Un microscopio Raman a trasformata di Fourier a campo ampio multimodale

Sommario

Un microscopio a trasformata di Fourier a campo ampio, basato su un interferometro birifrigento compatto e ultra-stabile, consente l'acquisizione parallela degli spettri per tutti i pixel di un rivelatore 2D. L'approccio nel dominio del tempo consente il disintreccio tra fotoluminescenza e segnali Raman, e consente una mappatura Raman rapida (~5 ms/pixel) con una risoluzione spaziale di ~1 μm e uno spettro di 23 ^cm-1 .

Abstract

La microscopia Raman è una tecnica potente per determinare la composizione chimica di un campione. La principale sfida dei microscopi Raman spontanei all'avanguardia, basati sul rilevamento del dominio della frequenza a scansione puntuale, è l'acquisizione di mappe Raman di vaste aree dovute ai tempi di permanenza tipicamente lunghi dei pixel (0,1-1 s). Il microscopio a trasformata di Fourier (FT) a campo ampio presentato qui permette la misurazione rapida di campioni estesi con risoluzione spaziale di ~1 μm e spettro di ~23 ^cm-1 . Si basa su un interferometro bireffringente a percorso comune ultra-stabile e compatto, aggiunto lungo il percorso di rilevamento di un microscopio commerciale, che consente l'acquisizione parallela degli spettri per tutti i pixel di un rivelatore 2D, riducendo significativamente il tempo di misurazione (10-100 volte più veloce). L'approccio nel dominio del tempo affronta efficacemente un'altra limitazione della tecnica del dominio della frequenza, ovvero il distogliere il segnale Raman dal fondo di fotoluminescenza, in cui il segnale Raman può essere sepolto. Questo protocollo descrive come eseguire misurazioni iperspettrali con un microscopio commerciale aggiornato: l'allineamento dello schema di illuminazione, i criteri per scegliere i parametri di misura e l'analisi dei dati per recuperare e indagare gli spettri.

Introduzione

L'imaging spettrale è una tecnica che fornisce sia informazioni spettrali che spaziali ed è stata applicata a vari campi, dalla^{microscopia 1} al^{telerilevamento 2}. L'imaging multispettrale e iperspettrale si distingue in base al fatto che vengano registrate poche bande spettrali discrete o uno spettro continuo per ogni pixel di un sensore 2D. L'imaging Raman è un'implementazione particolare dell'imaging spettrale.

La microscopia a scattering Raman è una tecnica potente per misurare le frequenze vibrazionali ν_R di un sistema. I modi vibrazionali sono associati ai legami chimici, e quindi la spettroscopia^{Raman 3} consente di indagare la composizione chimica dei campioni in^{biologia 4} e scienze dei^{materiali 5}. Nella spettroscopia Raman spontanea, il campione viene illuminato con radiazione monocromatica alla frequenza _ν0, chiamata pompa. Una frazione della luce della pompa, interagendo con i modi vibrazionali, può subire scattering inelastico, risultando in fotoni a frequenze ν_S (ν_AS)=ν₀-(+)_{ν R}, dove ν_R è la frequenza vibrazionale molecolare all'interno del campione. La luce diffusa a bassa energia (ν_S) è chiamata radiazione Stokes, mentre quella ad energia più alta (ν_AS) è la radiazione anti-Stokes. All'equilibrio termico, la maggior parte delle molecole occupa stati energetici più bassi, quindi i componenti anti-Stokes sono significativamente più deboli di quelli di Stokes. Per questo motivo, la microscopia a diffusione Raman individua tipicamente i fotoni Stokes. Poiché molecole e solidi hanno molteplici modalità vibrazionali, lo spettro Raman è caratterizzato da bande distinte che insieme formano una firma chimica unica, consentendo l'identificazione e l'analisi del materiale. La sfida principale di questo approccio è la sezione trasversale estremamente bassa della diffusione spontanea Raman, con solo uno su oltre 10 fotoni^{9-10 12} che subisce questo processo.

