Articolo metodologico

Quantificazione della violaceina nel Chromobacterium violaceum e sua inibizione da parte di composti bioattivi

DOI:

10.3791/68507

⸱

8 agosto 2025

 ,  ,  , 
1Food Research Center, Department of Food and Experimental Nutrition, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo (USP)

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questo protocollo è quantificare la produzione di violaceina da parte del Chromobacterium violaceum ATCC 12472 come proxy per valutare l'inibizione del quorum sensing da parte di composti bioattivi.

Abstract

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I batteri comunicano attraverso un sistema noto come quorum sensing (QS), che consente loro di coordinare il loro comportamento in risposta ai cambiamenti nella densità cellulare. Questo processo comporta la produzione, la secrezione e il rilevamento di piccole molecole di segnalazione extracellulare, solitamente chiamate autoinduttori (AI). Il QS regola un'ampia gamma di geni e funzioni, tra cui la formazione e la dispersione del biofilm, la motilità dello sciame, la produzione di fattori di virulenza, la resistenza agli antibiotici e la bioluminescenza, tra le altre. L'inibizione del QS è diventata una promettente strategia antivirulenza contro i batteri resistenti agli antibiotici, in quanto esercita una pressione selettiva inferiore rispetto agli antibiotici tradizionali. Nel batterio Chromobacterium violaceum ATCC 12472, le proteine QS CviI/CviR, che sono omologhe alle proteine QS di tipo LuxI/LuxR di Aliivibrio fisheri, controllano molti geni, compresi quelli responsabili della produzione del pigmento viola violaceina. C. violaceum è stato ampiamente utilizzato come ceppo di biosensore negli studi di inibizione del QS, in particolare nell'inibizione della produzione di violaceina. Molti composti hanno il potenziale di inibire la QS legandosi alle proteine QS, omologhi LuxI o LuxR, interrompendo i circuiti QS. Questo protocollo descrive il metodo per quantificare la violaceina prodotta da C. violaceum ATCC 12472 e la sua inibizione da parte di composti bioattivi a concentrazioni che non influenzano la crescita batterica. Il test qui descritto dimostra una significativa riduzione della produzione di violaceina da parte dei composti testati. Questo studio evidenzia il potenziale dell'utilizzo di questo protocollo per selezionare candidati promettenti nella ricerca sull'inibizione del QS.

Introduzione

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I batteri possono comunicare attraverso un sistema noto come QS, che consente la modulazione coordinata del loro comportamento in risposta ai cambiamenti nella densità cellulare. Questo processo comporta la produzione, la secrezione e la rilevazione di piccole molecole di segnalazione extracellulare, chiamate anche autoinduttori, che consentono la comunicazione sia tra specie diverse che all'interno della stessa specie 1,2.

Questa comunicazione è in grado di regolare geni e funzioni come la formazione e la dispersione del biofilm, la motilità e l'adesione, la proliferazione cellulare, la sintesi di esoenzimi e siderofori, la sporulazione, la resistenza agli acidi, il trasferimento genico orizzontale, la resistenza agli antibiotici, la bioluminescenza, la produzione di esopolisaccaridi, tra gli altri 3,4,5. Data la rilevanza dei fenotipi regolati dal QS, c'è un grande interesse nello sviluppo di sistemi in grado di interferire con questa comunicazione cellulare. L'inibizione della segnalazione QS è anche chiamata quorum quenching (QQ)6. La QQ può verificarsi in diversi modi, inclusi inibitori della sintesi di autoinduttori, inattivazione enzimatica di questi segnali e molecole con un effetto antagonista su queste molecole 4,7.

La crescente minaccia della resistenza agli antibiotici ha spinto la ricerca di terapie alternative, tra cui gli inibitori del quorum sensing (QSI), che interrompono la comunicazione batterica senza uccidere direttamente gli agenti patogeni. Questi composti possono mostrare effetti sinergici se combinati con antibiotici, migliorando la suscettibilità batterica e consentendo dosi ridotte di antibiotici, che è una strategia chiave per rallentare lo sviluppo della resistenza. Ad esempio, il resveratrolo e la kanamicina insieme ritardano la crescita di Aeromonas hydrophila 8, mentre la N-acetilcisteina sinergizza con la tobramicina per interrompere i biofilm di Pseudomonas aeruginosa 5.

