Attenuazione della feroptosi neuronale mediante inibizione di RKIP a seguito di emorragia intracerebrale spontanea tramite attivazione della via NRF2/HO-1

L'emorragia intracerebrale spontanea (ICH) è una condizione cerebrovascolare caratterizzata da sanguinamento dovuto a danno vascolare intracranico, necrosi e rottura dei vasi, che colpisce comunemente i gangli della base e rappresenta un importante sottotipo di ictus emorragico¹. Il tasso di mortalità tra i pazienti con diagnosi di ICH è di circa il 50% e una percentuale significativa di sopravvissuti sperimenta una grave perdita di indipendenza². Le attuali opzioni terapeutiche per l'ICH spontanea sono limitate, poiché nessuna terapia esistente ha dimostrato di ridurre significativamente la mortalità o di migliorare notevolmente gli esiti neurologici post-ICH.

La ferroptosi, una forma ferro-dipendente di morte cellulare programmata, è definita dalla perossidazione lipidica, dall'accumulo di ioni ferrosi e dalla deplezione del glutatione, distinguendola da altre forme di morte cellulare programmata in termini genetici, morfologici e biologici³. Sempre più evidenze evidenziano il ruolo della ferroptosi neuronale nella patologia dell'ICH. La proteina inibitrice della chinasi Raf (RKIP), nota anche come proteina legante la fosfatidiletanolammina 1 (PEBP1), è coinvolta nello sviluppo neurale e forma il complesso 15LOX/PEBP1 attraverso il suo legame con la 15-lipossigenasi (15LOX), un regolatore chiave della ferroptosi⁴. Tuttavia, il ruolo specifico e i meccanismi di RKIP nella ferroptosi legata alla progressione dell'ICH spontanea rimangono inesplorati.

Questo studio ha esaminato gli effetti anti-ferroptosi dell'inibizione di RKIP sui neuroni, dimostrando che l'inibizione dell'espressione di RKIP potrebbe sopprimere la ferroptosi neuronale dopo ICH, potenzialmente attraverso l'attivazione della via del fattore nucleare E2-correlato al fattore 2/eme ossigenasi-1 (NRF2/HO-1). Questi risultati sono significativi per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla patogenesi dell'ICH.

Coltura di cellule PC12
La linea cellulare PC12 è stata propagata nel terreno di crescita del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina, con manutenzione ordinaria in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂ atmosfera umidificata). Per le procedure sperimentali, le cellule aderenti sono state piastrate su recipienti di coltura e lasciate proliferare fino a raggiungere monostrati quasi confluenti (circa il 90% di copertura superficiale). La dissociazione cellulare è stata ottenuta attraverso un trattamento enzimatico con una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%, seguita da tre cicli successivi di subcoltura per garantire la stabilità della popolazione. Le cellule trattate sono state successivamente assegnate per applicazioni sperimentali a valle e valutazioni analitiche.

Saggi di vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata valutata per valutare la citotossicità dell'emina e della locostatina sulle cellule PC12, seguendo le istruzioni fornite dal produttore del kit di analisi. Le cellule PC12 sono state seminate uniformemente in piastre a 96 pozzetti e coltivate con emina o locostatina per 24 ore. Dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), le cellule sono state incubate in terreno RPMI-1640 contenente una soluzione salina di tetrazolio al 10% per 90 minuti a 37 °C. I valori di densità ottica (OD) sono stati quindi misurati a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

Reazione a catena quantitativa a trascrizione inversa della polimerasi (RT-qPCR)
L'RNA totale è stato estratto dalle cellule PC12 utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA. In primo luogo, il campione è stato omogeneizzato nel reagente di estrazione, garantendo una lisi completa. Alla miscela è stato aggiunto cloroformio, agitato energicamente e centrifugato per separare le fasi (12.000 × g, 15 min, 4 °C). La fase acquosa contenente l'RNA è stata raccolta e l'RNA è stato precipitato aggiungendo isopropanolo (fase acquosa: iPrOH = 1:1) e incubando a temperatura ambiente. La centrifugazione è stata eseguita per pellettare l'RNA (12.000 × g, 10 min, 4 °C), è stato aggiunto 1 mL di etanolo al 70% per rimuovere le impurità e, infine, il pellet di RNA è stato sciolto in acqua priva di RNasi per la conservazione a -80 °C. I modelli di DNA complementare (cDNA) sono stati generati mediante trascrizione inversa con l'RT Master Mix. I modelli risultanti sono stati quindi diluiti con un rapporto 1:5 e sottoposti a PCR quantitativa in tempo reale su uno strumento di PCR in tempo reale. Ogni campione è stato amplificato in triplice copia ed è stata calcolata la media della quantità relativa di prodotto della PCR. I primer utilizzati sono elencati nella Tabella 1, con la β-actina che funge da gene per la pulizia. La concentrazione relativa di mRNA è stata determinata utilizzando la formula E = 2^−ΔΔCt e il valore del ciclo di soglia critica (CT) è stato registrato per ciascuna reazione.

