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Articolo metodologico

Rilevamento dell'acido nucleico Mycoplasma pneumoniae e del gene di resistenza ai farmaci

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DOI:

10.3791/68500

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19 settembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 2Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 3Department of Clinical Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern Medical University, 4Medical laboratory, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Doctors Station of Guangdong province, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un modo rapido e affidabile per rilevare le infezioni da Mycoplasma pneumoniae e identificare la resistenza agli antibiotici. Aiuta i medici a scegliere i trattamenti giusti più velocemente, migliorando l'assistenza ai pazienti con polmonite e supportando un migliore uso degli antibiotici

Abstract

Il Mycoplasma pneumoniae (Mp) rappresenta uno dei patogeni più diffusi responsabili della polmonite acquisita in comunità (CAP) nelle popolazioni pediatriche. L'individuazione dei geni di resistenza al Mycoplasma pneumoniae fornisce un solido supporto tecnico e una base teorica per la diagnosi clinica e il trattamento precisi delle infezioni da MP. Una diagnosi e una valutazione accurate della resistenza ai farmaci nell'infezione da Mp sono essenziali per il trattamento clinico. I metodi di rilevamento comuni per Mycoplasma pneumoniae includono la coltura, la rilevazione di anticorpi e i saggi basati sulla biologia molecolare. La coltura Mp è il gold standard per la diagnosi, ma richiede un mezzo specifico, richiede molto tempo e ha una bassa sensibilità. La rilevazione di Mp basata su anticorpi è ampiamente utilizzata; Tuttavia, i falsi negativi possono verificarsi nella fase iniziale dell'infezione. La rilevazione basata sulla biologia molecolare offre tempi di risposta rapidi, basso rischio di contaminazione, elevata sensibilità, elevata specificità e non è limitata dai tempi di raccolta del campione o dallo stato immunitario. È stato quindi riconosciuto come un nuovo gold standard per la diagnosi dell'infezione da Mycoplasma pneumoniae . Gli agenti macrolidi sono il trattamento di prima scelta per l'infezione da Mp nei bambini. Tuttavia, con l'uso estensivo di macrolidi nelle infezioni del tratto respiratorio nei bambini, l'incidenza dell'infezione da Mycoplasma pneumoniae resistente ai farmaci è in aumento. I pazienti infettati da ceppi resistenti sperimentano una durata della febbre significativamente più lunga, un ricovero prolungato e febbre prolungata dopo la somministrazione rispetto a quelli infettati da ceppi sensibili. I siti di mutazione identificati fino ad oggi includono 2063, 2064, 2067 e 2617. In Cina, le mutazioni puntiformi sono state documentate solo nelle posizioni 2063 e 2064, con una sostituzione da A a G nella posizione 2063 che è la più comune. Per questi siti, la reazione a catena della polimerasi (PCR) combinata con la tecnologia delle sonde fluorescenti è stata impiegata per rilevare gli acidi nucleici e le mutazioni di resistenza ai farmaci di Mycoplasma pneumoniae in campioni di espettorato umano. L'individuazione dei geni di resistenza al Mycoplasma pneumoniae offre un supporto tecnico cruciale e una base teorica per una diagnosi accurata e un trattamento efficace dell'infezione da Mp.

Introduzione

Il Mycoplasma pneumoniae (Mp) è il più piccolo microrganismo patogeno in grado di sopravvivere autonomamente, situato in una posizione intermedia tra batteri e virus. È disseminato principalmente da goccioline respiratorie o aerosol e costituisce il secondo patogeno più comune associato alla polmonite acquisita in comunità (CAP) nei bambini1, responsabile dal 20% al 40% dei casi di CAP2. Il Mp mostra una resistenza intrinseca agli antibiotici β-lattamici, come la penicillina e le cefalosporine, a causa della sua assenza di una parete cellulare, che questi antibiotici prendono di mira ostruendo la sintesi della parete cellulare. Le principali modalità terapeutiche per le infezioni da Mp comprendono agenti che ostruiscono la sintesi proteica, tra cui macrolidi e tetracicline, insieme a farmaci che impediscono la replicazione del DNA, come le tetracicline e i fluorochinoloni 3,4,5. Pertanto, la tempestiva identificazione di laboratorio di Mp è essenziale per informare l'applicazione giudiziosa degli antibiotici. I metodi di rilevamento di laboratorio contemporanei per la Mp comprendono l'isolamento e la coltura, la rilevazione dell'antigene, la rilevazione degli anticorpi e le tecniche di diagnostica genetica.

