Applicazione del disegno up-and-down di Dixon per stimare la concentrazione alveolare minima di sevoflurano nei ratti con una classificazione del movimento raffinata

Sommario

Il protocollo qui presentato cerca di valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il design Up-and-Down di Dixon in ratti sedati sottoposti a uno stimolo doloroso standardizzato. Inoltre, delinea una classificazione dei vari schemi di movimento osservati.

Abstract

Quando si utilizzano agenti anestetici volatili, la misura standard della potenza è la concentrazione alveolare minima (MAC), definita come la concentrazione alveolare alla quale il 50% dei soggetti non mostra una risposta motoria a uno stimolo doloroso. Negli studi clinici e sperimentali, l'attuale consenso afferma che solo i "movimenti intenzionali grossolani" contano come una risposta motoria positiva e possono, quindi, indicare una sedazione troppo lieve. Tuttavia, il livello appropriato di anestesia, sia nell'uomo che negli animali, varia individualmente in base a vari fattori di influenza, come altri farmaci somministrati. Sono stati condotti due studi sugli animali nei ratti per esaminare gli effetti del tetraidrocannabinolo e dell'etanolo sul sevoflurano, uno degli anestetici volatili più comunemente usati. Per stimare il MAC, è stato impiegato il design Up-and-Down di Dixon. Per il primo animale è stata scelta una dose predeterminata di sevoflurano. Dopo un periodo di equilibrio di 15 minuti, uno stimolo antidolorifico standardizzato è stato applicato al terzo distale della coda del ratto utilizzando una pinza chirurgica. La risposta dell'animale allo stimolo è stata documentata come positiva o negativa. Se si verificava una reazione motoria positiva, la dose per l'animale successivo veniva aumentata. Al contrario, se il ratto non mostrava una risposta motoria, la dose per l'animale successivo veniva diminuita. La regressione isotonica e il metodo bootstrap sono stati utilizzati per stimare il MAC e gli intervalli di confidenza al 95%. Questo articolo delinea un protocollo dettagliato per valutare la profondità dell'anestesia nei ratti utilizzando il design up-and-down. Fornisce inoltre una descrizione e una categorizzazione nuove e dettagliate dei modelli di movimento nei ratti sedati quando viene applicato uno stimolo doloroso standardizzato per migliorare la riproducibilità per studi futuri.

Introduzione

Il sevoflurano è uno degli anestetici volatili per inalazione più frequentemente utilizzati¹. La sua potenza viene valutata utilizzando la concentrazione alveolare minima (MAC), che è definita come la concentrazione alveolare alla quale il 50% dei pazienti non mostra una risposta motoria a uno stimolo doloroso ^2,3,4. Per stabilire il MAC, i ratti possono essere utilizzati come modelli animali grazie alla loro maggiore omogeneità rispetto agli esseri umani. Lo stimolo del dolore viene tipicamente applicato utilizzando un morsetto chirurgico sul terzo distale della coda del ratto². L'utilizzo di metodi alternativi per il test del dolore non garantirebbe la comparabilità con gli studi condotti in precedenza e potrebbe, pertanto, generare risultati divergenti. A causa della grande varietà di schemi di movimento in risposta allo stimolo, l'attuale consenso afferma che solo i "movimenti intenzionali grossolani" devono essere considerati reazioni motorie positive³. Tuttavia, questa definizione manca di ulteriori precisazioni riguardo a quali categorie specifiche si qualificherebbero come "grossolanamente intenzionali" e in che misura un movimento dovrebbe soddisfare questo criterio. Questo è della massima importanza, poiché una risposta motoria a uno stimolo può indicare, in un contesto clinico, una profondità di sedazione insufficiente.

