In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

Sommario

Questo articolo introduce una semplice ricostituzione one-pot di reti citoscheletriche all'interno di vescicole giganti separate in fase. Il metodo può essere generalizzato e applicato all'incapsulamento o al confinamento di un'ampia gamma di biomolecole.

Abstract

Le membrane lipidiche biomimetiche sotto forma di vescicole unilamellari giganti (GUV) sono comunemente utilizzate per imitare il comportamento della membrana cellulare a causa della facilità di ricostituzione delle proteine all'interno delle GUV, della visualizzazione e della comprensione delle dinamiche delle proteine della membrana cellulare. Tuttavia, le membrane cellulari comprendono zattere lipidiche (o domini) derivanti dalla presenza di diversi lipidi nella membrana cellulare. Tale maggiore complessità nei sistemi modello può essere incorporata per ottenere GUV separati in fase, dove la composizione lipidica può essere regolata con precisione. Mentre i metodi di incapsulamento per la generazione di GUV omogenei sono ampiamente noti, i metodi per incapsulare le proteine all'interno di GUV separati di fase sono limitati. Qui, questo protocollo presenta una produzione semplificata di GUV separati in fase, costituiti da domini liquidi disordinati (L_d) e liquidi ordinati (L_o), che incapsulano in modo efficiente diverse proteine del citoscheletro, ad esempio FtsZ e actina, rendendo il metodo uno strumento versatile per una produzione cellulare minima. In particolare, questo approccio utilizza un protocollo di trasferimento dell'emulsione per produrre GUV con un'elevata efficienza di incapsulamento. In questo metodo, un monostrato lipidico viene prima generato emulsionando una soluzione proteica in una miscela di lipidi/olio, dove i lipidi di varie temperature di transizione di fase vengono scelti per produrre la separazione di fase nei GUV risultanti. Questa emulsione viene trasferita delicatamente sopra una soluzione di lipidi in olio in un altro tubo, con conseguente formazione di un'interfaccia acqua-olio. La soluzione viene quindi centrifugata a temperature elevate (idealmente a 37 °C per mantenere l'attività proteica), dopodiché i GUV vengono raccolti per l'imaging. Questo metodo semplifica la ricostituzione in vitro delle proteine del citoscheletro all'interno di GUV separati in fase senza l'utilizzo di un ingombrante setup di laboratorio, e quindi funge da metodo conveniente per studiare la meccanica delle interazioni citoscheletrico-membrana in confinamento.

Introduzione

Le vescicole giganti fungono da sistemi modello per comprendere le funzioni cellulari ^1,2. La loro facilità di produzione, visualizzazione, sintonizzabilità e ricostituzione in vitro di biomolecole rendono questi modelli biomimetici il sistema di scelta per molti studi di ricerca ^3,4,5. Esistono diversi metodi noti per produrre GUV, come l'elettroformazione⁶, cDICE ^7,8, il trasferimento di emulsione e altri metodi basati sulla microfluidica ^9,10. La produzione di GUV con tali metodi è riportata in letteratura ^3,11. Inoltre, in vitro, la ricostituzione delle reti citoscheletriche all'interno dei GUV è stata precedentemente descritta utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione grazie alla facilità di questo metodo di formazione one-pot, che non richiede alcuna configurazione complessa¹². Tuttavia, tale ricostituzione è riportata molto comunemente nei GUV omogenei, un sistema che non imita completamente la complessità delle membrane cellulari.

Questo protocollo descrive la ricostituzione in vitro di reti citoscheletriche all'interno di GUV separati in fase, che presentano la complessità della membrana lipidica. Mentre è stato precedentemente riportato che tali reti si legano sulla superficie della membrana (all'esterno) ma non confinate all'interno delle vescicole giganti^13,14, l'attuale tecnica di trasferimento dell'emulsione si concentra sul protocollo per produrre la separazione di fase, oltre a mantenere l'attività della formazione della rete del citoscheletro. Una delle principali sfide di questa tecnica è la temperatura. I metodi di produzione standard per generare GUV a separazione di fase richiedono l'uso di temperature elevate, che variano a seconda della temperatura di transizione di fase dei lipidi costituenti. Tuttavia, le proteine del citoscheletro non sono in grado di polimerizzare in strutture di ordine superiore a temperature così elevate 15,16,17. Pertanto, questo protocollo non solo impiega una composizione lipidica per produrre la separazione di fase nei GUV a temperatura ambiente, ma ottimizza anche le condizioni per produrre una buona resa di GUV a temperature fisiologiche.

