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Articolo di ricerca

Attenuazione della feroptosi neuronale mediante inibizione di RKIP a seguito di emorragia intracerebrale spontanea tramite attivazione della via NRF2/HO-1

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DOI:

10.3791/68511

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31 ottobre 2025

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1Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital 2 of Nantong University

In questo articolo

Sommario

Conducendo studi basati sia sull'organismo che su colture cellulari, è stato dimostrato che l'inibizione della proteina inibitrice della chinasi Raf (RKIP) può mitigare la ferroptosi neuronale a seguito di emorragia intracerebrale spontanea, riducendo così il danno cerebrale. La citoprotezione osservata deriva dalla modulazione dell'asse di segnalazione NRF2/HO-1 .

Abstract

La proteina inibitrice della chinasi Raf (RKIP), un membro primario della famiglia delle proteine leganti la fosfatidiletanolammina, è nota per il suo coinvolgimento in vari processi fisiologici, tra cui la differenziazione cellulare, la migrazione, il ciclo cellulare e l'apoptosi. Questo studio ha esplorato la sua funzione nella ferroptosi neuronale a seguito di emorragia intracerebrale spontanea (ICH) e i meccanismi associati. Un modello cellulare di ICH spontaneo è stato sviluppato utilizzando cellule di feocromocitoma di ratto (PC12) in coltura stimolate con emina. Sono stati valutati la vitalità cellulare, l'espressione dell'RNA, i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'idroperossido lipidico (LPO). Inoltre, sono stati misurati i livelli di espressione proteica. Questo studio ha confermato che l'inibizione di RKIP è neuroprotettiva in vitro dopo ICH. Questo effetto è stato associato ad un aumento dell'espressione della glutatione perossidasi 4 (GPX4) e alla diminuzione dell'espressione dell'acil-CoA sintetasi a catena lunga della famiglia 4 (ACSL4), insieme ai livelli di ROS e LPO nei neuroni. L'inibizione di RKIP ha dimostrato un ruolo protettivo contro la ferroptosi neuronale in vitro dopo ICH, potenzialmente attraverso l'attivazione della via del fattore nucleare E2-correlato al fattore 2/eme ossigenasi-1 (NRF2/HO-1). Questo meccanismo può offrire informazioni sulle strategie terapeutiche mirate alla ferroptosi neuronale nell'ICH.

Introduzione

L'emorragia intracerebrale spontanea (ICH) è una condizione cerebrovascolare caratterizzata da sanguinamento dovuto a danno vascolare intracranico, necrosi e rottura dei vasi, che colpisce comunemente i gangli della base e rappresenta un importante sottotipo di ictus emorragico1. Il tasso di mortalità tra i pazienti con diagnosi di ICH è di circa il 50% e una percentuale significativa di sopravvissuti sperimenta una grave perdita di indipendenza2. Le attuali opzioni terapeutiche per l'ICH spontanea sono limitate, poiché nessuna terapia esistente ha dimostrato di ridurre significativamente la mortalità o di migliorare notevolmente gli esiti neurologici post-ICH.

La ferroptosi, una forma ferro-dipendente di morte cellulare programmata, è definita dalla perossidazione lipidica, dall'accumulo di ioni ferrosi e dalla deplezione del glutatione, distinguendola da altre forme di morte cellulare programmata in termini genetici, morfologici e biologici3. Sempre più evidenze evidenziano il ruolo della ferroptosi neuronale nella patologia dell'ICH. La proteina inibitrice della chinasi Raf (RKIP), nota anche come proteina legante la fosfatidiletanolammina 1 (PEBP1), è coinvolta nello sviluppo neurale e forma il complesso 15LOX/PEBP1 attraverso il suo legame con la 15-lipossigenasi (15LOX), un regolatore chiave della ferroptosi4. Tuttavia, il ruolo specifico e i meccanismi di RKIP nella ferroptosi legata alla progressione dell'ICH spontanea rimangono inesplorati.