In una configurazione standard di un microscopio a scattering Raman, la luce di eccitazione è strettamente focalizzata su un punto del campione. Dopo aver rifiutato i fotoni a pompa diffusi elasticamente (tipicamente con filtri spettrali), la luce residua viene raccolta e caratterizzata con uno spettrometro a dominio della frequenza (ad esempio, griglia dispersiva); La risoluzione spettrale di questi dispositivi può raggiungere ~0,5-1 ^cm-1. La misurazione viene ripetuta per ogni punto (x,y) nel campo visivo (FOV) di un campione tramite un metodo chiamato scansione punto o raster⁶. Ci sono due problemi principali di questo approccio: (1) la bassa sezione d'urto della diffusione Raman spontanea richiede tipicamente lunghi tempi di integrazione (0,1-1 s) per raccogliere fotoni sufficienti per ogni pixel dello spettrometro, quindi la mappa Raman di un campione esteso può richiedere lunghi tempi di misurazione; (2) l'eccitazione della luce della pompa genera anche la fotoluminescenza (PL), che si sovrappone al segnale Raman spontaneo e spesso può sopraffarlo.

Per aumentare la velocità di acquisizione, è possibile adottare l'approccio a scansione^{lineare 7} , in cui la pompa è focalizzata lungo una linea del FOV (ad esempio alla coordinata x) e il segnale raccolto (scattering PL o Raman) viene disperso da uno spettrometro con un sensore 2D, produendo per la coordinata x data un dataset 2D in cui un asse corrisponde allo spettro e l'altro a una coordinata spaziale y. Tuttavia, questa implementazione soffre ancora delle significative perdite introdotte dalla fessura d'ingresso dello spettrometro, la cui larghezza ridotta offre una migliore risoluzione spettrale, ma limita anche la quantità di luce raccolta.

Una configurazione a campo ampio può essere più adeguata a ridurre il tempo di misurazione: con questo metodo, una grande area del campione viene illuminata e lo spettro viene acquisito simultaneamente per tutti i pixel di un sensore 2D. In questo caso, le informazioni spettrali possono essere raccolte utilizzando un insieme di filtri passabanda⁸ o un filtro spettrale^{regolabile 9} davanti a una fotocamera monocromatica. Inoltre, questo metodo si basa su un approccio nel dominio della frequenza e acquisisce solo un numero discreto di bande spettrali.

Un metodo alternativo per misurare uno spettro è l'approccio della trasformata di Fourier (FT). Si tratta di una tecnica nel dominio del tempo basata sul teorema¹⁰ di Wiener-Kintchin, che afferma che la densità spettrale di potenza di un segnale è la trasformata di Fourier della sua autocorrelazione temporale. In ottica, questo si ottiene in pratica generando due repliche ritardate della forma d'onda con un interferometro. La loro interferenza viene misurata da un rivelatore in funzione del ritardo relativo, dando origine al cosiddetto interferogramma¹¹. L'approccio FT è ampiamente utilizzato per misurare spettri nella regione spettrale infrarossa, dove è chiamato spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR⁾¹². La FTIR è usata di routine per misurare lo spettro di assorbimento delle transizioni vibrazionali nell'intervallo spettrale del medio infrarosso (~2,5−25 μm lunghezza d'onda).

L'approccio FT nel dominio temporale offre alcuni vantaggi rispetto agli spettrometri dispersivi convenzionali: raggiunge una maggiore capacità di trasmissione grazie all'assenza di fessure (vantaggio etendue di Jacquinot¹²); Fornisce una risoluzione spettrale flessibile, che dipende solo dalla portata di scansione. Inoltre, è particolarmente adatto a configurazioni a campo ampio: infatti, utilizzando un rivelatore 2D, il metodo misura un interferogramma per ogni pixel in parallelo, consentendo la registrazione simultanea di spettri continui su tutti i pixel. D'altra parte, un sistema di imaging FT deve soddisfare due requisiti impegnativi: (1) il ritardo relativo tra le due repliche di luce deve essere controllato a una piccola frazione del ciclo ottico; (2) lo sfasamento tra i raggi che interferiscono con un singolo pixel deve essere limitato per garantire una buona coerenza e quindi un alto contrasto. Alcune soluzioni sono state proposte basate su interferometri a percorso^{comune di 13, 14} o quasi¹⁵, ma sono piuttosto ingombranti o hanno una risoluzione spettrale superiore a 100 ^cm-1.