Un altro aspetto da considerare durante la produzione di sistemi GUV ricostituiti è il volume delle biomolecole incapsulate richieste. Per la maggior parte delle proteine, la produzione di volumi più elevati può essere costosa e richiedere molto tempo, coinvolgendo diversi cicli di purificazione. Inoltre, gli esperimenti di ricostituzione in vitro richiedono generalmente una fase esplorativa iniziale in cui le concentrazioni di biomolecole, le composizioni tampone, ecc., vengono prima testate per ottenere un contenuto di soluzione interno ottimizzato. Pertanto, questo protocollo ottimizza il protocollo di produzione GUV per due diversi saggi, che si adattano alle premesse di cui sopra. Da un lato, questo protocollo descrive un test che ottimizza il protocollo standard di emulsione invertita, che coinvolge volumi relativamente più elevati di proteine e genera una produzione di GUV ad alto rendimento in provette, che vengono successivamente trasferite a piastre di imaging a 96 pozzetti. D'altra parte, l'approccio qui descritto ottimizza anche il protocollo per la produzione di GUV a separazione di fase direttamente nelle piastre a pozzetti di imaging, che impiega volumi inferiori di biomolecole (~1/4 delle quantità necessarie per la produzione in provette) e consente la generazione di GUV in serie, ottenendo molte condizioni incapsulate in un'unica fase di centrifugazione. Pertanto, il protocollo presentato qui mostra un metodo di incapsulamento, ma consente all'utente di scegliere una delle due configurazioni in base alle proprie esigenze.

Inoltre, questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per l'incapsulamento per due diverse reti citoscheletriche: FtsZ e actina. Poiché queste due proteine richiedono diverse condizioni di tampone e affollamento, il protocollo affronta le successive modifiche necessarie per ottenere una ricostituzione ottimale della rete. Pertanto, l'approccio qui presentato può essere utilizzato e generalizzato per incapsulare qualsiasi biomolecola richiesta all'interno di GUV separati in fase.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della miscela lipidica

1. Assumere 0,5 mL di cloroformio in un flaconcino di vetro da 5 mL. Aggiungere 17,5 μL di DOPC, 7,4 μL di DOPG, 29,6 μL di DPPC (tutti da 25 g/L di ceppi lipidici preparati in cloroformio), 32,2 μL di 10 g/L di DPPG e 20,6 μL di 18 g/L di colesterolo. Aggiungere 1,2 μL di 1 g/L di colorante Atto655-DOPE. Agitare delicatamente la miscela lipidica e far evaporare il cloroformio sotto il flusso di azoto e risospendere il film sottile in un totale di 400 μL di cloroformio.
2. Per l'incapsulamento di FtsZ, la miscela lipidica finale preparata è nel rapporto DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol ratio) marcato con 0.001 mol% Atto655-DOPE. Per la produzione di GUVs con actina fasciata incapsulata, la miscela lipidica contiene lipidi biotinilati ed è preparata nel rapporto DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30:1) marcato con 0,001 mol% di Atto655-DOPE.
3. Sciogliere la miscela lipidica (32 mM, 50 μL) in cloroformio e asciugare in una fiala di vetro sotto il flusso di gas N₂ per ~15 min.
4. La fiala di vetro viene quindi conservata sotto vuoto in un essiccatore per ~30 minuti per eliminare eventuali tracce di cloroformio residuo.
5. Disperdere il film essiccato in una miscela di decano (20 μL) e olio minerale (500 μL) nella fiala di vetro per ottenere la concentrazione finale di 3,2 mM e sonicare a temperature elevate (~50 °C) per ~30 minuti utilizzando un sonicatore a bagno.
6. Trasferire la miscela di lipidi in olio in una provetta e incubare la provetta a 37 °C per ~10 minuti prima di procedere con i passaggi successivi.
7. Preparare la miscela di incapsulamento interna per le proteine.