Con l'uso eccessivo di antibiotici e lo sviluppo stagnante di farmaci, gli approcci antivirulenza come l'inibizione del QS offrono un cambiamento di paradigma9. Invece di mirare alla vitalità, prendono di mira i fattori di virulenza, rendendo i batteri meno dannosi e più vulnerabili all'immunità dell'ospite o agli antibiotici5. Questa strategia impone una pressione selettiva più debole rispetto agli antibiotici tradizionali, riducendo al minimo la resistenza e preservando il microbiota benefico10,11. Nonostante i promettenti risultati di laboratorio, la convalida nel mondo reale attraverso gli studi clinici rimane poco esplorata12. L'inibizione del QS rappresenta un promettente complemento agli antibiotici, ma la sua traduzione in pratica richiede ulteriori prove di efficacia e sicurezza in ambienti biologici complessi.

C. violaceum è un beta proteobatterio che forma colonie viola con una superficie liscia e lucida. Sono bacilli anaerobi facoltativi e non formano spore13. Il meccanismo del QS in C. violaceum coinvolge un ciclo di feedback positivo basato sul sistema genico analogo al modello lux di Aliivibrio fisheri, che contiene le proteine CviI (omologhe a LuxI) e CviR (omologhe a LuxR; Figura 1). La violaceina mostra attività biocida contro vari organismi, tra cui funghi, batteri, nematodi e virus, in particolare durante la fase di crescita stazionaria microbica, quando la densità di popolazione è estremamente elevata e i nutrienti sono quasi esauriti. Di conseguenza, la produzione di violaceina può essere considerata una strategia competitiva per prolungare la sopravvivenza della colonia microbica14.

Le piante producono composti originati dal metabolismo secondario, che svolgono un ruolo cruciale nell'aumentare la loro capacità di adattarsi ad ambienti sfavorevoli. Questi metaboliti, come alcaloidi, fenoli, flavonoidi, chinoni, tannini, terpeni e lectine, sono ampiamente riconosciuti come meccanismi di difesa contro erbivori e microrganismi15. Il potenziale dei composti di origine vegetale come QSI ha attirato particolare attenzione a causa delle interazioni dinamiche tra piante e microrganismi. Studi sulle interazioni pianta-patogeno nella rizosfera hanno dimostrato che le piante possono rispondere agli autoinduttori batterici secernendo composti bioattivi in grado di agire come inibitori contro i patogeni16.

In questo studio, descriviamo un metodo pratico volto a quantificare la produzione di violaceina da parte di C. violaceum, concentrandosi sulla sua inibizione da parte di composti bioattivi. Questo metodo funge da strumento di screening iniziale per la selezione di composti con potenziali attività QSI. Fornisce un approccio rapido e pratico per il futuro sviluppo terapeutico contro i batteri patogeni Gram-negativi. Questo protocollo standardizzato sarà utile perché fornisce una descrizione dettagliata che non è stata fatta in studi precedenti e faciliterà il confronto tra diversi studi in futuro 17,18,19.

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Protocollo

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1. Preparazione della coltura (Figura 2)

  1. Coltivare in provetta una coltura da 5 mL di C. violaceum ATCC 12472 in brodo di Luria Bertani (LB: triptone 10 g/L, estratto di lievito 5 g/L, 5g/L NaCl) a 30 °C in un'incubatrice agitata (220 rpm) per 24 h.
  2. Regolare la coltura a un OD595 di 0,1 in brodo LB, corrispondente a circa 1 x 108 CFU/mL.