Saggi intracellulari delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dell'idroperossido lipidico (LPO)
I livelli di ROS e LPO sono stati misurati utilizzando la citometria a flusso. Le cellule PC12 sono state trattate con emina (80 μM), locostatina (5 μM) e ML385 (5 μM) per 24 ore e lavate 3 volte con PBS in piatti. Le cellule sono state poi incubate a 37 °C con CO₂ al 5% per 40 minuti in presenza di 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA), una sonda ROS, e BODIPY 581/591 C11, una sonda LPO. Dopo i lavaggi PBS per rimuovere le sonde in eccesso, l'intensità della fluorescenza è stata misurata mediante citometria a flusso. È stata applicata una strategia di gating coerente su tutti i campioni: in primo luogo, le celle sono state gated su FSC-A rispetto a SSC-A per escludere i detriti, quindi le singole cellule sono state selezionate tramite gating FSC-A rispetto a FSC-H. Le cellule non colorate e le cellule trattate con la sola emina sono state utilizzate come controlli negativi e positivi per stabilire la compensazione della fluorescenza e i gate. I dati sono stati analizzati utilizzando il software collegato.

Estrazione proteica e western blot
Estrazione totale delle proteine
Il surnatante delle cellule PC12 trattate è stato scartato, seguito da tre lavaggi con PBS ghiacciato. Le cellule sono state raccolte utilizzando la tripsina e centrifugate a 200 × g per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, il pellet cellulare è stato omogeneizzato in tampone di lisi RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) a freddo contenente il 10% di inibitore della proteasi e il 10% di inibitore della fosfatasi. Dopo un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, il lisato è stato centrifugato a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Il surnatante limpido è stato miscelato con il tampone di carico (4:1) e riscaldato a 95 °C per 5 minuti per denaturare le proteine. I campioni di proteine sono stati conservati a -80 °C per un uso successivo.

Analisi del western blot
Le proteine sono state separate mediante SDS-PAGE utilizzando un gel di impilamento e un gel risolutivo, con campioni caricati in pozzetti. L'elettroforesi è stata eseguita a 80 V per il gel di impilamento e a 120 V per il gel risolutivo. Le proteine sono state trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (pre-attivata in metanolo per 1 minuto) utilizzando un sistema di trasferimento a una corrente costante di 300 mA per 1-2 ore. La membrana è stata bloccata con latte scremato al 5% in TBST per 2 ore a temperatura ambiente per evitare legami aspecifici. Dopo tre lavaggi con TBST (10 minuti ciascuno), la membrana è stata incubata per una notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari diluiti in TBST: Coniglio anti-ACSL4 (1:1.000), Coniglio anti-GPX4 (1:1.000), Coniglio anti-HO-1 (1:2.000), Coniglio anti-NRF2 (1:1.000), Coniglio anti-RKIP (1:1.500) e Topo anti-β-actina (1:5.000). La membrana è stata lavata per 3 x 10 minuti con TBST e incubata con anticorpi secondari coniugati con HRP per 2 ore a temperatura ambiente: IgG anti-topo di capra marcate con HRP (1:1.000), IgG anti-coniglio marcate con HRP (1:1.000). Dopo ulteriori lavaggi TBST per 3 x 5 minuti, i segnali proteici sono stati visualizzati utilizzando un kit ECL Western Blot e quantificati utilizzando il software ImageJ.

Colorazione in immunofluorescenza
Le cellule sono state seminate su vetrini coprioggetti pre-posizionati in piastre di coltura e lasciati aderire. Dopo i trattamenti sperimentali, il surnatante è stato scartato e le cellule sono state lavate 3 volte con PBS. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% (PFA) per 15 minuti a temperatura ambiente, seguite da tre lavaggi PBS. Successivamente, le cellule sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavate 3 volte con PBS. Il legame aspecifico è stato bloccato mediante incubazione con albumina sierica bovina (BSA) al 3% per 30 minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati applicati durante la notte a 4 °C: Coniglio anti-HO-1 (1:500), Coniglio anti-NRF2 (1:500). Dopo tre lavaggi PBS il giorno successivo, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari fluorescenti al buio per 1 ora a temperatura ambiente: Alexa Fluor 488-marcato con Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Dopo i lavaggi finali, i campioni sono stati montati con un terreno di montaggio contenente 4',6-diamidino-2'-fenilindolo (DAPI) per la controcolorazione nucleare. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a scansione laser confocale.