In questo lavoro viene descritto un nuovo microscopio a campo ampio, che consente l'acquisizione di immagini di fotoluminescenza e scattering Raman. Il blocco innovativo di questo sistema è un interferometro birifringente a percorso comune compatto e ultra-stabile, chiamato Translating-Wedge-based Identical Pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Fornisce scansioni a ritardo di centinaia di cicli ottici con una precisione di fase di una piccola frazione del ciclo ottico stesso e un'elevata stabilità. Le due repliche di luce hanno polarizzazioni ortogonali e viaggiano collinarmente lungo lo stesso percorso comune, quindi non sono influenzate dalle fluttuazioni della lunghezza del cammino, tipiche di un interferometro a doppio fascio. Lo schema, mostrato nell'innesto della Figura 1, consiste in due blocchi di cristalli birrifugenti con assi ottici ortogonali: uno (B₂) di lunghezza fissa e l'altro (B₁) diviso in due cunei che possono essere spostati lungo la direzione comune dell'ipotenusa. La luce incidente è polarizzata da P₁ a 45° rispetto all'asse ottico del cristallo birrifuggente, così che metà dell'energia si svolge lungo la polarizzazione ordinaria e metà lungo quella straordinaria. Durante il viaggio lungo i blocchi birrifringenti, le due componenti ortogonali accumulano un ritardo relativo che viene finemente regolato variando lo spessore complessivo del blocco B₁ modificando l'inserimento del cuneo. Il secondo polarizzatore P₂ proietta le componenti del campo a una polarizzazione lineare comune per farle interferire. Il ritardo τ tra repliche dipende dallo spostamento del cuneo x lungo l'ipotenusa comune come (Equazione 1) , con c velocità della luce, α angolo di apice dei cuni, Δn= n_{e-n o} differenza negli indici di rifrazione ordinario e straordinario (birifringenza). Poiché la risoluzione spettrale Δv è inversamente proporzionale all'intervallo di scansione T=|T_{2-T 1}|, con T₁, T₂ ritardo iniziale e finale dell'interferogramma, l'elevata risoluzione spettrale richiesta dalla spettroscopia Raman richiede un'elevata birifringenza e lunghe traslazioni a cuneo. Tra i cristalli birrifringenti più comuni, YVO₄ (ittrio ortovanadata) è particolarmente adatto per il suo alto Δn e il range di trasparenza nell'infrarosso visibile-vicino. I cunei sono progettati con un angolo di apice di 10°, quindi, con una lunghezza di scansione di 15,3 mm, l'interferometro può trasmettere un ritardo di 2500 fs a 600 nm, ottenendo una risoluzione spettrale di 23 ^cm-1, su tutto l'intervallo spettrale di interesse (la sensibilità della telecamera al silicio rappresenta il limite superiore). Questo lavoro presenterà la strategia per un adeguato impostazione del campionamento dell'interferogramma (cioè il range a passo e scansione) per ottenere la risoluzione spettrale desiderata e per gestire il fondo a banda larga, separando il segnale Raman dalla fotoluminescenza.

