatto con il gel.
  5. Inclinare la piastra e aggiungere delicatamente 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra.
  6. Agitare delicatamente la piastra, inclinarla e aspirare il PBS da ciascun pozzetto. Fare attenzione a non entrare in contatto con il gel.
  7. Aggiungere 100 μl di PBS fresco per mantenere i gel idratati per l'imaging.
  8. Lastra ai fosfori con tecniche standard di microscopia a fluorescenza. Questo dovrebbe produrre immagini di gel con una distinta regione verde a forma di toroide in cui le soglie del campo elettrico reversibile e irreversibile delimitano rispettivamente i bordi esterno e interno della regione.
  9. Inclinare la piastra a pozzetti e aggiungere delicatamente 500 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra.
  10. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per 24 ore.
  11. Ripetere i passaggi 5.1-5.10 per ogni punto temporale.

6. Creazione di modelli computazionali

  1. Apri un software di simulazione fisica e crea un nuovo modello assialsimmetrico 2D che utilizza la fisica delle correnti elettriche, dei trasferimenti di calore nei solidi e del riscaldamento elettromagnetico.
  2. Crea parametri per la tensione, la temperatura ambiente, la temperatura della piastra calda, il setpoint di temperatura, la velocità di erogazione degli impulsi, la dose elettrica integrata e le dimensioni degli elettrodi ad anello e a spillo, del gel e della piastra a pozzetti della configurazione sperimentale.
  3. Creare geometrie di dominio che rappresentino una sezione trasversale radiale degli elettrodi ad anello e a spillo, il gel e la piastra a pozzetti della configurazione sperimentale, come mostrato nella Figura 2A.
  4. Posizionare un punto della sonda all'interno dell'elettrodo centrale a metà dell'altezza del gel per rappresentare la sonda di temperatura in fibra ottica utilizzata durante la sperimentazione in vitro.
  5. Creare una funzione a tratti che utilizza la temperatura come argomento di input.
  6. Definire la funzione in modo tale che il suo valore sia 1 quando la temperatura è inferiore al parametro del setpoint di temperatura definito al punto 6.2 e 0 in caso contrario.
  7. Applicare una condizione al contorno Tensione alla superficie più alta della geometria del dominio che rappresenta l'elettrodo a spillo e impostare il valore della tensione sul parametro di tensione definito nel passaggio 6.2 moltiplicato per la funzione a tratti del passaggio 6.6 valutata alla temperatura del punto della sonda creata nel passaggio 6.4.
  8. Applicare una condizione al contorno Ground alla superficie più alta della geometria del dominio che rappresenta l'elettrodo ad anello.
  9. Applicare una condizione al contorno di isolamento elettrico a tutti i limiti di dominio rimanenti.
  10. Creare una funzione continua che utilizza la temperatura.
  11. Definire la funzione utilizzando un modellostabilito 27 della conducibilità dipendente dalla temperatura del gel di collagene come 0,8277 + 0,0323*T.
  12. Definire un materiale personalizzato e impostare la conducibilità elettrica sulla funzione continua definita al punto 6.11. Applicare questo materiale al dominio del gel.
  13. Definire i materiali o utilizzare le impostazioni predefinite del software, se disponibili, per assegnare materiali in acciaio inossidabile 304 e 316 rispettivamente ai domini degli elettrodi pin e ad anello e il polistirene ai domini della piastra del pozzetto.
  14. Applicare una condizione al contorno di temperatura alla base del modello e impostare il valore della temperatura su 37 °C.
  15. Applicare una condizione al contorno di radiazione ambientale superficiale a tutti gli altri bordi del dominio che non si interfacciano con un altro dominio e impostare l'emissività su 0,97, 0,9 e 0,075, a seconda che il dominio facesse parte della piastra, del gel o dell'elettrodo, rispettivamente27.
  16. Aggiungete una mesh triangolare libera al modello. Impostate la dimensione dell'elemento su Più fine.
  17. Se si valuta una varietà di livelli di parametro, creare uno sweep parametrico che elenchi tutti i valori in base ai quali un parametro deve essere valutato.
  18. Eseguire la simulazione facendo clic sul pulsante Computa .
  19. Al termine, creare un grafico della linea di taglio 2D del campo elettrico nella sezione Risultati.
  20. Definire la linea di taglio per passare dall'elettrodo a spillo all'elettrodo ad anello attraverso il centro del dominio del gel. Ciò dovrebbe comportare un decadimento esponenziale dal bordo dell'elettrodo a spillo al bordo dell'elettrodo ad anello.
  21. Esportare i dati del grafico come file di .csv o .xlsx per creare una tabella di ricerca.