Analisi statistica
I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard (S.D.). Per l'analisi sono stati prelevati dati quantitativi che rappresentano i risultati di tre saggi replicati indipendenti. Per i confronti tra due gruppi, è stato applicato un t-test, mentre un'analisi della varianza a una via (ANOVA) è stata utilizzata per i confronti tra più gruppi, seguita dal test post hoc di Tukey per i confronti multipli. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

L'emina può indurre danni alla membrana plasmatica, quindi viene spesso utilizzata per la costruzione di modelli cellulari in vitro di ICH. Questo studio ha indagato gli effetti del trattamento con emina a concentrazioni e durate variabili sulla vitalità cellulare PC12, analizzando contemporaneamente le dinamiche di espressione della proteina RKIP in condizioni sperimentali corrispondenti attraverso l'analisi western blot (Figura 1A). La vitalità cellulare era significativamente ridotta a concentrazioni di emina di 60 μM o superiori (Figura 1B) e questa riduzione si è verificata in modo dose-dipendente con l'aumentare delle concentrazioni. Inoltre, la citotossicità dell'emina era dipendente dal tempo, con un picco entro le prime 24 ore di esposizione prima di diminuire gradualmente (Figura 1C). L'analisi del western blot ha indicato che l'espressione della proteina RKIP era significativamente elevata a 80 μM di emina (Figura 1D, E) e ha raggiunto il suo picco a 24 ore dopo la stimolazione (Figura 1F, G). Sulla base di questi risultati, abbiamo scelto 80 μM di emina e un periodo di trattamento di 24 ore per gli esperimenti successivi per chiarire i meccanismi sottostanti e le vie di segnalazione coinvolte.

Per studiare il ruolo di RKIP nella ferroptosi neuronale dopo ICH, abbiamo utilizzato la locostatina per inibire l'espressione di RKIP (Figura 2A). La locostatina si lega a RKIP, interrompe le interazioni tra RKIP e Raf-1 chinasi e GRK2, attenuando così gli effetti funzionali di RKIP per raggiungere lo scopo inibitorio. In questo studio, abbiamo impiegato la locostatina come inibitore di RKIP per studiare i meccanismi molecolari associati 5,6. La citotossicità della locostatina è stata valutata per la prima volta in un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 40 μM utilizzando il test di vitalità. I risultati non hanno mostrato citotossicità significativa a ≤5 μM, stabilendo un intervallo di concentrazione sicuro per gli esperimenti successivi (Figura 2B). Abbiamo inoltre confermato l'effetto inibitorio della locostatina 5 μM sull'espressione di RKIP utilizzando analisi di western blotting e RT-qPCR. Il western blot ha rivelato una diminuzione significativa dei livelli di proteina RKIP (Figura 2C, D), mentre la RT-qPCR ha mostrato una diminuzione dei livelli di mRNA di RKIP (Figura 2E). Questi risultati dimostrano l'efficacia della locostatina 5 μM nell'inibire l'espressione di RKIP.

In questo studio, è stato sviluppato un modello di cellule PC12 indotte da emina di emorragia intracerebrale (ICH) per delineare la funzione regolatoria di RKIP nella ferroptosi. I nostri risultati hanno indicato che la stimolazione dell'emina aumenta significativamente l'espressione di RKIP diminuendo la vitalità cellulare. Sulla base di studi esistenti, abbiamo ipotizzato che la morte cellulare indotta dall'emina potrebbe essere strettamente correlata alla ferroptosi, un processo di perossidazione lipidica catalizzato dal ferro caratterizzato da deposizione patologica di ferro all'interno dei compartimenti cellulari e livelli elevati di specie reattive dell'ossigeno (ROS).