Come descritto da Candeo et ^al.17, questo spettrometro bireffringente può essere accoppiato a un microscopio ottico commerciale per eseguire misurazioni iperspettrali. I requisiti sono i seguenti: un corpo di microscopio ottico riconfigurabile, un interferometro bireffringente TWINS, una telecamera monocromatica a basso rumore (ad esempio, CCD o sCMOS) e una sorgente laser a banda stretta. Per quest'ultimo, le lunghezze d'onda tipiche di eccitazione per Raman e spettroscopia di fluorescenza sono 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm e 785 nm. Nonostante i laser ad alta purezza spettrale, come quello elencato nella Tabella dei Materiali, siano la scelta migliore, può essere utilizzato anche un laser con una larghezza di linea più ampia, ad esempio ~0,1 nm, data la limitata risoluzione spettrale dello strumento. Il microscopio viene aggiornato posizionando il TWINS nel percorso di rilevamento, tra la lente a tubo e il rivelatore monocromatico. Questa configurazione fornisce un ritardo uniforme del percorso attraverso il campo visivo e un contrasto medio del 55%. Il percorso di eccitazione è progettato per ottenere un'illuminazione uniforme del campione: in pratica, la punta di uscita di una fibra multimodale a grande nucleo viene visualizzata sul piano del campione. Utilizzando uno scrambler meccanico, i modi sono fortemente accoppiati nel nucleo della fibra, creando un profilo piatto sul piano campione. Inoltre, una bobina mobile vibrante media il pattern di speckle tipico della radiazione monocromatica. Una caratterizzazione di questa illuminazione a cilindro è mostrata nella Figura Supplementare 1. Il fascio viene focalizzato sul campione da un obiettivo corretto all'infinito, che raccoglie anche Raman retrodiffusa e luce di luminescenza verso il percorso di rilevamento. I filtri necessari per rifiutare l'illuminazione saranno dettagliati.

Per mostrare come misurare le caratteristiche spettrali a banda larga e stretta con questo microscopio iperspettrale, vengono misurate sia la luminescenza che la diffusione Raman per un campione di prova selezionato specificamente a scopo illustrativo. Il campione è costituito da una miscela di tre pigmenti in polvere con noti spettri Raman: due polimorfi di bianco di titanio (_{TiO 2}), ovvero rutile e anatasi, e giallo solfuro di cadmio (CdS). Tuttavia, la stessa procedura può essere utilizzata per una gamma più ampia di applicazioni, dalla scienza dei materiali alla biologia.

L'ambito di questo articolo è illustrare i passaggi per eseguire una misurazione iperspettrale, mentre l'assemblaggio e l'allineamento dell'interferometro TWINS sono dettagliati da Candeo et ^al.17. Pertanto, un sperimentatore interessato dovrebbe partire da un interferometro preassemblato basato su questa tecnologia.

Il protocollo inizia con la preparazione del campione e come impostare il microscopio per eccitare e raccogliere i fotoni di scattering Raman e PL. Successivamente, i parametri di scansione (lunghezza della scansione, passaggio di campionamento) e i parametri di acquisizione (tempo di esposizione, binning hardware) vengono impostati in base ai requisiti del segnale in esame. Infine, verrà presentato il pipeline di post-elaborazione, che dettaglia la procedura per recuperare lo spettro a ogni pixel (ipercubo spettrale, Figura 2B) dal dataset temporale acquisito (ipercubo temporale, Figura 2A), e delineando gli algoritmi per la riduzione del rumore e l'analisi spettrale avanzata. L'intero flusso di lavoro è mostrato nella Figura 3.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del campione

ATTENZIONE: Indossa guanti in lattice durante questa preparazione, poiché il pigmento CdS è tossico, soprattutto quando viene inalato.

1. Usa un raschietto per depositare 20 mg di ciascun pigmento in polvere su una bilancia di precisione, ottenendo un rapporto di peso 1:1:1.
   NOTA: Pulire con attenzione la punta del raschietto per ogni campione per evitare contaminazioni incrociate.
2. Mescola le polveri con una malta per rimuovere i grumi.
3. Versare la miscela risultante su un vetrino per microscopio; Usa la punta del raschietto per premerla delicatamente e ottenere uno spessore quasi uniforme dello strato.
4. Applica lo smalto sui bordi di un copertino per microscopio. Mettilo sulla miscela, con lo smalto rivolto verso il basso, e applica abbastanza pressione per sigillarla. Lascia asciugare per qualche secondo per indurire la lucidatura.