2. Preparazione del composto

  1. In una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, aggiungere il brodo LB e il composto bioattivo secondo un calcolo di diluizione seriale, seguendo la descrizione seguente. A seconda della loro solubilità, i composti bioattivi sono tipicamente diluiti in DMSO puro o in una soluzione di DMSO: acqua (1:1).
    NOTA: Nelle metodologie che valutano il QSI, è fondamentale assicurarsi che le concentrazioni utilizzate siano inferiori alla concentrazione inibitoria minima (sub-MIC), il che significa che non influenzano la crescita batterica. Pertanto, si consiglia di eseguire saggi della curva di crescita a diverse concentrazioni per confermare che il composto inibisce specificamente la comunicazione cellula-cellula piuttosto che la vitalità microbica. Si prega di consultare la Figura 1 supplementare per i saggi della curva di crescita dei composti bioattivi testati utilizzati in questo protocollo.
  2. Per calcolare la concentrazione del composto bioattivo nel pozzetto, considerando una soluzione madre di farnesolo e linalolo a 20 mg/mL e una concentrazione target di 200 μg/mL nel pozzetto, nonché resveratrolo a 2,5 mg/mL nella soluzione madre e 25 μg/mL nel pozzetto, eseguire il calcolo come segue:
    C1V1 = C2V2
    20.000 μg/mL x V1 = 200 μg/mL x 200 μL
    V1 = 40.000/20.000 μl
    V1 = 2 μL
    dove C1 = concentrazione della soluzione madre (20 mg/mL, che equivale a 20.000 μg/mL); V1 = volume di soluzione madre da aggiungere; C2 = concentrazione finale desiderata (200 μg/mL); V2 = volume finale nel pozzetto (200 μL).

3. Diluizione seriale20 e preparazione della piastra (Figura 3)

NOTA: La diluizione seriale viene utilizzata per valutare rapidamente una gamma di concentrazioni di un composto testato. In questo processo, il composto viene successivamente diluito in un rapporto costante, in questo caso 1:2. Ogni diluizione riduce la concentrazione del composto della metà rispetto alla concentrazione precedente, determinando un intervallo di concentrazioni decrescenti20.

  1. Nella prima colonna della diluizione seriale, aggiungere 196 μL di brodo LB (nel nostro esempio, colonne 3, 5 e 7). Sui pozzetti successivi della diluizione seriale, aggiungere 100 μL di brodo LB (nel nostro caso, colonne 4, 6 e 8).
  2. Quindi, aggiungere 2 volte la quantità di composto bioattivo calcolata nel passaggio precedente (2.2) per eseguire la diluizione seriale. Il calcolo ha portato a 2 μl di ciascun composto testato per raggiungere la concentrazione finale nel primo pozzetto, quindi aggiungere 4 μl del composto (colonne 3, 5 e 7).
  3. Trasferire metà del volume totale del pozzetto (100 μL) alla colonna successiva (nel nostro caso, le colonne 4, 6 e 8) e così via fino all'ultima concentrazione desiderata, se si esegue una diluizione seriale. Ricordarsi di mescolare accuratamente il contenuto prima del trasferimento.
    NOTA: In questa configurazione sperimentale, abbiamo utilizzato solo due concentrazioni per semplicità e tutti i composti si adattano a una sola piastra.
  4. Eseguire l'esperimento in almeno triplicato per concentrazione di ciascun composto. Si raccomandano anche tre repliche biologiche. Cambiare la punta e ripetere la procedura fino all'ultima concentrazione desiderata. Nell'ultima colonna (nel nostro caso, 4, 6 e 8), prelevare 100 μL da essa e scartarla.
  5. Aggiungere 80 μl di brodo LB a tutti i pozzetti, per un totale di 180 μl (file da B a D). Quindi, aggiungere 20 μl della coltura di C. violaceum standardizzata nella fase 1.2, garantendo un volume finale di 200 μl per pozzetto (file da B a D). Assicurarsi di cambiare i puntali delle pipette ogni volta che si cambiano i pozzetti per evitare il trascinamento di concentrazioni più elevate tra i pozzetti o la contaminazione.
  6. Se il composto è disciolto in qualsiasi tipo di solvente, assicurati di preparare il controllo con quel solvente. Abbiamo usato il DMSO. In questo caso, preparare un controllo del solvente, che sarà il controllo non trattato - UC (senza composto bioattivo; colonna 9). Aggiungere 2 μl di DMSO per pozzetto di controllo. Ciò fornisce una concentrazione massima dell'1% di DMSO nel test.
    NOTA: Il DMSO all'1% non influisce sulla crescita batterica21,22.
  7. Preparare il bianco, o il controllo del colore se si utilizzano composti pigmentati, senza batteri. Dopo aver aggiunto 80 μL di brodo LB a tutti i pozzetti, per un totale di 180 μL (file da B a D, come descritto in precedenza), aggiungere 20 μL di brodo LB ai corrispondenti pozzetti bianchi, per un totale di 200 μL (file da E a G). Questo viene fatto perché c'è una certa colorazione di fondo dal cristallovioletto che deve essere sottratta dalle letture OD, come verrà descritto nel passaggio 5 di questo protocollo.
  8. Se una colonna rimane vuota, riempirla con 200 μl di brodo LB o acqua distillata sterile (colonne 1, 2, 10, 11 e 12). Questo passaggio è importante per evitare un'eccessiva essiccazione del fluido nell'incubatrice.