2. Preparazione di soluzioni interne per l'incapsulamento

1. Miscela di filamenti FtsZ
   1. Preparare la miscela proteica FtsZ in un volume totale di 10 μl in una microprovetta. Per la rete filamentosa FtsZ, aggiungere 0,87 μL di 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1,31 μL di 381 g/L Ficoll70, 1,11 μL di 271 g/L BSA e 1 μL di 25 mM GTP a 5,71 μL di tampone di reazione FtsZ (RB). Il volume totale della soluzione è di 10 μL contenente 2 μM di FtsZ-YFP-mts, 50 g/L di Ficoll70, 30 g/L di BSA e 2,5 mM di GTP nella soluzione finale. Tenerlo sul ghiaccio prima di utilizzarlo per l'incapsulamento all'interno dei GUV.
      NOTA: Il tampone di reazione FtsZ (RB) contiene 50 mM di Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM di GluK, 5 mM di GluMg.
2. Miscela di fasci di actina
   1. Per l'incapsulamento dei fasci di actina, preparare prima una miscela master di actina da 10 μL (A-Mix) contenente l'86% di G-actina, il 10% di Atto488-actina e il 4% di actina biotinilata in acqua. Per questa fase, preparare le soluzioni proteiche secondo le istruzioni del produttore. Quindi, per una concentrazione finale di 35,42 μM A-Mix, aggiungere 6,39 μ L di 2 g/L di G-actina, 1,48 μL di 1 g/L di Atto488-actina, 1,19 μL di 0,5 g/L di actina biotinilata e 0,9 μL di H₂O. Tenere in ghiaccio e coprire al riparo dalla luce.
   2. Per prevenire la pre-polimerizzazione e il raggruppamento dell'actina al di fuori dei GUV, preparare la soluzione finale di actina pochi minuti prima dell'incapsulamento. La soluzione finale è composta da iodixanolo al 7%, 0,01 g/L di Neutravidin, 2,4 μM di A-Mix, 0,6 μM di Fascin, 10 g/L di BSA, 20 g/L di Ficoll70 e 5 mM di ATP in tampone di polimerizzazione dell'actina.
      1. Per preparare questa soluzione finale, che deve essere tenuta sempre in ghiaccio, aggiungere nel seguente ordine: 2,92 μL di iodisxanolo al 60%, 10,25 μL di H₂O, 2,5 μL di 0,1 g/L di Neutravidina, 0,92 μL di 271 g/L di BSA, 1,31 μL di 381 g/L di Ficoll70, 2,5 μL di tampone di polimerizzazione dell'actina 10x, 1,69 μL di A-Mix da 35,42 μM, 1,65 μL di Fascin da 9 μM e 1,25 μL di ATP da 100 mM. Mescolare bene e prelevare rapidamente i 5 μl necessari per l'incapsulamento.
         NOTA: misurare l'osmolarità di questa soluzione interna con un osmometro (~430 mOsm/Kg). Una miscela di soluzione esterna corrispondente con la stessa osmolarità deve essere preparata diluendo il glucosio in acqua fino a raggiungere lo stesso valore di osmolarità (vedere il passaggio 3.2). Il tampone di polimerizzazione dell'actina 10x contiene 100 mM di Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM di KCl e 50 mM di MgCl₂.

