Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

Summary

Questo protocollo utilizza la modellazione computazionale per quantificare le soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili utilizzando la distribuzione spaziale delle cellule trasfettate all'interno di un imitatore tissutale tridimensionale per l'analisi ad alto rendimento dei protocolli di elettroporazione.

Abstract

L'elettroporazione è una tecnologia promettente che utilizza impulsi elettrici per la somministrazione di macromolecole e l'ablazione dei tessuti molli, con applicazioni che includono la profilassi di nuova generazione e il trattamento di malattie genetiche come il cancro. Questo studio dimostra un modello di coltura tissutale 3D ad alto rendimento per la quantificazione delle soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili per un determinato protocollo di elettroporazione. Utilizzando un campo elettrico non uniforme e analizzando la distribuzione spaziale delle cellule trasfettate, è possibile identificare soglie reversibili e irreversibili all'interno di un singolo campione, aumentando l'efficienza con cui è possibile caratterizzare i protocolli di elettroporazione, in particolare per la traduzione in vivo . Per dimostrare questa capacità, i imitatori tissutali 3D contenenti cellule HEK293 sono stati trasfettati utilizzando un anello e un elettrodo a spillo per fornire un plasmide codificante GFP. Le soglie di elettroporazione sono state quindi derivate sulla base di immagini al microscopio fluorescente dei campioni trasfettati. Questo modello dimostra il potenziale per l'uso come mezzo per la valutazione ad alto rendimento dei protocolli di elettroporazione, un vantaggio chiave rispetto ai metodi attuali per valutare queste soglie, che tendono ad essere dispendiose in termini di tempo e sono meno rappresentative delle condizioni in vivo .

Introduction

L'elettroporazione reversibile (RE) è una metodologia consolidata per la somministrazione di una varietà di composti e molecole normalmente impermeabili alla membrana^{nelle cellule 1,2,3}. Qui, i campi elettrici pulsati (PEF) vengono utilizzati per ottenere un'intensità di campo elettrico critica che induce nanopori transitori e localizzati lungo porzioni della membrana cellulare. Il RE è stato utilizzato per fornire una varietà di molecole e composti che vanno dai coloranti e acidi nucleici ai chemioterapici e altri farmaci

Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione delle cellule

1. In una cappa di biosicurezza, la piastra 1 × 10⁵ cellule/mL della linea cellulare HEK293 in un volume di 10 mL per coltura tissutale T75 in Minimum Essential Medium di Eagle integrata con il 10% (v/v) di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina.
2. Incubare le cellule HEK293 in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂ in ambiente.
3. Raccogliere le cellule per gli esperiment....

Results

L'anello e l'elettrodo a spillo hanno consegnato con successo un plasmide di DNA che codifica una proteina fluorescente verde (GFP) in imitazioni di tessuto di collagene 3D incorporate con cellule HEK293. La quantificazione della soglia RE è stata ottenuta misurando il raggio esterno della regione trasfettata e derivando l'intensità di campo corrispondente dal modello computazionale della configurazione sperimentale, come mostrato nella Figura 2. La soglia IR.......

Discussion

Con questo metodo, è possibile identificare soglie di elettroporazione reversibili e irreversibili senza la necessità di testare più campioni a tensioni discrete. L'uso di un campo elettrico non uniforme consente la quantificazione basata sulla distribuzione spaziale delle cellule trasfettate nel modello. Tuttavia, ci sono limitazioni associate a questa distribuzione non uniforme. Innanzitutto, le soglie RE e IRE qui descritte sono le soglie per il successo della trasfezione e della mort.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	25200056
Puntali per pipette da 1000 uL	Fisher Scientifico	13-811-164
Provetta conica da 15 mL	Fisher Scientifico	14-959-70C
Puntali per pipette da 200 uL	Fisher Scientifico	13-811-139
Aghi a punta smussata in acciaio inossidabile 304	McMaster Carr	Codice: 75165A753
Tubi in acciaio inox 316	McMaster Carr	Codice 89785K319
Acrilico	McMaster Carr	Codice 8505K754
Armadio di biosicurezza	Fisher Scientifico	13-261-312
Programmi CAD	Sistemi Dassault	SolidWorks
Centrifuga	Nuaire	NU-C200R
Elettroporatore	Hbio	45-0662	In questo studio sono stati utilizzati un dispositivo personalizzato e un sistema BTX ECM 830
EMEM	Fisher Scientifico	MT10009CV	Questo può variare  se si utilizza una linea cellulare diversa da HEK293
Piastra per coltura cellulare multipozzetto con TC a fondo piatto trasparente Falcon a 12 pozzetti, con coperchio	Corning	353043	È possibile utilizzare qualsiasi piastra a 12 pozzetti, basta assicurarsi che le dimensioni del pozzetto siano prese in considerazione quando si fabbrica il portaelettrodo.
FBS	Fisher Scientifico	A5670701
Sonda di temperatura in fibra ottica	Micronor Inc.	TS5-20MM-02
Plasmide GFP	Aldeveron	gWiz-GFP
Celle HEK293	ATCC	Codice CRL-1573	È possibile utilizzare altre linee cellulari, è sufficiente assicurarsi che venga utilizzato il terreno di coltura corretto
Piastra riscaldante	Raffreddamento termoelettrico America Corporation	AHP-301CPV
Bagno di perline con ghiaccio o refrigerato	Fisher Scientifico	10-876-001
Software di analisi delle immagini	Leica	LAS X
Incubatrice	Fisher Scientifico	15-015-2633
Microscopio a fluorescenza invertito	Leica	DMi8
Taglio laser	McMaster Carr	Codice: 7344N11
Penicillina-streptomicina	Fisher Scientifico	15140122
Pipette Kit	Fisher Scientifico	14-388-100
Software di simulazione	IL BAGNO	COMSOL Multiphysics 6.2
Pallone T75	Fisher Scientifico	156499
Soluzione di collagene bovino di tipo I	Biomatrice avanzata	5005	3 mg/mL