Come metodo di rilevamento tradizionale, l'isolamento e la coltura continuano a essere lo standard definitivo per la diagnosi dell'infezione da Mycoplasma pneumoniae . Kashyap et al. hanno osservato che la coltura di Mp da tamponi faringei o campioni di espettorato è una tecnica diagnostica affidabile6. Questo approccio incontra ostacoli considerevoli, come i rigorosi prerequisiti culturali di Mp, i periodi di coltura prolungati e i tassi di rilevamento positivo tipicamente bassi, che ne limitano l'uso clinico di routine. Il rilevamento dell'antigene Mp dipende dagli anticorpi specifici per Mp. Miyashita et al. hanno utilizzato anticorpi monoclonali di vari ceppi di Mp come agenti di rivestimento in un ELISA a sandwich a doppio anticorpo e ne hanno valutato l'efficacia utilizzando la PCR7. I risultati non hanno rivelato differenze sostanziali tra le due metodologie. Tuttavia, la necessità di anticorpi monoclonali altamente specifici e ad alto titolo limita l'ampia implementazione di questo metodo.

In seguito all'infezione da Mp, il sistema immunitario genera anticorpi specifici IgM e IgG. Gli anticorpi IgM generalmente diventano rilevabili entro 1 settimana dall'infezione e raggiungono il loro picco a 3 o 4 settimane, rendendoli preziosi indicatori diagnostici per l'infezione precoce. Tuttavia, nelle fasi iniziali possono verificarsi risultati falsi negativi a causa della diminuzione dei livelli di anticorpi8. Al contrario, gli anticorpi IgG si manifestano più tardi e in genere indicano una precedente infezione 9,10. La rilevazione sierologica di Mp è classificata in saggi anticorpali non specifici e specifici. Sebbene i test anticorpali non specifici siano semplici da somministrare, la loro specificità è limitata, poiché le infezioni da altri agenti patogeni, tra cui rickettsia e adenovirus, possono anche aumentare i livelli di agglutinine fredde, con conseguenti risultati falsi positivi. I test anticorpali specifici comprendono il test di fissazione del complemento, il test di agglutinazione di particelle, il test di emoagglutinazione indiretta, il test di immunofluorescenza indiretta e il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). L'ELISA è ampiamente utilizzato in Cina grazie alla sua tecnologia consolidata e all'accessibilità commerciale, che fornisce un'elevata sensibilità e semplicità operativa, fungendo così da metodo pratico e affidabile per la diagnosi delle infezioni da Mp nella pratica clinica di routine11.

La PCR quantitativa fluorescente in tempo reale si distingue per il rapido tempo di elaborazione, l'elevata specificità, la robusta sensibilità e l'assenza di cross-reattività. Questo metodo identifica il Mp DNA in campioni di espettorato, tampone faringeo o liquido di lavaggio bronchiale e richiede da 1 a 100 ng di DNA per reazione. Il rilevamento è stato eseguito utilizzando uno strumento PCR in tempo reale. Il modello di DNA subisce la denaturazione a temperature più elevate, seguita dalla ricottura del primer e dall'ibridazione con sonda fluorescente. La tecnologia di amplificazione genica consente la replicazione di frammenti di acido nucleico a concentrazioni estremamente basse fino a milioni di copie in un breve lasso di tempo, raggiungendo una sensibilità di rilevamento di ≥10 CFU/mL12. Rispetto alla PCR convenzionale, la PCR quantitativa fluorescente in tempo reale riduce i rischi di contaminazione, consentendo al contempo un'analisi automatizzata e ad alto rendimento. Pertanto, è emersa come la tecnica preferita per la rilevazione diretta di Mp nella pratica clinica13. A causa della sua maggiore sensibilità, sono necessarie misure rigorose per evitare la contaminazione, che potrebbe portare a risultati falsi positivi o falsi negativi.