Vari fattori influenzano lo stato anestetico, tra cui l'età^{di 5} anni, le comorbilità⁶, la compromissione della funzionalità epatica⁷ o l'ipotermia⁸. Inoltre, i farmaci somministrati insieme agli anestetici influenzano in modo significativo la profondità dell'anestesia. Ad esempio, il fentanil e il propofol, spesso utilizzati durante la fase di induzione, riducono la quantità richiesta di sevoflurano ^9,10. Inoltre, è stato dimostrato che la lidocaina o il pregabalin possono abbassare il MAC del sevoflurano^11,12. Inoltre, l'assunzione recente di alcol o sostanze come il tetraidrocannabinolo (THC) può anche ridurre il MAC, aumentando così la profondità dell'anestesia^13,14. Al contrario, è stato suggerito che gli agenti simpaticomimetici possono alleggerire la sedazione stimolando il sistema nervoso centrale¹⁵.

Per migliorare la riproducibilità per studi futuri, vengono forniti un protocollo dettagliato e descrizioni video per valutare il MAC nei ratti utilizzando il design up-and-down di Dixon¹⁶ . A differenza dei precedenti studi MAC, questo protocollo delinea passaggi procedurali dettagliati per supportare la riproducibilità tra i laboratori. Inoltre, sono state rianalizzate le riprese video di due studi precedentemente pubblicati e le risposte motorie sono state classificate in base alla loro estensione e modello (movimenti coordinati - rotolamento, stretching, movimento saltatorio e curling con movimento non coordinato). Pertanto, questo studio offre anche una descrizione e una classificazione innovativa e approfondita dei modelli di movimento nei ratti sedati in risposta a uno stimolo doloroso standardizzato, con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità per la ricerca futura.

Protocollo

Tutti gli studi sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato Intramurale per la Sperimentazione Animale dell'Università di Medicina di Vienna e dall'autorità di regolamentazione competente (Ministero Federale Austriaco per le Donne, la Scienza e la Ricerca). Gli esperimenti sono stati condotti in anestesia costantemente mantenuta. Gli animali non percepiscono consapevolmente il dolore anche se dovesse verificarsi un movimento¹⁷. Sono stati utilizzati ratti Wistar adulti di età compresa tra 81 e 95 giorni.

1. Studiare gli animali e l'alloggio

1. Alloggia gli animali in base al peso e al sesso. Separare maschi e femmine e ospitarli per un minimo di 14 giorni prima di iniziare l'esperimento per consentire l'acclimatazione. Posizionare un massimo di tre ratti di peso superiore a 400 g o quattro ratti di peso inferiore a 400 g per gabbia.
2. Mantenere le condizioni ambientali con un ciclo di luce/buio di 12 ore, una temperatura ambiente di 22 °C e livelli di umidità compresi tra il 45% e il 65%.
3. Pesare regolarmente ogni animale e registrare il peso corporeo prima di ogni procedura.
4. Trasporta gli animali individualmente dall'area di stabulazione alla struttura di prova. Coprire ogni gabbia con un panno per ridurre lo stress visivo e ospitare gli animali non testati in una stanza separata per evitare l'esposizione alle procedure sperimentali.

2. Configurazione dell'attrezzatura

1. Verificare che tutta l'attrezzatura necessaria sia funzionante e disponibile prima di iniziare l'esperimento. Eseguire controlli delle apparecchiature secondo le linee guida istituzionali o le procedure operative standard, inclusi test di tenuta, calibrazione e test funzionali di potenza, ove applicabile.
2. Utilizzare una camera ermetica e trasparente (15 cm × 20 cm × 9 cm) per posizionare il topo. Assicurarsi che la camera sia dotata di un'apertura di 15 mm per guidare esternamente la coda riducendo al minimo le perdite di gas.
3. Collegare la linea di afflusso a un vaporizzatore di sevoflurano e a una fonte di ossigeno.
4. Collegare la linea di deflusso sul lato opposto della camera sia a un sistema di estrazione del gas che a un monitor per anestesia per registrare le concentrazioni di sevoflurano.
5. Verificare che il termometro rettale, la coperta riscaldante e il riscaldamento a infrarossi lamp sono operativi. Testare il termometro con un dispositivo di riferimento, verificare che la coperta riscaldante raggiunga gli intervalli di temperatura target e verificare che la lampada a infrarossi si accenda e mantenga un'uscita stabile. Posizionare la lampada direttamente sopra la camera di prova a distanza di sicurezza in conformità con le procedure di sicurezza locali.
6. Preparare una pinza arteriosa da 25 cm da utilizzare per lo stimolo del dolore standardizzato.