Per esplorare ulteriormente la relazione tra RKIP e ferroptosi, abbiamo trattato le cellule PC12 stimolate dall'emina con locostatina. L'analisi del western blot ha rivelato che l'espressione dell'acil-CoA sintetasi a catena lunga della famiglia 4 (ACSL4), un fattore chiave della ferroptosi, era significativamente aumentata nel gruppo trattato con emina (Figura 3A, B). ACSL4 è un gene pro-morte critico nella ferroptosi, che promuove l'esterificazione degli acidi grassi polinsaturi (PUFA) e quindi aumenta la sensibilità cellulare alla ferroptosi. Inoltre, l'espressione della glutatione perossidasi 4 (GPX4), un inibitore della ferroptosi, è risultata significativamente ridotta nel gruppo trattato con emina (Figura 3A, C). GPX4 è un regolatore chiave della ferroptosi che inibisce la perossidazione lipidica eliminando i perossidi lipidici, proteggendo così le cellule dal danno ossidativo. Questi risultati indicano che la stimolazione dell'emina aumenta la ferroptosi nelle cellule PC12. Tuttavia, rispetto al gruppo emina, l'inibizione farmacologica di RKIP con locostatina ha invertito queste alterazioni, indicando che la soppressione dell'espressione di RKIP ha inibito la ferroptosi nelle cellule PC12. Risultati coerenti sono stati osservati anche a livello di mRNA (Figura 3 F,G).

Abbiamo anche studiato l'espressione di molecole di via correlate alla ferroptosi. È stato dimostrato che la via NRF2/HO-1 svolge un ruolo chiave nella ferroptosi. Sulla base di ciò, abbiamo ipotizzato che l'inibizione di RKIP possa sopprimere la ferroptosi neuronale attivando la via NRF2/HO-1. Per testare questa ipotesi, abbiamo prima stimolato le cellule PC12 con l'emina e abbiamo scoperto che l'espressione della proteina NRF2 era significativamente aumentata (Figura 3A, D), insieme a un aumento significativo del suo prodotto a valle HO-1 (Figura 3A, E). Questi risultati suggeriscono che la ferroptosi indotta dall'emina attiva la via NRF2/HO-1, che esercita un effetto protettivo sulle cellule. Come principale regolatore delle risposte antiossidanti cellulari, NRF2 migliora la capacità antiossidante cellulare regolando l'espressione di geni bersaglio a valle come HO-1, inibendo così la ferroptosi. Successivamente, il trattamento con Locostatina ha ulteriormente aumentato l'espressione di HO-1 e NRF2 rispetto al gruppo trattato con emina (Figura 3A, D). Risultati coerenti sono stati osservati anche a livello di mRNA (Figura 3I,J), confermando ulteriormente che l'inibizione di RKIP sopprime la ferroptosi nelle cellule PC12 stimolate dall'emina modulando NRF2 e la sua molecola a valle HO-1.

In particolare, un altro inibitore della ferroptosi, la ferritina a catena pesante 1 (FTH1), ha mostrato un aumento dell'espressione dopo la stimolazione dell'emina, e la sua espressione è stata ulteriormente elevata quando RKIP è stato inibito (Figura 3H). FTH1 è un componente importante della ferritina, responsabile dello stoccaggio e dell'ossidazione del ferro. Converte gli ioni di ferro in una forma più stabile, riducendo lo stress ossidativo indotto dal ferro libero. L'upregolazione di FTH1 in seguito alla stimolazione dell'emina può rappresentare una risposta compensatoria al sovraccarico di ferro, poiché le cellule tentano di immagazzinare il ferro in eccesso per evitare il danno ossidativo. L'ulteriore aumento dell'espressione di FTH1 in seguito al trattamento con locostatina suggerisce una riduzione dei livelli di ferro libero e una maggiore capacità antiossidante, rafforzando la conclusione che l'inibizione di RKIP sopprime la ferroptosi indotta dall'emina nelle cellule PC12.

I livelli di ROS e idroperossido lipidico (LPO) nelle cellule PC12 sono stati valutati mediante citometria a flusso. Il trattamento con emina ha portato ad un aumento significativo dei livelli di ROS e LPO, che è stato invertito dopo la somministrazione di Locostatina. Questa scoperta indica che l'inibizione di RKIP può aiutare a sopprimere la ferroptosi nei neuroni (Figura 4A-D).