Nel trattamento clinico, i macrolidi costituiscono l'intervento terapeutico primario per la polmonite da Mycoplasma pneumoniae (MPP). L'uso eccessivo e l'applicazione impropria di antibiotici hanno imposto una pressione selettiva, portando alla comparsa di Mp resistente ai macrolidi. Questa resistenza contribuisce in modo significativo all'MPP refrattario. La resistenza ai macrolidi nel Mycoplasma pneumoniae è notevolmente elevata nell'Asia orientale, in particolare in Cina e Giappone, mentre l'Europa e gli Stati Uniti mostrano tassi di resistenza relativamente più bassi. I pazienti pediatrici generalmente dimostrano tassi di resistenza elevati rispetto agli adulti, il che richiede un esame approfondito14. Dal 2000, l'incidenza delle infezioni da Mycoplasma pneumoniae (MRMPI) è aumentata in modo significativo su scala globale, soprattutto nell'Asia orientale. In Cina, i ceppi MRMPI costituiscono dal 69% al 95% dei casi15, contribuendo in modo sostanziale alla malattia grave, al fallimento del trattamento, alle complicanze e alle sequele a lungo termine. La ricerca indica che le mutazioni nel gene 23S rRNA inibiscono il legame dei macrolidi ai siti bersaglio, diminuendo di conseguenza l'efficacia del farmaco. I loci di mutazione frequente comprendono le posizioni 2063, 2064, 2067 e 2617. In Cina, le mutazioni sono state identificate esclusivamente nelle posizioni 2063 e 2064 16,17. Uno studio del 2016 ha indicato che i tassi di resistenza ai macrolidi a Pechino, Harbin, Shanghai e Xinjiang variavano tra il 66,7% e l'86,7%, mentre Nanchino mostrava un tasso inferiore del 20%18. I ceppi resistenti ai macrolidi sono emersi in varie regioni, con tassi di resistenza riportati come segue: 8,3%-9,8% in Francia, 3,0%-3,6% in Germania, 8,2% negli Stati Uniti, 0,9%-2,9% in Danimarca, 12,1% in Canada, 20% in Italia, 22% in Israele, 8% in Spagna e 9,3% nel Regno Unito 19,20,21,22,23,24,25,26, 27. Questa tendenza evidenzia la proliferazione mondiale della resistenza ai macrolidi. Nel 2008, Hindley et al. hanno riportato 46 casi di Mycoplasma pneumoniae resistente ai macrolidi, con 40 casi che dimostravano la mutazione A2063G, un caso che presentava la mutazione A2063C e cinque casi che mostravano la mutazione A2064G28. Mutazioni di resistenza comparabili sono state identificate in Giappone e negli Stati Uniti, con le mutazioni primarie che si verificano nelle posizioni 2063 e 206429. La ricerca suggerisce una relazione tra i siti di mutazione e i fenotipi di resistenza ai farmaci: la mutazione A2063G conferisce resistenza ai macrolidi a 14 membri (ML), la mutazione A2064G conferisce resistenza a ML a 14 e 16 membri, C2617G conferisce resistenza a ML a 14 e 15 membri e la mutazione A2067G conferisce resistenza a ML30 a 16 membri. Il monitoraggio della resistenza alla Mp è fondamentale per l'identificazione precoce delle infezioni resistenti ai farmaci e per informare le scelte terapeutiche cliniche. Gli studi hanno dimostrato che i test di suscettibilità antimicrobica in vitro possono prevedere l'efficacia clinica dei farmaci31. Nel 2011, l'American Clinical and Laboratory Standards Institute ha promulgato linee guida che sostengono il metodo della microdiluizione per accertare la concentrazione inibitoria minima (MIC) per valutare la resistenza ai macrolidi32. Tuttavia, la determinazione della MIC può richiedere diverse settimane, limitando così la sua utilità clinica nel dirigere la terapia antibiotica in tempo reale.

Il sequenziamento Sanger è una tecnica diretta per identificare le mutazioni nel gene 23S rRNA di Mp. Questo metodo utilizza nucleotidi marcati in fluorescenza e analisi elettroforetiche per accertare le sequenze di DNA, facilitando l'identificazione delle variazioni genetiche di Mp. Il sequenziamento con metodo Sanger, pur essendo in grado di identificare simultaneamente più mutazioni e quantificare i rapporti tra ceppi resistenti e sensibili, richiede molto lavoro e tempo, limitando così la sua utilità clinica33,34. Al contrario, il pirosequenziamento fornisce una valutazione più accurata delle variazioni della sequenza del DNA identificando il rilascio di pirofosfato durante l'incorporazione dei nucleotidi. Questo metodo è in grado di identificare i ceppi MRMPI e quantificare i rapporti tra ceppi resistenti e suscettibili nei campioni clinici con maggiore precisione rispetto al sequenziamento Sanger. Inoltre, il pirosequenziamento consente il monitoraggio longitudinale dei singoli pazienti, consentendo una valutazione in tempo reale dello sviluppo della resistenza e informando le modifiche al trattamento33. Tuttavia, la sua applicazione clinica è limitata dalla necessità di apparecchiature specializzate, personale competente e tempi di lavorazione prolungati.