3. Preparazione del farmaco

1. Preparazione THC (opzionale)
   1. Utilizzare una formulazione di THC con una concentrazione di 25 mg/mL. Calcolare il volume richiesto per ciascun animale moltiplicando il peso corporeo in chilogrammi per (10 mg/kg/25 mg/mL), ottenendo 0,4 ml per kg di peso corporeo.
   2. Utilizzare una pipetta a spostamento positivo per prelevare l'esatto volume calcolato per ciascun animale. Non somministrare in questa fase. Preparare la pipetta e metterla da parte per la somministrazione successiva durante la fase di somministrazione del farmaco (vedere la fase 4.6).
   3. Utilizzare un puntale per pipetta adatto al calibro, ad esempio uno in grado di contenere in sicurezza fino a 0,3 ml di liquido. Eseguire la sonda orale direttamente utilizzando la pipetta caricata. Gettare il puntale della pipetta dopo ogni utilizzo per evitare la contaminazione incrociata.
2. Preparazione dell'etanolo (opzionale):
   1. Preparare l'etanolo alla concentrazione di dosaggio richiesta di 1 g/kg o 2 g/kg. Utilizzare una formulazione altamente concentrata di etanolo (ad es. 96-100%) come base e scioglierla in soluzione salina allo 0,9% fino a un volume totale di 10 ml/kg di peso corporeo per ogni singolo animale. Utilizzare lo stesso volume di soluzione fisiologica da solo del placebo corrispondente. Seguire tutte le linee guida di sicurezza istituzionali, in particolare quelle relative alla manipolazione e allo stoccaggio di sostanze infiammabili.
   2. Utilizzare una siringa adeguata (5 ml o 10 ml, a seconda del peso dell'animale) per estrarre l'esatto volume calcolato per ogni singolo animale. Non somministrare la sostanza in questa fase. Preparare la siringa e metterla da parte per l'iniezione intraperitoneale durante la fase di somministrazione del farmaco (vedere punto 4.6). Collegare un ago da 23 G per la somministrazione e coprirlo con un cappuccio corrispondente per evitare lesioni fino all'uso.

4. Applicazione del farmaco

1. Indurre l'anestesia per la somministrazione del farmaco posizionando il ratto nella camera e inondandolo con 3,5% vol% di sevoflurano in ossigeno al 100% a 3 L/min.
2. Attendere circa 3-5 minuti fino a quando l'animale non è visivamente incosciente.
3. Eseguire il test del riflesso raddrizzante inclinando delicatamente la camera per far rotolare l'animale sulla schiena. Se non tenta di raddrizzarsi entro 10 s, assumere un'adeguata profondità di anestesia.
4. Ridurre temporaneamente la concentrazione di sevoflurano a 0 e lavare la camera con ossigeno al 100% per 15 s per ridurre al minimo l'esposizione al gas anestetico per lo sperimentatore.
5. Rimuovere l'animale dalla camera e posizionarlo davanti a un tubo di erogazione del gas che eroga la stessa concentrazione di sevoflurano per mantenere l'anestesia durante la somministrazione. Saltare questo passaggio se la somministrazione della sostanza in esame è sufficientemente breve da evitare il recupero dall'anestesia.
6. Somministrare sostanze secondo il disegno sperimentale: Somministrare 10 mg/kg di THC tramite sonda gastrica o somministrare 1 g/kg o 2 g/kg di etanolo per via intraperitoneale. Fare riferimento alla Sezione 3 per i dettagli sulla preparazione e seguire le linee guida istituzionali per l'esecuzione delle procedure di somministrazione sia con sonda gastrica che intraperitoneale.
7. Rimetti l'animale nella sua gabbia per riprendersi.
8. Attendere 1 ora per l'etanolo e 2 ore per il THC prima di continuare con la procedura.