3. Produzione di GUV e incapsulamento in vitro

1. Produzione GUV in tubi: incapsulamento di FtsZ
   1. Per l'incapsulamento di FtsZ, aggiungere 500 μL di tampone di reazione FtsZ (RB) in una provetta di plastica da 1,5 mL e aggiungere delicatamente 200 μL di miscela di lipidi in olio (preparata al punto 1.6 sopra) per consentire la formazione di un'interfaccia olio-acqua e la deposizione di un monostrato lipidico su questa interfaccia.
   2. Per formare l'emulsione, prendere prima un'altra provetta da 1,5 ml e aggiungere 200 μl di lipide in olio. Incubare questa provetta a 37 °C per ~10 minuti prima di formare l'emulsione.
   3. Una volta incubata, aggiungere 5 μl della miscela proteica FtsZ (preparata in 2.1.1) a questa provetta. La proteina da 5 μL in mezzo acquoso affonda sul fondo della provetta sotto forma di gocciolina.
   4. Preparare un'emulsione picchiettando delicatamente sul fondo del tubo 5-6 volte fino a quando la soluzione diventa visibilmente torbida.
   5. Pipettare delicatamente questa emulsione e posizionarla sopra l'interfaccia olio-acqua (preparata al punto 3.1.1 sopra).
   6. Centrifugare a 6000 x g per 30 minuti a una temperatura preriscaldata di 37 °C e mantenere questa temperatura fino alla fine della produzione della vescicola.
   7. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per circa 30 minuti prima di eseguire l'imaging.
   8. Rimuovere lo strato superiore di olio pipettandolo delicatamente dalla parte superiore della provetta, lasciando quasi 100-200 μl di soluzione per l'imaging.
   9. Tagliare la punta di una pipetta con le forbici ad angolo inclinato e prelevare delicatamente 50-100 μl di soluzione GUV dal fondo della provetta. Questa soluzione verrà utilizzata per l'imaging.
2. Produzione di GUV direttamente in piastre a 96 pozzetti: incapsulamento dell'actina
   1. Per l'incapsulamento dell'actina, preparare prima una miscela di soluzione esterna (glucosio in acqua) con la stessa osmolarità della miscela interna di actina. Per abbinare i ~430 mOsm/Kg della miscela interna, creare una miscela di soluzione esterna aggiungendo 198 μL di glucosio 2 M in 802 μL H₂O.
   2. Per realizzare le vescicole direttamente su una piastra a pozzetti, passivare prima un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di 10 g/L di BSA nel pozzetto e incubare per 10-15 minuti. Quindi, lavare il pozzetto con 100 μL di soluzione esterna cinque volte facendo attenzione a non toccare il fondo di vetro passivato con il puntale della pipetta. Lasciare 100 μl della miscela di soluzione esterna nel pozzetto dopo aver completato il lavaggio.
   3. Aggiungere delicatamente 50 μl di miscela di lipidi in olio al pozzetto per preparare il monostrato lipidico sopra la soluzione esterna. Per garantire una corretta deposizione dell'olio sopra la fase acquosa, appoggiare la punta della pipetta su un lato del pozzetto e lasciare che l'olio scivoli dalla parete del pozzetto.
   4. Per formare l'emulsione, prendere prima una provetta da 1,5 ml e aggiungere 100 μl di lipide in olio. Incubare questa provetta a 37 °C per ~10 minuti prima di formare l'emulsione.
   5. Aggiungere 2,5 μl della soluzione finale di actina (dal passaggio 2.2.2) alla provetta contenente 100 μl di miscela di lipidi in olio (passaggio 1.6 sopra). La proteina da 2,5 μL in mezzo acquoso affonda sul fondo della provetta sotto forma di gocciolina.
   6. Preparare un'emulsione picchiettando delicatamente sul fondo del tubo 10-20 volte fino a quando la soluzione diventa visibilmente torbida.
   7. Pipettare delicatamente questa emulsione e posizionarla sopra l'interfaccia olio-acqua (preparata al punto 3.2.3 sopra). Immergere con cura la punta della pipetta al centro del monostrato di olio e depositare l'emulsione. L'emulsione forma una nuvola torbida confinata nella fase di monostrato dell'olio.
   8. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 200 x g per 20 minuti a una temperatura preriscaldata di 37 °C e mantenere questa temperatura fino alla fine della produzione della vescicola.
      NOTA: Centrifugare a 400 x g per 10 minuti per ridurre i tempi di produzione delle vescicole. Tuttavia, attenersi a questi parametri di centrifugazione per ottenere i migliori risultati. Una centrifugazione superiore a 400 x g provoca vescicole compattate con aggregati lipidici che si accumulano sul fondo della piastra di imaging.
   9. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per circa 30 minuti prima di eseguire l'imaging.
      NOTA: L'imaging diretto può essere eseguito su un pozzetto senza la necessità di rimuovere lo strato superiore di olio o trasferire le vescicole in un'altra camera/pozzetto.