2. Installazione del microscopio

ATTENZIONE: Indossare occhiali di sicurezza quando il laser è acceso, poiché la potenza massima raggiungibile sul piano campione è di 300 mW.

NOTA: Le prestazioni del laser a pompaggio rimangono inalterate dalle variazioni di temperatura, purché vengano utilizzate entro l'intervallo specificato nel datasheet (ad esempio, 10-40 °C per il laser riportato nella Tabella dei Materiali).

1. Allinea l'interferometro TWINS lungo il percorso di rilevamento del microscopio.
   NOTA: Come dettagliato da Candeo et ^al.17, il modulo interferometro deve essere aggiunto tra la lente del tubo e il rivelatore, garantendo una distanza adeguata tra di essi. Per il microscopio utilizzato in questo lavoro, ciò è garantito solo quando il modulo oculare viene rimosso.
2. Per adattare lo schema di illuminazione di Koehler a un'eccitazione laser, si rimuove la lampada di eccitazione integrata del microscopio e si utilizza un obiettivo per raccogliere la luce all'uscita di una fibra multimodale a nucleo grande.
   NOTA: L'ingrandimento oggettivo determina la dimensione del pattern di illuminazione quando la punta della fibra viene coniugata con il piano campione. Una possibile scelta è un obiettivo 10x/0,25-0,30.
3. Scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione e mettere a fuoco il laser di eccitazione all'ingresso della fibra multimodale a nucleo grande. Accendi la telecamera ed esegui un software di visualizzazione.
   1. Attacca una sezione centrale della fibra alla membrana vibrante di una bobina mobile, che rimuoverà la macchia. Mescolare meccanicamente la fibra piegandola strettamente per unire tutte le sue modalità spaziali. Accendi il laser.
   2. Prepara un campione di prova per l'allineamento, ad esempio strisce fluorescenti rosse su un coperto di microscopio.
   3. Regolare la posizione della punta della fibra rispetto al sistema ottico di illuminazione muovendo la fibra con uno stadio di traslazione di precisione per ottenere un punto con intensità uniforme e bordi ben definiti sul piano del campione.
      NOTA: Per tutte le misurazioni riportate viene utilizzato un laser da 532 nm. Con una fibra di dimensioni 400 μm, il diametro del punto copre l'82% della larghezza del campo visivo della fotocamera.
4. Impiegare un set di filtri per i percorsi di eccitazione e rilevamento, adottando i seguenti criteri (Figura Supplementare 2):
   1. Utilizzare un filtro passa-banda stretto a 532 nm (larghezza di banda di 2,0 nm) per pulire la linea laser e rifiutare eventuali bande laterali della pompa derivanti dall'allargamento non lineare dovuto alla propagazione nella fibra.
   2. Utilizzare uno specchio dicroico (DM nella Figura 1) per riflettere la luce laser verso il campione e trasmettere la radiazione retrodiffusa spostata al rosso raccolta dall'obiettivo.
   3. Utilizzare un filtro passa-lunghi (LPF nella Figura 1) a 532 nm per rifiutare la luce residua di illuminazione.
   4. Durante la misurazione della diffusione Raman, si utilizza un filtro passa-corto (SPF nella Figura 1) a 600 nm per sopprimere la fluorescenza di fondo.
5. Misura la potenza sul piano campione con un misuratore di potenza. Attenuare il fascio di pompaggio per ottenere un'intensità al campione che non causi danni (dell'ordine di 2 W/^{cm 2}, come riportato nella Tabella 1). Usa un otturatore per il laser mentre regoli gli altri parametri di misura.
   NOTA: A causa della bassa sezione d'urto della diffusione spontanea Raman, è necessaria un'elevata densità di potenza per migliorare la raccolta del segnale. Tuttavia, bisogna considerare la soglia di danno campione. A differenza dei sistemi a scansione puntuale, una configurazione a campo ampio illumina un'ampia area, rendendo la dissipazione di energia meno efficiente e richiedendo una gestione attenta dell'energia per prevenire danni al campione.
6. Metti il campione sul palco del microscopio e regola la messa a fuoco.
   NOTA: Per trovare facilmente la messa a fuoco, prima illumina il campione con una lampada bianca in trasmissione o riflessione. Nel secondo caso, si poteva usare una lampadina posta accanto al microscopio. La messa a fuoco del campione sarà successivamente ottimizzata con la luce laser a pompa.