Questo studio ha esaminato gli effetti anti-ferroptosi dell'inibizione di RKIP sui neuroni, dimostrando che l'inibizione dell'espressione di RKIP potrebbe sopprimere la ferroptosi neuronale dopo ICH, potenzialmente attraverso l'attivazione della via del fattore nucleare E2-correlato al fattore 2/eme ossigenasi-1 (NRF2/HO-1). Questi risultati sono significativi per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla patogenesi dell'ICH.

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Protocollo

Coltura di cellule PC12
La linea cellulare PC12 è stata propagata nel terreno di crescita del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina, con manutenzione ordinaria in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO2 atmosfera umidificata). Per le procedure sperimentali, le cellule aderenti sono state piastrate su recipienti di coltura e lasciate proliferare fino a raggiungere monostrati quasi confluenti (circa il 90% di copertura superficiale). La dissociazione cellulare è stata ottenuta attraverso un trattamento enzimatico con una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%, seguita da tre cicli successivi di subcoltura per garantire la stabilità della popolazione. Le cellule trattate sono state successivamente assegnate per applicazioni sperimentali a valle e valutazioni analitiche.

Saggi di vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata valutata per valutare la citotossicità dell'emina e della locostatina sulle cellule PC12, seguendo le istruzioni fornite dal produttore del kit di analisi. Le cellule PC12 sono state seminate uniformemente in piastre a 96 pozzetti e coltivate con emina o locostatina per 24 ore. Dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), le cellule sono state incubate in terreno RPMI-1640 contenente una soluzione salina di tetrazolio al 10% per 90 minuti a 37 °C. I valori di densità ottica (OD) sono stati quindi misurati a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

Reazione a catena quantitativa a trascrizione inversa della polimerasi (RT-qPCR)
L'RNA totale è stato estratto dalle cellule PC12 utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA. In primo luogo, il campione è stato omogeneizzato nel reagente di estrazione, garantendo una lisi completa. Alla miscela è stato aggiunto cloroformio, agitato energicamente e centrifugato per separare le fasi (12.000 × g, 15 min, 4 °C). La fase acquosa contenente l'RNA è stata raccolta e l'RNA è stato precipitato aggiungendo isopropanolo (fase acquosa: iPrOH = 1:1) e incubando a temperatura ambiente. La centrifugazione è stata eseguita per pellettare l'RNA (12.000 × g, 10 min, 4 °C), è stato aggiunto 1 mL di etanolo al 70% per rimuovere le impurità e, infine, il pellet di RNA è stato sciolto in acqua priva di RNasi per la conservazione a -80 °C. I modelli di DNA complementare (cDNA) sono stati generati mediante trascrizione inversa con l'RT Master Mix. I modelli risultanti sono stati quindi diluiti con un rapporto 1:5 e sottoposti a PCR quantitativa in tempo reale su uno strumento di PCR in tempo reale. Ogni campione è stato amplificato in triplice copia ed è stata calcolata la media della quantità relativa di prodotto della PCR. I primer utilizzati sono elencati nella Tabella 1, con la β-actina che funge da gene per la pulizia. La concentrazione relativa di mRNA è stata determinata utilizzando la formula E = 2−ΔΔCt e il valore del ciclo di soglia critica (CT) è stato registrato per ciascuna reazione.