4. Imaging e ricostruzione di immagini 3D

1. Prelevare una piastra da 96 pozzetti e passivarla con BSA per ~10 minuti prima di trasferire il campione nella piastra a pozzetti (vedere il passaggio 3.2.2).
2. Trasferire la soluzione GUV nella piastra a pozzetti passivata.
3. Posizionare la piastra a pozzetti sul tavolino di un microscopio confocale invertito su un obiettivo ad acqua 40x.
4. Concentrati su qualsiasi regione di interesse (ROI) e acquisisci una sequenza di immagini z-stack dal ROI scelto con intervalli di z-step fissi. Il protocollo produce GUV di dimensioni 5-30 μm, quindi l'intervallo può essere fissato a 0,5-1 μm, a seconda delle esigenze.
5. Salva ogni sequenza di immagini z-stack in .tiff formato.
6. Aprire una sequenza di immagini di interesse in un software di elaborazione delle immagini (ImageJ/Fiji). Identificare l'immagine con la massima intensità. Tieni premuto ctrl+shift+c per aprire la finestra Luminosità e contrasto e fai clic su Auto.
7. Dal menu ImageJ/Fiji, andare su Analizza > imposta scala e immettere la distanza fisica nota e la relativa unità per ciascun pixel dell'immagine.
8. Dal menu ImageJ/Fiji, andare a Image > Stacks > progetto Z per ricostruire un'immagine 3D dallo z-stack. Impostare il tipo di proiezione su Deviazione standard. Le opzioni predefinite possono essere utilizzate per il resto delle impostazioni (Avvia sezione e Interrompi sezione).
   NOTA: attenzione agli artefatti di proiezione della deviazione standard derivanti dalla sovrapposizione di z-stack nella ricostruzione 3D. Per assicurarsi che non vi siano artefatti, rimuovere gli z-stack nell'emisfero inferiore della sfera per osservare solo la metà superiore della proiezione.

5. Analisi statistica della frequenza GUV in base alla dimensione

1. Acquisire immagini Z-stack dei GUV di interesse, come spiegato nei passaggi 4.4 e 4.5. Per ottenere l'immagine del maggior numero possibile di GUV in un ampio campo visivo, acquisisci stack confocali con zoom 1x o 2x.
2. Aprire le sequenze Z-stack in un software di elaborazione delle immagini (in questo caso, ImageJ/Fiji), come spiegato in 4.6.
3. Selezionare il canale di visualizzazione in cui è stato acquisito il segnale di fluorescenza della membrana facendo clic sulla barra etichettata come c sotto l'immagine. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine come spiegato in 4.6.
4. Naviga tra i diversi piani acquisiti facendo clic sulla barra z sotto l'immagine aperta. Selezionare il piano in cui il diametro della vescicola da analizzare è maggiore.
5. Aprire il ROI Manager in ImageJ/Fiji facendo clic su Analizza > strumenti > ROI Manager.
6. Dagli strumenti disponibili nel pannello principale di ImageJ/Fiji, fare clic sulla selezione ovale.
7. Disegna un cerchio che si adatti al GUV seguendo l'intensità di fluorescenza della membrana GUV. Per disegnare una selezione circolare, premere il tasto Maiusc e trascinare il mouse per espandere il cerchio fino alle dimensioni della vescicola. La selezione del cerchio può essere spostata facendo clic contemporaneamente con il pulsante sinistro del mouse al centro della vescicola e trascinando il mouse nella posizione desiderata.
8. Memorizza la selezione del cerchio disegnata nel ROI Manager facendo clic su Aggiungi [t], che si trova nel pannello delle opzioni del ROI Manager.
9. Per ottenere la dimensione della vescicola in micron, cliccare su Misura che si trova sul pannello del ROI Manager. Apparirà una nuova finestra. Prendi il valore visualizzato nella colonna Maggiore o Minore (entrambe le colonne devono avere lo stesso valore in quanto si riferiscono agli assi dell'ellisse) come misura per il diametro della vescicola.
10. Utilizza il software di plottaggio (Excel, Origin, Prism) per creare un grafico a barre in cui è specificata la frazione di GUV per diversi intervalli di dimensioni.

Risultati

Come primo passo, i GUV con separazione di fase a membrana sono stati prodotti seguendo un approccio di emulsione invertita modificato (Figura 1A). Ciò si traduce in un'elevata resa di GUV, che presentano una membrana demiscelata nei domini L_d e L_o , come rappresentato dall'etichetta Atto 655-DOPE sul dominio L_d e dalle regioni scure corrispondenti ai domini L_o non marcati (Figura 1B). Questo metodo produce GUV separati in fase di dimensioni comprese tra 5 e 30 μm (Figura 1C) a temperature elevate (tutti i passaggi eseguiti a 37 °C e ripresi a RT). Inoltre, le velocità di centrifugazione sono state regolate per garantire l'incorporazione dei lipidi componenti originali all'interno dei GUV e per evitare un'eccessiva sovrappopolazione.