3. Parametri di misura

1. Accendi il driver del motore che esegue la trasposizione a cuneo. Controlla simultaneamente i componenti hardware (fotocamera e motore) per eseguire misurazioni iperspettrali (esempio di interfaccia utente mostrato nella Figura Supplementare 3).
2. Imposta i parametri di acquisizione della fotocamera, il tempo di esposizione e il binning hardware per ottimizzare l'intensità del segnale, adottando le seguenti istruzioni:
   1. Poiché un alto rapporto segnale-rumore (SNR) nel segnale temporale porta a un alto SNR negli spettri recuperati, si privilegia un tempo di esposizione lungo, che riempie meglio la gamma dinamica del sensore.
      NOTA: Per segnali bassi, come per la diffusione Raman, bisogna trovare un compromesso tra livello del segnale e tempo totale di misurazione: il tempo di esposizione più lungo potrebbe non essere fattibile.
   2. Scegli il binning hardware per raccogliere la carica da più pixel prima della lettura.
      NOTA: Sommare la carica e fare una singola lettura offre prestazioni di rumore migliori rispetto alla lettura di più pixel e poi sommare il loro segnale in post-elaborazione. La scelta del binning è anche guidata dalla riduzione accettabile della risoluzione spaziale.
3. Scegli i parametri di scansione, la lunghezza totale della scansione e il passaggio di campionamento secondo i seguenti criteri:
   1. Per ottenere un'alta risoluzione spettrale per i picchi Raman, si imposta una traslazione a cuneo lungo asimmetrico (-2526 fs→ -36 fs). D'altra parte, eseguire una scansione simmetrica attorno alla posizione di ritardo zero (-65 fs → 65 fs) per recuperare più caratteristiche spettrali a banda larga del segnale PL.
   2. Utilizzando l'Equazione 1 per il ritardo τ in funzione della traslazione wedge x, scegli il passaggio di campionamento per soddisfare il limite di Nyquist per la larghezza di banda spettrale di interesse.
      NOTA: Data la lunghezza d'onda minima dello spettro λ_min, imponere (Equazione 2).
      
      dove la birifrangenza Δn dipende dalla lunghezza d'onda (vedi le equazioni di Sellemeier).
4. Apri l'otturatore per puntare il laser sul campione. Se si osserva una diminuzione dell'intensità del segnale, si attende che il campione raggiunga una condizione di fermezza (tipicamente alcuni secondi).
   NOTA: Per compensare la diminuzione dell'intensità del segnale, regola il binning e il tempo di esposizione per mantenere un buon SNR.
5. Inizia l'acquisizione di un'immagine monocromatica per ogni posizione del cuneo, cioè il ritardo temporale tra repliche da ciascun punto del sensore 2D.
   NOTA: Il software di acquisizione dovrebbe salvare due variabili: l'ipercubo temporale (insieme di immagini 2D) e il vettore delle posizioni motorie registrate dall'encoder durante la scansione.
6. Una volta terminata la misura, spegni il laser e procedi con l'analisi dei dati.