4. Incubazione ed estrazione della violaceina

  1. Coprire la piastra con un coperchio o una pellicola sigillante (come specificato nella Tabella dei Materiali) per evitare l'evaporazione, a seconda dello spettrofotometro utilizzato.
  2. Incubare la piastra a 30 °C agitando a 130 giri/min per 24 ore. Quindi, rimuovere la piastra dall'incubatrice, metterla in un'incubatrice essiccante a 60 °C, rimuovere il coperchio e lasciare asciugare completamente la piastra (circa 8 ore).
  3. Dopo che la piastra si è asciugata, rimuoverla dall'incubatore e aggiungere 200 μL di DMSO puro a ciascun pozzetto, quindi coprirla. Porre la piastra in un'incubatrice a 25°C agitando a 130 giri/min per 30 minuti per sciogliere il pigmento di violaceina.
  4. Trascorso questo tempo, rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferire 100 μL in un'altra micropiastra, evitando il contatto tra il puntale e le pareti del pozzetto.

5. Quantificazione della produzione di violaceina

  1. Quantificare la quantità di produzione di violaceina misurando l'assorbanza a 595 nm utilizzando un appropriato spettrofotometro a piastra (Tabella dei materiali). L'inibizione del pigmento violaceina è proporzionale a letture di assorbanza inferiori.
  2. Quantificare la produzione di violaceina utilizzando un controllo negativo (controllo non trattato) come riferimento per la produzione del 100% di violaceina (Tabella 1). Innanzitutto, sottrarre il valore di assorbanza del bianco da ciascuna replica di trattamento per ottenere l'assorbanza corrispondente esclusivamente al pigmento violaceina (escludendo l'interferenza del brodo o del colore del composto). Quindi, calcola la percentuale di produzione di violaceina per ogni trattamento, utilizzando la seguente equazione.
    %produzione di violaceina = (OD del composto bioattivo / OD del controllo non trattato) x 100
  3. Calcola le analisi statistiche in tre repliche. I risultati possono essere inviati ad ANOVA, seguiti dal test di Tukey utilizzando il software GraphPad Prism 8.0. Il valore di p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

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Per i risultati qui mostrati, sono stati utilizzati tre composti bioattivi precedentemente studiati dal nostro gruppo di ricerca8, resveratrolo, farnesolo e linalolo. Ogni composto è stato testato per la sua capacità di inibire la produzione di violaceina in C. violaceum ATCC 12472, un fenotipo regolato dal sistema QS sull'operone23 di vioABCDE.

I risultati convalidano l'efficacia del nostro protocollo nel quantificare la produz...

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Discussione

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Il primo metodo per estrarre e caratterizzare la violaceina da C. violaceum è emerso negli anni '90, concentrandosi sull'identificazione di fonti di carbonio adatte per la sintesi dei pigmenti. In questo processo, la violaceina, insieme alle cellule e al terreno di coltura, è stata essiccata, risospesa in etanolo e quindi separata mediante estrazione con surnatante. La violaceina, ora disciolta in etanolo, fu successivamente essiccata di nuovo, producendo una forma pura e secca ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Consiglio Nazionale per lo Sviluppo Scientifico (CNPQ) attraverso le sovvenzioni #403661/2023-4 e #444794/2024-7 e la borsa di studio #306685/2022-1, e la Fondazione per la Ricerca di San Paolo (FAPESP) per le sovvenzioni #2024/05158-6 e 2023/17090-4 e il sostegno finanziario al Centro di Ricerca Alimentare (FoRC) #2013/07914-8.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMSO Synth
FarnesoloSigma-AldrichF20395%
LinaloloSigma-AldrichL260297%
Luria-Bertani MedioDifco244620
Pellicola adesiva otticaThermo Fisher4311971MicroAmp
ResveratroloSigma-AldrichR5010≥ 99% (HPLC)
Lettore multimodale Synergy HTXBiotek
Piastre per coltura tissutale 96 pozzettiKasviK12-096

Riferimenti

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