5. Induzione dell'anestesia per il test MAC

1. Trascorso il periodo di attesa, riposizionare il ratto nella camera di prova ermetica e inondarla con la miscela determinata di sevoflurano e ossigeno. Garantire un flusso costante di ossigeno di 3 L/min. Determinare la concentrazione individuale di sevoflurano (fase 9.1) per ciascun animale, iniziando con 2,6 vol% (o un altro punto di partenza predeterminato in base alla pianificazione statistica) per il primo animale di ciascun gruppo. Di seguito viene fornita una descrizione dettagliata del design Up-and-Down.
2. Accendere la lampada riscaldante a infrarossi.
3. Attendere circa 3-5 minuti fino a quando l'animale non è visivamente incosciente.
4. Eseguire il test del riflesso raddrizzante inclinando delicatamente la camera per far rotolare l'animale sulla schiena. Se non tenta di raddrizzarsi entro 10 s, assumere un'adeguata profondità di anestesia.
5. Ridurre temporaneamente la concentrazione di sevoflurano a 0 e lavare la camera con ossigeno al 100% per 15 s per ridurre al minimo l'esposizione al gas anestetico per lo sperimentatore.
6. Aprire rapidamente la camera e inserire il termometro rettale. Monitorare la temperatura corporea interna durante la procedura e regolare di conseguenza l'intensità della lampada riscaldante a infrarossi e della coperta riscaldante.
7. Condurre la coda all'esterno attraverso la piccola apertura nella camera.
8. Chiudere rapidamente la camera.
9. Ristabilire immediatamente la concentrazione di sevoflurano desiderata prima di procedere.

6. Tempo di equilibratura

1. Attendere un periodo di 15 minuti per l'equilibrio.
2. Monitorare continuamente la temperatura interna dell'animale (37,2 °C ± 0,3 °C) e regolare di conseguenza i dispositivi di riscaldamento per mantenere la normotermia.

7. Stimolo del dolore

1. Identificare il terzo distale della coda.
2. Applicare lo stimolo doloroso bloccando il morsetto nella sua terza posizione (circa 50 N di forza).
3. Lasciare la pinza bloccata nella sua terza posizione fino a quando il ratto non mostra una risposta di movimento positiva ma per un massimo di 1 minuto.
4. Registrare nel protocollo la presenza o l'assenza di una reazione motoria. Fornire una breve descrizione del movimento osservato in termini di modello ed estensione. Fare riferimento al punto 11 per la classificazione degli schemi di movimento.

8. Recupero

1. Spegni il vaporizzatore e la lampada riscaldante e rimetti il topo nella gabbia.

9. Design su e giù

1. Determinare la concentrazione di sevoflurano per il seguente esperimento utilizzando il disegno Up-and-Down di Dixon. Se l'animale precedente ha mostrato una risposta motoria allo stimolo, aumentare la concentrazione per l'animale successivo dello 0,2% pt. Al contrario, se l'animale precedente non ha mostrato alcuna risposta motoria, diminuire la concentrazione dello 0,2% pt.

10. Eutanasia (se applicabile)

NOTA: L'eutanasia non è intrinsecamente una parte necessaria degli esperimenti. Deve essere consultato il comitato intramurale competente per gli esperimenti sugli animali. Per i due studi di riferimento, si è deciso di eseguire prelievi di sangue intracardiaci e successivamente di sopprimere gli animali. Gli animali non sono stati riportati nella gabbia come descritto nel passaggio 8.1, ma la procedura è continuata direttamente con il passaggio 9.1.