7. Derivazione della soglia

  1. Utilizzando il software del microscopio, misurare il diametro dei bordi esterni e interni della regione a forma di toroide lungo gli assi verticale e orizzontale. Se il software non dispone di questa funzionalità, utilizzare ImageJ per eseguire questa operazione.
  2. Fare la media dei diametri esterno e interno, rispettivamente, e dividere per due per calcolare i raggi esterno e interno della regione a forma di toroide. Il raggio esterno delimita la soglia RE. Il raggio interno indica la soglia IRE.
  3. Utilizzando la tabella di ricerca creata nel passaggio 6.21, derivare l'intensità del campo elettrico ai raggi misurati.

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Risultati

L'anello e l'elettrodo a spillo hanno consegnato con successo un plasmide di DNA che codifica una proteina fluorescente verde (GFP) in imitazioni di tessuto di collagene 3D incorporate con cellule HEK293. La quantificazione della soglia RE è stata ottenuta misurando il raggio esterno della regione trasfettata e derivando l'intensità di campo corrispondente dal modello computazionale della configurazione sperimentale, come mostrato nella Figura 2. La soglia IR...

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Discussione

Con questo metodo, è possibile identificare soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili senza la necessità di testare più campioni a tensioni discrete. L'uso di un campo elettrico non uniforme consente la quantificazione basata sulla distribuzione spaziale delle cellule trasfettate nel modello. Tuttavia, ci sono limitazioni associate a questa distribuzione non uniforme. Innanzitutto, le soglie RE e IRE qui descritte sono le soglie per il successo della trasfezione e della mort...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno divulgazioni.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato svolto presso la North Carolina State University e finanziato dal National Institutes of Health (R01CA272550).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% tripsina-EDTAGibco25200056
Puntali per pipette da 1000 uLFisher Scientifico13-811-164
Provetta conica da 15 mLFisher Scientifico14-959-70C
Puntali per pipette da 200 uLFisher Scientifico13-811-139
Aghi a punta smussata in acciaio inossidabile 304McMaster CarrCodice: 75165A753
Tubi in acciaio inox 316McMaster CarrCodice 89785K319
AcrilicoMcMaster CarrCodice 8505K754
Armadio di biosicurezzaFisher Scientifico13-261-312
Programmi CADSistemi DassaultSolidWorks
CentrifugaNuaireNU-C200R
ElettroporatoreHbio45-0662In questo studio sono stati utilizzati un dispositivo personalizzato e un sistema BTX ECM 830
EMEMFisher ScientificoMT10009CVQuesto può variare  se si utilizza una linea cellulare diversa da HEK293
Piastra per coltura cellulare multipozzetto con TC a fondo piatto trasparente Falcon a 12 pozzetti, con coperchioCorning353043È possibile utilizzare qualsiasi piastra a 12 pozzetti, basta assicurarsi che le dimensioni del pozzetto siano prese in considerazione quando si fabbrica il portaelettrodo.
FBSFisher ScientificoA5670701
Sonda di temperatura in fibra otticaMicronor Inc.TS5-20MM-02
Plasmide GFPAldeverongWiz-GFP
Celle HEK293ATCCCodice CRL-1573È possibile utilizzare altre linee cellulari, è sufficiente assicurarsi che venga utilizzato il terreno di coltura corretto
Piastra riscaldanteRaffreddamento termoelettrico America CorporationAHP-301CPV
Bagno di perline con ghiaccio o refrigeratoFisher Scientifico10-876-001
Software di analisi delle immaginiLeicaLAS X
IncubatriceFisher Scientifico15-015-2633
Microscopio a fluorescenza invertitoLeicaDMi8
Taglio laserMcMaster CarrCodice: 7344N11
Penicillina-streptomicinaFisher Scientifico15140122
Pipette KitFisher Scientifico14-388-100
Software di simulazioneIL BAGNOCOMSOL Multiphysics 6.2
Pallone T75Fisher Scientifico156499
Soluzione di collagene bovino di tipo IBiomatrice avanzata50053 mg/mL

Riferimenti

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