4. Elaborazione del datacube acquisito

1. Genera l'ipercubo spettrale dal dataset acquisito, seguendo queste istruzioni:
   1. Carica il file di correzione delle posizioni dei motori per il motore passo a passo specifico (vedi la discussione).
   2. Carica il file di calibrazione delle frequenze per l'interferometro specifico per associare le frequenze spaziali misurate (pseudofrequenze) alle frequenze ottiche reali (vedi la sezione Discussione).
   3. Scegliere l'intervallo di frequenze per gli spettri che saranno calcolati trasformando Fourier gli interferogrammi di tutti i pixel.
   4. Tra le funzioni di apodizzazione^{disponibili 12} per il windowing dell'interferogramma misurato, seleziona quella che offre un buon compromesso tra allargamento spettrale e riduzione degli artefatti negli spettri recuperati, come la finestra Happ-Genzel (Hamming).
   5. Generare l'ipercubo spettrale trasformando Fourier gli interferogrammi apodizzati per tutti i pixel. Salvalo in valori complessi.
      NOTA: Lo spettro complesso di FT contiene informazioni aggiuntive, utili per ridurre il rumore del dataset ed estrarre gli spettri medi di un insieme di pixel selezionati.
2. Una volta calcolato l'ipercubo spettrale, si effettuano varie indagini, ad esempio ottenere lo spettro medio in aree selezionate; generare un'immagine RGB a falso colore; mappa i picchi spettrali; Sottrai il contesto.
3. Per ridurre il rumore spettrale, che può sopraffare picchi significativi, specialmente negli spettri Raman, implementare la Decomposizione a Valori Singolari (SVD)¹⁸ seguendo questi passaggi:
   1. Rimodella l'ipercubo temporale in una matrice A con interferogrammi lungo le sue righe.
   2. Eseguire la SVD della matrice, ottenendo le matrici U, S e V tali che A = USV^T.
      NOTA: Le colonne U sono le distribuzioni spaziali degli autovettori di V (colonne), mentre S è una matrice diagonale con valori singolari (SV) in ordine decrescente.
   3. Rimodella ogni colonna di U in una matrice di pixel ed esegui la sua FT 2D per ottenere le sue frequenze spaziali.
   4. Poiché le alte frequenze sono associate a cambiamenti molto bruschi nella mappa, consideratele come rumore; definire una regione quadrata centrata nello spazio di Fourier calcolato che separa le frequenze basse (principalmente segnale) e alte (principalmente rumore).
      NOTA: Una possibile scelta per quest'area è con un lato pari a 1/4 rispetto alla dimensione dello spazio di Fourier.
   5. Calcola il rapporto del segnale spaziale (SSR) per ogni SV dividendo la somma delle intensità dei pixel (modulo complesso) all'interno del confine per la somma delle intensità al di fuori del confine. Traccia SSR in funzione del numero SV.
   6. Definire una soglia per SSR, cioè il numero di SV significativi da mantenere per ridurre il contributo al rumore nel dataset, evitando artefatti.
      NOTA: SSR tipicamente mostra una tendenza decrescente che si stabilizza fino a un plateau man mano che aumenta il numero di valori singolari. Una regola pratica è mantenere i valori singolari fino al punto in cui inizia l'altopiano.
   7. Imposta tutti i SV inferiori a zero nella matrice diagonale S, ottenendo_{S denoised,} e calcola un ipercubo temporale denotato come V_{T denoise} negli Stati Uniti.
      NOTA: SVD è una fattorizzazione matriciale che può essere applicata anche all'ipercubo spettrale rimodellato (con righe contenenti spettri invece di interferogrammi).
4. Ripeti i passaggi 4.1-4.2 con l'ipercubo temporale denodatato per recuperare gli spettri.
5. Scarica il programma dal link nel Riferimento¹⁹ per eseguire un'analisi più approfondita del dataset con l'algoritmo Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS).
   NOTA: Gli sviluppatori di software forniscono una descrizione dettagliata^{dell'algoritmo 20}. Si tratta di un metodo iterativo per risolvere il problema dell'analisi della miscela: ogni spettro è espresso come la combinazione lineare di profili spettrali puri. Con una rappresentazione matriciale: B = C R^T+E, dove B è il dataset, C contiene le concentrazioni per ogni spettro, le colonne di R sono gli spettri di riferimento dei costituenti ed E esprime l'errore.
   1. Rimodella l'ipercubo spettrale in una matrice di N_pix x_{N frequenze} , con N_pix numero totale di pixel_{e N lunghezza} di vettore di frequenza N frequenze.
   2. Seleziona il numero di specie attese nel campione e carica i loro spettri di riferimento.
      NOTA: Gli spettri di riferimento possono essere misurati separatamente per ogni pigmento. Altrimenti, il programma realizzerà un SVD del dataset e utilizzerà tanti componenti principali quanti i componenti selezionati per le ipotesi iniziali.
   3. Seleziona vincoli: i profili spettrali recuperati devono essere non negativi e il più possibile simili agli spettri di riferimento.
   4. Traccia la mappa di concentrazione (colonne rimodellate di C) e gli spettri (colonne di R) per ogni specie.
   5. Esporta queste mappe e usale per produrre un'immagine a falso colore (Figura 4A), concludendo l'analisi.
      NOTA: I programmi utilizzati per ottenere i risultati qui presentati non sono disponibili pubblicamente, ma possono essere ottenuti dagli autori su richiesta.