1. Preparare la soluzione per l'eutanasia sciogliendo 300 mg di pentobarbital in 1 mL di soluzione fisiologica. Aspirare la soluzione in una siringa e tenerla pronta per l'uso immediato dopo il prelievo di sangue.
2. Estrarre il ratto dalla scatola e posizionarlo davanti a un tubo di respirazione che eroga il 3,5% in volume di sevoflurano in ossigeno al 100% per mantenere un'anestesia costante. Posizionare l'animale sulla schiena per consentire un accesso senza ostacoli all'area toracica.
3. Eseguire il prelievo di sangue intracardiaco utilizzando un ago da 23 G e una siringa da 5 ml. Palpare delicatamente il battito cardiaco con un dito per localizzare il cuore. Inserire l'ago appena caudale al processo xifoideo, leggermente a sinistra della linea mediana e con un angolo poco profondo.
4. Aspirare delicatamente regolando la posizione dell'ago fino a quando non si osserva il flusso sanguigno. Raccogli il volume richiesto.
5. Dopo aver completato il prelievo di sangue, rimuovere con cautela la siringa dall'ago e collegare la siringa precaricata contenente la soluzione di pentobarbital. Somministrare l'intero 1 ml di soluzione per via intracardica per garantire l'eutanasia in conformità con le linee guida etiche istituzionali.

11. Continuare gli esperimenti

1. Ripetere l'esperimento a partire dal passaggio 3 per ogni animale oggetto di studio individualmente.

12. Classificazione degli schemi di movimento (opzionale)

1. Classificare le risposte comportamentali nelle seguenti categorie:
   1. Rotolamento: Classificare come rotolamento quando la risposta comportamentale comporta una rotazione assiale del corpo, tipicamente lungo l'asse longitudinale.
   2. Stretching: classificare come stretching quando la risposta comportamentale è caratterizzata da un'estensione bilaterale e simmetrica verso l'esterno degli arti e del corpo.
   3. Movimento saltatorio: classificare come movimento saltatorio quando la risposta comportamentale consiste in calci improvvisi focalizzati sugli arti posteriori o scatti simili a brevi esplosioni di tutto il corpo.
   4. Curling: classificare come curling quando la risposta comportamentale comporta un movimento scoordinato, diretto verso l'interno di intensità variabile, che provoca la flessione del corpo verso il suo centro.

Risultati

Nello studio sul THC, la stima bootstrap del MAC era di 2,8 vol% nel gruppo di controllo (IC 95%: 2,7-2,9 vol%) e di 2,1% in volume nel gruppo THC 10 mg/kg (IC 95%: 1,8-2,4 vol%)¹³.

Nello studio sull'etanolo, il MAC stimato era di 2,24 vol% nel gruppo di controllo (IC 95%: 1,97-2,94 vol%). Nel gruppo 1 g/kg di etanolo, era 1,65 vol% (IC 95%: 1,40-1,98 vol%) e nel gruppo 2 g/kg di etanolo, 1,08 vol% (IC 95%: 0,73-1,42 vol%)¹⁴. Il diverso numero di...

Discussione

Questo studio perfeziona il protocollo per determinare il MAC del sevoflurano nei ratti dettagliando i passaggi metodologici critici e affrontando le sfide comuni per contribuire a un approccio più standardizzato e riproducibile per la valutazione della profondità dell'anestetico.

Una determinazione accurata della MAC è essenziale sia per le pratiche anestesiologiche sperimentali che cliniche. Questo lavoro contribuisce alla letteratura esistente fornendo un m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camera trasparente ermetica	N/A	N/A	Generico
Morsetto arterioso	KLS Martin	13-410-22-07	25 cm
Dott. ger Primus	Dott. ger Austria GmbH	Primus
Dott. ger Vapor 2000	Dott. ger Austria GmbH	Vapore 2000
Unità di controllo per coperte omeotermiche	Apparato di Harvard, Holliston, Massachusetts, Stati Uniti	50-7137	230 V
Scaldaneonati mobile manuale	Fisher/Paykle, Auckland, Nuova Zelanda	IW9210/920