Inoltre, per dimostrare il successo dell'incapsulamento di biomolecole utilizzando il metodo dell'emulsione descritto nell'attuale protocollo, sia le reti di FtsZ che quelle di actina sono state ricostituite in esperimenti individuali. Le reti FtsZ sono ricapitolate all'interno di GUV, che emergono come filamenti che si legano preferenzialmente ai domini L_d attraverso la loro sequenza di targeting di membrana (MTS) in presenza di 2,5 mM GTP e 50 g/L di Ficoll70 (come illustrato in Figura 2). Le reti sono state osservate circa 1 ora dopo la fase di incapsulamento. Tuttavia, le reti di actomiosina emergono come fasci sottili (in contrasto con le reti spesse di FtsZ) dopo la ricostituzione all'interno dei GUV (Figura 3). Va notato che i lipidi biotinilati svolgono un ruolo cruciale nel legame delle reti di actomiosina alla membrana dei GUV. Senza lipidi biotinilati, i fasci di actomiosina non possono adottare una configurazione curva e rimangono come fasci diritti, corti e rigidi al lume invece di aderire alla membrana come una rete aggrovigliata di lunghi fasci (Figura 4).

Nel protocollo di emulsione modificato, la velocità di centrifugazione viene regolata per ottenere GUV separati in fase, come accennato in precedenza. Infatti, velocità di centrifugazione più elevate con campioni contenenti reti di actomiosina (600 x g per 15 minuti) provocano l'aggregazione delle vescicole in una configurazione simile a un tessuto all'interno del pozzetto di produzione. Pertanto, in tutti gli esperimenti standard di ricostituzione delle reti di actomiosina, la velocità di centrifugazione ottimale è stata impostata a 200 x g per ottenere GUV non aggregati (Figura 5).

Figura 1: Generazione one-pot di GUV separati di fase utilizzando il metodo del doppio trasferimento di emulsione. (A) Schema sperimentale delle fasi chiave nella produzione one-pot di vescicole separate di fase tramite doppio trasferimento di emulsione. (B) Immagine confocale di proiezione Z dei GUV risultanti generati seguendo il metodo descritto in A. La barra della scala è di 50 μm. (C) Grafico a barre con la frazione di GUV a separazione di fase generata in base al loro diametro. Esperimenti eseguiti n = 3, il numero totale di GUV analizzati per esperimento = 100. I dati mostrati come valori medi, i singoli punti dati sono i tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei tre esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Vescicole separate di fase con reti FtsZ incapsulate. (A) Immagini di proiezione 3D confocali eseguite su uno z-stack completamente acquisito di un GUV separato di fase contenente una rete FtsZ. (B) Immagini confocali a proiezione Z eseguite solo sulla metà superiore della vescicola. A causa della formazione eterogenea di domini sulla superficie del GUV, la ricostruzione 3D delle fette confocali acquisite mostra la sovrapposizione dei domini lipidici dalle aree superiore e inferiore della vescicola. Per evitare sovrapposizioni e facilitare l'ispezione visiva dei domini, la metà inferiore degli z-stack acquisiti viene rimossa dal file. La metà superiore risultante viene quindi utilizzata per la sua proiezione 3D tramite deviazione standard. Le barre della scala sono entrambe da 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vescicole separate in fase con reti di actomiosina incapsulate. (A) Immagini confocali in proiezione Z di un intero stack acquisito con una vista zoom-out del pozzetto dopo la produzione di vescicole. L'elevata resa delle vescicole ottenute consente lo studio di diverse strutture di actomiosina all'interno delle vescicole. La barra della scala è di 50 μm. (B) Immagini confocali in proiezione Z eseguite sulla metà superiore di una vescicola. Per facilitare l'analisi visiva dei domini lipidici, solo la metà superiore delle fette di immagine viene utilizzata per eseguire una proiezione 3D. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Importanza dei lipidi biotinilati per la generazione di reti di actomiosina legate alla membrana all'interno di vescicole separate di fase. Proiezioni 3D confocali raffiguranti vescicole separate di fase con reti di actomiosina non attaccate. Se i lipidi biotinilati non sono incorporati nella miscela, le strutture di actomiosina si formano al lume e non acquisiscono una configurazione curva sul foglietto interno delle vescicole (pannello di destra, actina marcata con Atto488). La barra della scala è di 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Effetto della velocità di centrifugazione sulla produzione di vescicole separate in fase tramite trasferimento di emulsione. Immagini 2D confocali che mostrano un campione GUV generato impiegando una forza di centrifugazione di 600 x g per 15 minuti. La velocità di centrifugazione impiegata, superiore a quella ottimizzata di 200 x g, determina l'aggregazione delle vescicole in una configurazione simile a quella dei tessuti all'interno del pozzetto. La barra della scala è di 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Una delle principali sfide per la ricostituzione in vitro di sistemi modello basati su membrana è l'incapsulamento di proteine all'interno di GUV separati in fase a causa della loro preparazione ad alte temperature. Infatti, la generazione di questo tipo di vescicole separate in fase attraverso la sintesi one-pot può portare a difficoltà derivanti dalla degradazione delle proteine a temperature elevate. Pertanto, questo protocollo descrive le condizioni ottimizzate per osservare la separazione di fase della membrana seguendo il metodo della doppia emulsione per la produzione di GUV a temperature fisiologiche, mantenendo contemporaneamente l'attività delle proteine incapsulate. Questo approccio introduce una carica negativa in entrambi i domini per facilitare il legame di qualsiasi proteina desiderata quando le interazioni elettrostatiche sono un prerequisito. Nel caso dell'incapsulamento di FtsZ, nonostante la presenza di carica negativa in entrambi i domini, le reti citoscheletriche si sviluppano e si legano preferenzialmente ai domini L_d , indicando che, insieme alla carica negativa, la fluidità della membrana è un requisito essenziale per il legame proteico¹⁸. Inoltre, nel caso dell'incapsulamento dell'actina, le reti si sviluppano su regioni di membrana in cui sono incorporati lipidi biotinilati¹⁹.