Sulla base dell'analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) del gene P1, Mp è classificato in due tipi: tipo I (ulteriormente suddiviso in cinque sottotipi: 1a-1e) e tipo II (ulteriormente suddiviso in tre sottotipi: 2a-2c). Questo test è in grado di rilevare 8 sottotipi genici di Mycoplasma pneumoniae35. Questo metodo facilita l'identificazione qualitativa delle mutazioni di Mycoplasma pneumoniae e di resistenza ai macrolidi (siti di mutazione 23S rRNA 2063 (A:G) e 2064 (A:G)) in campioni di espettorato pediatrico, fornendo uno strumento diagnostico supplementare rapido e diretto per le infezioni da Mycoplasma e la sorveglianza della resistenza agli antibiotici.

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Protocollo

Tutti i protocolli di studio sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Medico dell'Heyuan People's Hospital (Approvazione n. YXYJLL-LW2025001). Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima della partecipazione.

1. Raccolta dei campioni

NOTA: Prestare attenzione nel mantenere la tecnica asettica durante la raccolta del campione.

  1. Raccogliere campioni di espettorato del paziente o del sospetto paziente. Ottenere campioni entro 3 giorni dall'insorgenza della malattia del paziente.
  2. Istruire il paziente a sciacquare la bocca con acqua, respirare profondamente, trattenere il respiro per 5 secondi ed espirare gradualmente.
  3. Chiedi al paziente di espirare profondamente ancora una volta, tenta di espellere l'espettorato, depositalo in un bicchiere di plastica designato e chiudi il coperchio. L'espettorato deve essere prontamente consegnato al laboratorio clinico a temperatura ambiente (RT). Conservare i campioni a 2-8 °C in frigorifero.

2. Preparazione dei reagenti di amplificazione

  1. Nell'area di preparazione dei reagenti del laboratorio PCR, scongelare il tampone, la sonda di primer e l'acqua dal kit a 4 °C dopo averli recuperati dal congelatore a -20 °C. Rimuovere l'enzima, mescolarlo delicatamente agitando e centrifugare a 1,006 x g per 10 s.
  2. Recuperare una provetta da centrifuga sterile priva di nucleasi, etichettarla e preparare il sistema di reazione per ogni individuo come descritto nella Tabella 1. Il numero totale di reazioni PCR deve essere uguale alla somma dei campioni, un controllo di qualità debole positivo, un prodotto di controllo qualità W e un controllo di estrazione negativo.
  3. Determinare la quantità di ciascun reagente, incorporarlo in una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate, mescolare accuratamente e centrifugare brevemente a bassa velocità. Erogare 20 μl di reagente in ciascuna provetta di reazione PCR e riposizionarla nell'area di elaborazione del campione.

3. Trattamento del campione

  1. Trattare 1 mL di campioni di espettorato con 2 mL di tampone per la digestione dell'espettorato, miscelare accuratamente a vortice e incubare per 30 minuti fino a raggiungere la completa liquefazione.
  2. In base alla quantità di campione, aggiungere in sequenza 5 μl dello standard interno alla 1ae alla 7a colonna della piastra di estrazione dell'acido nucleico, quindi l'aggiunta di 200 μl di campioni liquefatti, soluzione fisiologica normale e controllo di qualità positivo debole MM in successione.
  3. Recupera una piastra di estrazione dell'acido nucleico utilizzando uno strumento automatizzato per l'estrazione dell'acido nucleico. Aggiungere gli acidi nucleici estratti dopo aver eseguito i saggi a valle nelle colonne 6 e 12 della piastra di estrazione.
  4. Aggiunta del campione: Nell'area di preparazione del campione del laboratorio PCR, aggiungere l'acido nucleico estratto nella 6ae 12acolonna della piastra di estrazione. Successivamente, trasferire 5,0 μl dell'acido nucleico del campione preparato nella provetta di reazione PCR, che contiene la miscela di reazione PCR (inclusi campione, controlli di qualità positivi forti e deboli, controllo di qualità W e controllo negativo di estrazione).
  5. Fissare il liquido della provetta di reazione PCR ed eseguire la centrifugazione immediata per confermare che il liquido sia adeguatamente sigillato e privo di bolle.