Saggi intracellulari delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dell'idroperossido lipidico (LPO)
I livelli di ROS e LPO sono stati misurati utilizzando la citometria a flusso. Le cellule PC12 sono state trattate con emina (80 μM), locostatina (5 μM) e ML385 (5 μM) per 24 ore e lavate 3 volte con PBS in piatti. Le cellule sono state poi incubate a 37 °C con CO2 al 5% per 40 minuti in presenza di 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA), una sonda ROS, e BODIPY 581/591 C11, una sonda LPO. Dopo i lavaggi PBS per rimuovere le sonde in eccesso, l'intensità della fluorescenza è stata misurata mediante citometria a flusso. È stata applicata una strategia di gating coerente su tutti i campioni: in primo luogo, le celle sono state gated su FSC-A rispetto a SSC-A per escludere i detriti, quindi le singole cellule sono state selezionate tramite gating FSC-A rispetto a FSC-H. Le cellule non colorate e le cellule trattate con la sola emina sono state utilizzate come controlli negativi e positivi per stabilire la compensazione della fluorescenza e i gate. I dati sono stati analizzati utilizzando il software collegato.

Estrazione proteica e western blot
Estrazione totale delle proteine
Il surnatante delle cellule PC12 trattate è stato scartato, seguito da tre lavaggi con PBS ghiacciato. Le cellule sono state raccolte utilizzando la tripsina e centrifugate a 200 × g per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, il pellet cellulare è stato omogeneizzato in tampone di lisi RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) a freddo contenente il 10% di inibitore della proteasi e il 10% di inibitore della fosfatasi. Dopo un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, il lisato è stato centrifugato a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Il surnatante limpido è stato miscelato con il tampone di carico (4:1) e riscaldato a 95 °C per 5 minuti per denaturare le proteine. I campioni di proteine sono stati conservati a -80 °C per un uso successivo.

Analisi del western blot
Le proteine sono state separate mediante SDS-PAGE utilizzando un gel di impilamento e un gel risolutivo, con campioni caricati in pozzetti. L'elettroforesi è stata eseguita a 80 V per il gel di impilamento e a 120 V per il gel risolutivo. Le proteine sono state trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (pre-attivata in metanolo per 1 minuto) utilizzando un sistema di trasferimento a una corrente costante di 300 mA per 1-2 ore. La membrana è stata bloccata con latte scremato al 5% in TBST per 2 ore a temperatura ambiente per evitare legami aspecifici. Dopo tre lavaggi con TBST (10 minuti ciascuno), la membrana è stata incubata per una notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari diluiti in TBST: Coniglio anti-ACSL4 (1:1.000), Coniglio anti-GPX4 (1:1.000), Coniglio anti-HO-1 (1:2.000), Coniglio anti-NRF2 (1:1.000), Coniglio anti-RKIP (1:1.500) e Topo anti-β-actina (1:5.000). La membrana è stata lavata per 3 x 10 minuti con TBST e incubata con anticorpi secondari coniugati con HRP per 2 ore a temperatura ambiente: IgG anti-topo di capra marcate con HRP (1:1.000), IgG anti-coniglio marcate con HRP (1:1.000). Dopo ulteriori lavaggi TBST per 3 x 5 minuti, i segnali proteici sono stati visualizzati utilizzando un kit ECL Western Blot e quantificati utilizzando il software ImageJ.

Colorazione in immunofluorescenza
Le cellule sono state seminate su vetrini coprioggetti pre-posizionati in piastre di coltura e lasciati aderire. Dopo i trattamenti sperimentali, il surnatante è stato scartato e le cellule sono state lavate 3 volte con PBS. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% (PFA) per 15 minuti a temperatura ambiente, seguite da tre lavaggi PBS. Successivamente, le cellule sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavate 3 volte con PBS. Il legame aspecifico è stato bloccato mediante incubazione con albumina sierica bovina (BSA) al 3% per 30 minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati applicati durante la notte a 4 °C: Coniglio anti-HO-1 (1:500), Coniglio anti-NRF2 (1:500). Dopo tre lavaggi PBS il giorno successivo, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari fluorescenti al buio per 1 ora a temperatura ambiente: Alexa Fluor 488-marcato con Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Dopo i lavaggi finali, i campioni sono stati montati con un terreno di montaggio contenente 4',6-diamidino-2'-fenilindolo (DAPI) per la controcolorazione nucleare. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a scansione laser confocale.