Sebbene il saggio di trasferimento dell'emulsione sia ampiamente utilizzato in letteratura, è stato applicato solo alla produzione di GÜV omogenei. Questo protocollo, quindi, consiste in diversi aspetti modificati del saggio, che consentono l'osservazione della formazione del dominio nella membrana. Uno degli aspetti principali in questo senso è la temperatura. Per osservare i domini, così come per mantenere la funzionalità delle proteine (in particolare la formazione della rete citoscheletrica), questo protocollo impiega 37 °C per produrre GUV. Da un lato, quando i GUV vengono prodotti a una temperatura più elevata, le proteine incapsulate perdono la loro funzionalità, risiedendo nel lume e non polimerizzando in strutture di ordine superiore. D'altra parte, se i GUV vengono prodotti a una temperatura più bassa, non si osserva la separazione di fase nella membrana. Pertanto, 37 °C diventa la temperatura ottimale per la produzione di GUV negli esperimenti.

È importante notare che questo protocollo fornisce due possibili sistemi di analisi per produrre GUV seguendo lo stesso principio di trasferimento dell'emulsione: all'interno di provette e piastre a pozzetti. Entrambi presentano vantaggi e svantaggi, di cui l'utente potrebbe dover tenere conto durante la fase di pianificazione sperimentale per determinare quale sistema si adatta meglio alle proprie esigenze. Infatti, le provette di plastica non richiedono una centrifuga dotata di rotore per piastre a pozzetti, sono più facili da maneggiare e consentono il controllo del fattore di diluizione delle vescicole dopo la produzione e prima dell'imaging. Tuttavia, richiedono volumi più elevati (sia per la fase oleosa che per quella acquosa) e la rimozione dello strato di olio dopo la produzione per l'estrazione del GUV, che può lasciare residui di olio nel pozzetto di imaging se questa fase non viene eseguita con attenzione. In alternativa, le piastre a pozzetti richiedono l'uso di un volume di campione inferiore, consentono l'incapsulamento di diverse condizioni interne in serie e contemporaneamente e non richiedono l'estrazione di GUV, poiché le vescicole possono essere visualizzate subito dopo la produzione nello stesso pozzetto di produzione. Il principale svantaggio delle piastre a pozzetti è l'aggregazione delle vescicole e la necessità di regolare i parametri di centrifugazione per ottenere una resa di produzione delle vescicole simile a quella osservata nelle provette.