4. Amplificazione

  1. Inserire la provetta di reazione nel rivelatore PCR a fluorescenza e configurare i parametri del ciclo come segue nella Tabella 2.
  2. Acquisizione di segnali di fluorescenza in FAM (mutazione A:G 2063 o 2064), VIC (Mycoplasma pneumoniae) e CY5 (standard interno), con raccolta dati impostata a 64 °C.

5. Analisi dei dati

NOTA: Questo studio ha impiegato la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), con risultati rappresentativi che indicano mutazioni associate alla resistenza A:G nelle posizioni 2063 o 2064 di Mycoplasma pneumoniae. I pazienti positivi al test devono evitare gli antibiotici macrolidi nel trattamento clinico.

  1. Dopo la reazione, lo strumento analizza e archivia autonomamente i risultati. Verificare che i geni bersaglio per il controllo negativo mostrino fluorescenza FAM Ct ≥ 35.33 e fluorescenza VIC Ct ≥ 35.01, mentre i geni bersaglio per il controllo di qualità W dimostrano fluorescenza FAM Ct ≥ 35.33 e fluorescenza VIC Ct ≥ 35.01. I valori Ct per la fluorescenza FAM e VIC nei prodotti di controllo qualità debolmente positivi variavano da 29,00 a 34,00.
  2. Generalmente, il valore Ct della norma interna è ≤ 35,00. Se si osserva una curva di amplificazione S caratteristica ma lo standard interno non viene amplificato a causa dell'elevata concentrazione del gene bersaglio, riportarlo direttamente come campione positivo o rivalutare il campione attraverso una diluizione a gradiente di 10 volte.
  3. Classificare come negativo il campione che presenta UNDECT o l'assenza di una tipica curva di amplificazione di tipo S.
  4. Considerare i campioni negativi quando la fluorescenza FAM (mutazione A:G 2063 o 2064) ≥ 35,33, la fluorescenza VIC (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35,01 o quando non esiste una curva di amplificazione tipica di tipo S. Ritiene che i campioni siano positivi quando il loro valore Ct soddisfa la Tabella 3 e presentano una curva di amplificazione di tipo S caratteristica.
    NOTA: I risultati del rilevamento del campione dipendono dalla qualità della raccolta, dell'elaborazione, del trasporto e della conservazione del campione; Eventuali errori possono causare risultati falsi negativi. Il mancato controllo della contaminazione incrociata durante l'elaborazione del campione può portare a risultati falsi positivi.

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Risultati

Dopo la liquefazione, l'estrazione dell'acido nucleico e l'amplificazione PCR a fluorescenza dei campioni di espettorato, il valore iniziale, il valore finale e il valore soglia del basale sono stati modificati dopo l'analisi della curva di amplificazione. Il valore iniziale era 3 e il valore finale era 20.

I risultati rappresentativi di questo esperimento sono stati positivi per l'acido nucleico Mp e una mutazione di resistenza...

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Discussione

La PCR e le sue tecniche derivate dimostrano una sensibilità e una specificità superiori rispetto ai metodi sierologici nell'identificazione, tipizzazione e rilevamento della resistenza ai farmaci nel Mycoplasma pneumoniae (MP). Inoltre, le tecniche basate sulla PCR offrono facilità d'uso e costi ridotti, rendendole una valida alternativa per la diagnostica clinica di routine36. L'Mp è un patogeno noto associato alla CAP e dimostra una notevole prevalenza...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

I reagenti sperimentali sono supportati dall'Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Doctors Station della provincia del Guangdong.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumento automatizzato per l'estrazione degli acidi nucleiciGuangzhou Da 'an Gene Co., Ltd.Intelligente 32
Punte per filtriCoring Life Science Co., Ltd.298220010-10µ L
Punte per filtriCoring Life Science Co., Ltd.030230011-50µ L
Punte per filtriCoring Life Science Co., Ltd.056230015-300µ L
MicroprovetteCoring Life Science Co., Ltd.141249341,5 ml
Mycoplasma pneumoniae kit per il rilevamento del sito di mutazione dell'acido nucleico e della resistenza ai farmaci (metodo PCR a fluorescenza)Jiangsu Mole Biotechnology Co., Ltd.20241111
Reagente per l'estrazione di acidi nucleari (metodo delle biglie magnetiche)Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.G24004
Provette per PCRDN Biotech (Hong Kong)  Co., Ltd.61210030,2 ml
Strumento PCR fluorescente in tempo realeBIO-RADPannello CFX96

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