In sintesi, la dose indotta dall'emina e le riduzioni tempo-dipendenti della vitalità cellulare PC12, in concomitanza con un marcato aumento dei livelli di proteina RKIP . Questo processo è stato associato a livelli elevati di ACSL4 e a una soppressione dell'espressione di GPX4. Contemporaneamente, è stato osservato un accumulo significativo di marcatori di danno ossidativo (ROS e LPO), entrambi i quali fungono da principali driver della ferroptosi mediando lo stress ossidativo e la rottura della membrana lipidica. Inoltre, l'upregolazione della proteina di accumulo del ferro FTH1 ha suggerito una risposta cellulare compensatoria al sovraccarico di ferro. In modo critico, l'inibizione farmacologica di RKIP da parte della locostatina ha invertito queste alterazioni e ha abrogato la ferroptosi indotta dall'emina (Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4).

I risultati dei test hanno indicato che l'inibizione di RKIP sopprime efficacemente la ferroptosi neuronale e regola l'espressione di NRF2/HO-1 . Dato che la via NRF2/HO-1 svolge un ruolo chiave nella ferroptosi, è stato ipotizzato che la soppressione della ferroptosi neuronale osservata con l'inibizione di RKIP possa essere mediata attraverso la stimolazione di questa via. Per verificare questa ipotesi, sono stati condotti ulteriori esperimenti (Figura 5A).

È stato utilizzato ML385, un inibitore selettivo di NRF2, e i risultati hanno confermato che l'espressione di NRF2 era efficacemente ridotta sia a livello di proteina (Figura 5B, C) che di mRNA (Figura 5E). Inoltre, è stata valutata l'espressione di HO-1, una molecola a valle di NRF2. I risultati hanno indicato che, mentre l'inibizione di RKIP inizialmente aumentava l'espressione di HO-1, questo effetto era invertito dopo l'inibizione di NRF2 (Figura 5B, D, F). Questi risultati suggeriscono che l'inibizione di RKIP può attenuare la ferroptosi neuronale attivando la via NRF2/HO-1. La colorazione in immunofluorescenza ha ulteriormente supportato questi risultati, poiché la traslocazione nucleare di NRF2 è stata osservata in seguito all'inibizione di RKIP (Figura 5G-J).

Successivamente, abbiamo ulteriormente valutato i livelli di ROS e LPO nelle cellule PC12 utilizzando la citometria a flusso. Abbiamo scoperto che l'inibizione di NRF2 con ML385 ha invertito la riduzione dei livelli di ROS e LPO indotta dalla locostatina. Questi risultati suggeriscono che la soppressione di RKIP può inibire la ferroptosi neuronale attivando la via NRF2/HO-1 (Figura 6A-D).

DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I set di dati generati durante il presente studio sono inclusi nel file supplementare 1.