Risultati

La Figura 4A mostra la mappa Raman per una regione selezionata della miscela di polveri. Si tratta di una rappresentazione a colori falsi delle mappe di abbondanza recuperate con MCR-ALS, come descritto nel passo 4.5. Fornisce informazioni sulla composizione del campione, poiché le tre specie possono essere chiaramente distinte all'interno del campo visivo. La Figura 4B mostra gli spettri medi nelle regioni selezionate della map...

Discussione

È stato introdotto un microscopio multimodale a campo ampio per l'acquisizione di immagini spontanee di scattering Raman e luminescenza, ed è applicabile alla scienza dei materiali. L'applicabilità ai campioni biologici è dimostrata da Candeo et ^al.17, che presentano un'immagine di fluorescenza iperspettrale di cellule umane colorate. La principale sfida per le misurazioni di scattering Raman in questo campo è prevenire danni fotofotografici derivanti da una dissi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anatasi	Kronos	1200	Polimorfo del pigmento bianco TiO2
Polvere di solfuro di cadmio	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Giallo di cadmio, indice colore scuro/PY35
Fotocamera	Andor	Luca R	Fotocamera CCD a moltiplicazione elettronica con 1004x1002 pixel di 8µ m x 8µ m
Filtro di pulizia	Semrock	LL01-532-12.5	& Oslash; 1/2" 2,0 nm - Filtro a linea laser FWHM a 532 nm
Copertine	BRAND GmbH & Co	4700 55	Copertura del microscopio in vetro borosilicato 22x22x0,15 mm
Specchio dicroico	Semrock	Di02-R532-25x36	Divisore di fascio dicroico laser a bordo singolo da 25,2x35,6 mm a 532 nm
Fibra	Thorlabs	M74L05	400µ Dimensione m-core, fibra multimodale NA 0,39
Laser	Hubner Photonics	Cobolt Samba 1000	Laser pompato a diodo CW a 532 nm, potenza massima 1000 mW
Filtro passa-lungo	Semrock	LP03-532RU-25	Filtro a passo lungo ultra ripido a 532 nm
Microscopio	Leica	DMRBE	Microscopio di ricerca trinoculare
Obiettivo	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0,30	Eccitato e obiettivo di raccolta con ingrandimento 10x, 0,3 NA
Obiettivo	Newport	M-10X	Obiettivo nel percorso di illuminazione, con ingrandimento 10x, 0,25 NA
Rutile	Kronos	2900	Polimorfo del pigmento bianco TiO2
Filtro passa-corto	Thorlabs	FESH600	& Oslash; Filtro passa-corto da 25,0 mm con lunghezza d'onda di taglio 600
Diapositive	Marienfeld	1000612	Vetrini microscopici 76x26x1 mm