Analisi statistica
I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard (S.D.). Per l'analisi sono stati prelevati dati quantitativi che rappresentano i risultati di tre saggi replicati indipendenti. Per i confronti tra due gruppi, è stato applicato un t-test, mentre un'analisi della varianza a una via (ANOVA) è stata utilizzata per i confronti tra più gruppi, seguita dal test post hoc di Tukey per i confronti multipli. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

L'emina può indurre danni alla membrana plasmatica, quindi viene spesso utilizzata per la costruzione di modelli cellulari in vitro di ICH. Questo studio ha indagato gli effetti del trattamento con emina a concentrazioni e durate variabili sulla vitalità cellulare PC12, analizzando contemporaneamente le dinamiche di espressione della proteina RKIP in condizioni sperimentali corrispondenti attraverso l'analisi western blot (Figura 1A). La vitalità cellulare era significativamente rid...

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Discussione

Questo studio ha studiato gli effetti e i meccanismi alla base del knockdown di RKIP sulla ferroptosi indotta da ICH in un contesto in vitro . La stimolazione delle cellule con l'emina innesca lo stress ossidativo, accompagnato da un'eccessiva generazione di ROS e LPO, promuovendo così la ferroptosi. L'inibizione dell'espressione endogena di RKIP accelera la traslocazione di NRF2 liberato nel nucleo e il legame con l'elemento di risposta antiossidante ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Nantong Municipal Health Commission Project (MS2022015) e del Nantong Science and Technology Bureau Project (JCZ2023022).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IgG anti-coniglio con etichetta Alexa Fluor 488Beyotime BiotechA0423
Anticorpo anti-ACSL4Segnalazione cellulare38493T
Anticorpo anti-GPX4Segnalazione cellulare59735S
Anticorpo anti-HO-1MedChemExpressHY-P80499
Anticorpo anti-NRF2Segnalazione cellulare12721T
Anticorpo anti-RKIPAbcamab76582
Anticorpo anti-β-actinAbcamab179467
BeyoECL PlusBeyotime BiotechP0018M
BSANCM BiotechWB6504-100g
Kit di conteggio delle celle-8Beyotime BiotechC0037
SALVATAGGIO CELLANCM BiotechC40050
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
DMSOBeyotime BiotechST038
Siero bovino fetaleGibcoA5670801
GraphPad Prism
HeminMedChemExpressHY-19424
HiScript Q RT SuperMix per qPCR (+tergicristallo gDNA)VazymeR123-01
IgG Anti-Topo con marcato HRPTermoC31430100
IgG Anti-Coniglio con Marchio HRPTermoC31460100
Kit per il contenuto di perossido lipidico (LPO)SolarbioBC5245
LocostatinaMedChemExpressHY-W013411A
ML385MedChemExpressHY-100523
Montaggio medio? antisvanimento (con DAPI)SolarbioS2110
LATE in polvere SENZA GRASSISolarbioD8340
PBS (polvere?pH7.2-7.4)SolarbioP1010
PC-12AdhBiotecnologia BioChannel di NanchinoBC-C-RA-005
Liquido penicillina-streptomicinaSolarbioP1400
PRMI-1640GibcoA1049101
Cocktail di proteasi e fosfatasi per uso generale, 50xBeyotime BiotechP1045
Marcatore proteicoTermo26617
PVDF MilliporeRIKB43638
Kit per il test delle specie reattive dell'ossigenoSolarbioCA1410
Buffer RIPA (alto)SolarbioR0010
Kit di preparazione rapida in gel SDS-PAGEEpizimaPG110
Buffer di caricamento campione SDS-PAGE, 5xBeyotime BiotechP0015
TritonX-100SolarbioIT9100
TRIZOLTermo15596018CN
Soluzione di tripsina-EDTA? 0,25% (senza fenolo rosso)SolarbioT1300

Riferimenti

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