Figura 1: Costruzione di un modello di malattia in vitro mediante cellule PC12 stimolate dall'emina. (A) Illustrazione schematica della costruzione del modello di cella PC12 stimolata dall'emina. (B) Determinazione della concentrazione ottimale di emina per l'istituzione di un modello di emorragia intracerebrale in vitro utilizzando il test di vitalità cellulare per valutare la vitalità cellulare. (C) Saggio di vitalità cellulare con cellule PC12 trattate con emina (80 μM) per vari punti temporali. (D,E) Analisi rappresentativa del western blot e valutazione quantitativa dei livelli di espressione di RKIP in cellule PC12 trattate con diverse concentrazioni di emina (24 ore). (F,G) Analisi rappresentativa del western blot e valutazione quantitativa dei livelli di espressione di RKIP in cellule PC12 esposte all'emina (80 μM) per durate variabili. Tutti i dati sono presentati come media ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abbreviazioni: CCK8 = Kit per il conteggio delle cellule-8; WB = macchia occidentale; RKIP = proteina inibitrice della chinasi Raf. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto della locostatina sull'espressione di RKIP nelle cellule PC12 stimolate con emina. (A) Illustrazione schematica della procedura sperimentale per il trattamento con Locostatina in cellule PC12. (B) La vitalità cellulare delle cellule PC12 trattate con diverse concentrazioni di Locostatina è stata valutata utilizzando il test di vitalità cellulare. (C, D) L'espressione di RKIP in cellule PC12 trattate con emina (80 μM,24 h) e/o locostatina (5 μM,24 h) è stata analizzata mediante western blot, con blot rappresentativi e analisi statistiche mostrate. (E) L'espressione dell'mRNA di RKIP nelle cellule PC12 trattate con emina (80 μM,24 h) e/o Locostatina (5 μM,24 h) è stata misurata mediante RT-qPCR. Tutti i dati sono presentati come media ± SD (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abbreviazioni: CCK8 = Kit per il conteggio delle cellule-8; WB = macchia occidentale; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa; ROS = specie reattive dell'ossigeno; LPO = perossidazione lipidica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto dell'inibizione di RKIP sulla ferroptosi nelle cellule PC12 in seguito a stimolazione con emina. (A-E) Analisi Western blot delle variazioni dell'espressione proteica in ACSL4, GPX4, NRF2 e HO-1 in cellule PC12 trattate con emina (80 μM,24 h) e/o Locostatina (5 μM,24 h). (F-J) Analisi RT-qPCR dei livelli di espressione dell'mRNA di ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 e FTH1 in cellule PC12 trattate con emina (80 μM,24 h) e/o Locostatina (5 μM,24 h). Tutti i dati sono presentati come media ± SD (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abbreviazioni: WB = western blot; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa; RKIP = proteina inibitrice della chinasi Raf; ACSL4 = Famiglia 4 dell'acil-CoA sintetasi a catena lunga; GPX4 = Glutatione perossidasi 4; NRF2 = fattore nucleare E2 correlato al fattore 2; HO-1 = eme ossigenasi-1; FTH1 = Catena pesante di ferritina 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto dell'inibizione di RKIP sullo stress ossidativo nelle cellule PC12 in seguito a stimolazione con emina. (A,C) Analisi in citometria a flusso della produzione di specie reattive dell'ossigeno in cellule PC12 trattate con emina (80 μM,24 h) e/o locostatina (5 μM,24 h). (B,D) Analisi in citometria a flusso della perossidazione lipidica in cellule PC12 trattate con emina (80 μM,24 h) e/o Locostatina (5 μM,24 h). Tutti i dati sono presentati come media ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abbreviazioni: ROS = Specie reattive dell'ossigeno; LPO = perossidazione lipidica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Il ruolo di NRF2 negli effetti antiferroptotici mediati dall'inibizione di RKIP. (A) Illustrazione schematica della procedura sperimentale per il trattamento delle cellule PC12 in diverse condizioni. (B-D) Analisi Western blot delle variazioni dell'espressione proteica in NRF2 e HO-1 in diverse condizioni di trattamento in cellule PC12 con emina (80 μM, 24 h) e/o Locostatina (5 μM, 24 h) e/o ML385 (5 μM, 24 h). (E,F) Analisi RT-qPCR dei livelli di espressione dell'mRNA di NRF2 e HO-1 in cellule PC12 trattate con emina (80 μM, 24 h) e/o Locostatina (5 μM, 24 h) e/o ML385 (5 μM, 24 h). (G-J) Analisi in immunofluorescenza dell'espressione di NRF2 e HO-1 e quantificazione dell'intensità media di fluorescenza in cellule PC12 trattate con emina (80 μM, 24 h) e/o Locostatina (5 μM, 24 h) e/o ML385 (5 μM, 24 h). Barre di scala= 50 μm. Tutti i dati sono presentati come media ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abbreviazioni: WB = western blot; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa; Colorazione IF = colorazione in immunofluorescenza; NRF2 = fattore nucleare E2 correlato al fattore 2; HO-1 = eme ossigenasi-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Il ruolo di NRF2 nella soppressione dello stress ossidativo mediato dall'inibizione di RKIP.(A,C) Analisi in citometria a flusso della produzione di specie reattive dell'ossigeno in cellule PC12 con emina (80 μM, 24 h) e/o Locostatina (5 μM, 24 h) e/o ML385 (5 μM, 24 h). (B,D) Analisi in citometria a flusso della perossidazione lipidica in cellule PC12 trattate con emina (80 μM, 24 h) e/o Locostatina (5 μM, 24 h) e/o ML385 (5 μM, 24 h). Tutti i dati sono presentati come media ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abbreviazioni: ROS = Specie reattive dell'ossigeno; LPO = perossidazione lipidica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Rappresentazione schematica dell'inibizione di RKIP che attenua la ferroptosi neuronale a seguito di ICH spontanea attivando la via NRF2/HO-1. I nostri risultati dimostrano che l'inibizione di RKIP promuove efficacemente la traslocazione nucleare di NRF2, sopprime l'accumulo di ROS lipidici e di conseguenza protegge dalla ferroptosi indotta dall'emina e dallo stress ossidativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Primer per la trascrizione inversa quantitativa-PCR.

File supplementare 1: dati quantitativi grezzi ed elaborati a supporto delle prime sei cifre, inclusi saggi CCK-8, Western blot, RT-qPCR e analisi di citometria a flusso. I dati sono organizzati per sottopannelli di figure e includono tutti i valori replicati utilizzati per le analisi statistiche. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.