L'obiettivo di questo protocollo è quantificare la produzione di violaceina da parte del Chromobacterium violaceum ATCC 12472 come proxy per valutare l'inibizione del quorum sensing da parte di composti bioattivi.
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Articolo metodologico
Quantificazione della violaceina nel Chromobacterium violaceum e sua inibizione da parte di composti bioattivi
In questo articolo
Sommario
Abstract
I batteri comunicano attraverso un sistema noto come quorum sensing (QS), che consente loro di coordinare il loro comportamento in risposta ai cambiamenti nella densità cellulare. Questo processo comporta la produzione, la secrezione e il rilevamento di piccole molecole di segnalazione extracellulare, solitamente chiamate autoinduttori (AI). Il QS regola un'ampia gamma di geni e funzioni, tra cui la formazione e la dispersione del biofilm, la motilità dello sciame, la produzione di fattori di virulenza, la resistenza agli antibiotici e la bioluminescenza, tra le altre. L'inibizione del QS è diventata una promettente strategia antivirulenza contro i batteri resistenti agli antibiotici, in quanto esercita una pressione selettiva inferiore rispetto agli antibiotici tradizionali. Nel batterio Chromobacterium violaceum ATCC 12472, le proteine QS CviI/CviR, che sono omologhe alle proteine QS di tipo LuxI/LuxR di Aliivibrio fisheri, controllano molti geni, compresi quelli responsabili della produzione del pigmento viola violaceina. C. violaceum è stato ampiamente utilizzato come ceppo di biosensore negli studi di inibizione del QS, in particolare nell'inibizione della produzione di violaceina. Molti composti hanno il potenziale di inibire la QS legandosi alle proteine QS, omologhi LuxI o LuxR, interrompendo i circuiti QS. Questo protocollo descrive il metodo per quantificare la violaceina prodotta da C. violaceum ATCC 12472 e la sua inibizione da parte di composti bioattivi a concentrazioni che non influenzano la crescita batterica. Il test qui descritto dimostra una significativa riduzione della produzione di violaceina da parte dei composti testati. Questo studio evidenzia il potenziale dell'utilizzo di questo protocollo per selezionare candidati promettenti nella ricerca sull'inibizione del QS.
Introduzione
I batteri possono comunicare attraverso un sistema noto come QS, che consente la modulazione coordinata del loro comportamento in risposta ai cambiamenti nella densità cellulare. Questo processo comporta la produzione, la secrezione e la rilevazione di piccole molecole di segnalazione extracellulare, chiamate anche autoinduttori, che consentono la comunicazione sia tra specie diverse che all'interno della stessa specie 1,2.
Questa comunicazione è in grado di regolare geni e funzioni come la formazione e la dispersione del biofi....
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Protocollo
1. Preparazione della coltura (Figura 2)
- Coltivare in provetta una coltura da 5 mL di C. violaceum ATCC 12472 in brodo di Luria Bertani (LB: triptone 10 g/L, estratto di lievito 5 g/L, 5g/L NaCl) a 30 °C in un'incubatrice agitata (220 rpm) per 24 h.
- Regolare la coltura a un OD595 di 0,1 in brodo LB, corrispondente a circa 1 x 108 CFU/mL.
2. Preparazione del composto
- In una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, aggiungere il brodo LB e il composto bioattivo....
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Risultati
Per i risultati qui mostrati, sono stati utilizzati tre composti bioattivi precedentemente studiati dal nostro gruppo di ricerca8, resveratrolo, farnesolo e linalolo. Ogni composto è stato testato per la sua capacità di inibire la produzione di violaceina in C. violaceum ATCC 12472, un fenotipo regolato dal sistema QS sull'operone23 di vioABCDE.
I risultati convalidano l'efficacia del nostro protocollo nel quantificare la produz.......
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Discussione
Il primo metodo per estrarre e caratterizzare la violaceina da C. violaceum è emerso negli anni '90, concentrandosi sull'identificazione di fonti di carbonio adatte per la sintesi dei pigmenti. In questo processo, la violaceina, insieme alle cellule e al terreno di coltura, è stata essiccata, risospesa in etanolo e quindi separata mediante estrazione con surnatante. La violaceina, ora disciolta in etanolo, fu successivamente essiccata di nuovo, producendo una forma pura e secca .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Consiglio Nazionale per lo Sviluppo Scientifico (CNPQ) attraverso le sovvenzioni #403661/2023-4 e #444794/2024-7 e la borsa di studio #306685/2022-1, e la Fondazione per la Ricerca di San Paolo (FAPESP) per le sovvenzioni #2024/05158-6 e 2023/17090-4 e il sostegno finanziario al Centro di Ricerca Alimentare (FoRC) #2013/07914-8.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMSO | Synth | ||
| Farnesolo | Sigma-Aldrich | F203 | 95% |
| Linalolo | Sigma-Aldrich | L2602 | 97% |
| Luria-Bertani Medio | Difco | 244620 | |
| Pellicola adesiva ottica | Thermo Fisher | 4311971 | MicroAmp |
| Resveratrolo | Sigma-Aldrich | R5010 | ≥ 99% (HPLC) |
| Lettore multimodale Synergy HTX | Biotek | ||
| Piastre per coltura tissutale 96 pozzetti | Kasvi | K12-096 |
Riferimenti
- Mukherjee, S., Bassler, B. L. Bacterial quorum sensing in complex and dynamically changing environments. Nat Rev Microbiol. 17 (6), 371(2019).
- Lima, E. M. F., Winans, S. C., Pinto, U. M. Quorum sensing interference by phenolic compounds - A matter of bac....
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Ristampe e permessi