Indipendentemente dal sistema di incapsulamento impiegato (provette o piastre a pozzetti), questo approccio dimostra che sono necessarie condizioni di affollamento ottimali per produrre i GUV, nonché per facilitare la polimerizzazione delle proteine incapsulate. In particolare, seguendo questo protocollo, la migliore condizione per i GUV con FtsZ incapsulato è stata osservata con 30 g/L BSA e 50 g/L di Ficoll70¹⁸; mentre per l'actina era necessaria una miscela di 10 g/L di BSA, 7% di iodixanolo e 20 g/L di Ficoll70¹⁹.

Un altro aspetto importante della produzione di GUV è la velocità e il tempo di centrifugazione. Per la formazione di reti FtsZ sotto le concentrazioni di affollamento sopra menzionate, la centrifugazione a 6000 x g per 30 minuti produce una popolazione di GUV ben distribuiti e separati sulla piastra del pozzetto di imaging. Al contrario, per l'actina, 200 x g per 20 minuti consente la generazione di un'elevata resa di produzione GUV. Se la velocità o il tempo di centrifugazione viene diminuito, la resa dei GUV ne risente, mentre aumentandola al di sopra di detti valori si verifica l'aggregazione dei GUV. In tali condizioni, questo protocollo genera GUV con la massima efficienza di incapsulamento e singoli GUV che non si attaccano tra loro.

Sebbene questo protocollo possa essere generalizzato a qualsiasi lipide e biomolecole incapsulate, la composizione della membrana desiderata e il contenuto delle vescicole determinano i parametri di centrifugazione, che consentono la generazione di vescicole separate in fase. Pertanto, questo protocollo funge da linea guida per consentire la produzione di diverse vescicole con domini di membrana.

Tali metodologie di ricostituzione in vitro all'interno di GUV separati di fase sono cruciali per comprendere l'intricata dinamica proteina-membrana mediata attraverso i domini lipidici, considerando la complessità delle membrane cellulari¹⁴. Le piccole dimensioni e la natura altamente dinamica di questi domini lipidici rendono difficile la caratterizzazione delle interazioni interfacciali in vivo. Pertanto, i GUV fungono da strumento vitale grazie alla loro relativa facilità di preparazione e modulazione fisico-chimica, nonché alla loro idoneità all'analisi mediante microscopia ottica²⁰.

Inoltre, l'incapsulamento di molecole funzionali all'interno di biointerfacce eterogenee presenta applicazioni promettenti nel campo della nanomedicina. In particolare, lo sviluppo di sistemi funzionalizzati di somministrazione di farmaci con diverse proprietà derivanti dalla distribuzione asimmetrica e dal partizionamento di biomolecole in aree confinate sulla loro superficie²¹. Le interazioni farmaco-lipidi svolgono un ruolo significativo nelle proprietà farmacocinetiche dei farmaci, come il loro trasporto, distribuzione e accumulo, che in ultima analisi influenzano l'efficacia dei farmaci utilizzati²². Pertanto, comprendere il ruolo di queste interazioni sulle proprietà farmacocinetiche dei farmaci è fondamentale per lo sviluppo di farmaci efficaci. Le membrane lipidiche modello possono essere esplorate per comprendere i loro meccanismi di interazione con peptidi, polimeri e nanovettori²³. Pertanto, i cambiamenti nella composizione lipidica delle cellule e dei tessuti in determinate condizioni di malattia possono alterare le interazioni biofisiche, che potrebbero essere esplorate per sviluppare farmaci specifici per bersagli e sistemi di somministrazione di farmaci²⁴.

In conclusione, il protocollo qui descritto fornisce una strategia semplice per generare GUV separati di fase con proteine incapsulate ancorate al loro foglietto lipidico interno. La generazione di questi sistemi vescicolari ha un uso promettente in campi come la biotecnologia e la biologia sintetica, dove assemblaggi multicomponente con funzionalità complesse per imitare funzioni simili a cellule potrebbero portare soluzioni innovative e nuove applicazioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (sale sodico) (DOPG)	Avanti Polar lipids	840475	In cloroformio
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar lipids	850375	In cloroformio
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolammin-N-(cap biotinyl) (sale sodico) (18:1 Biotinyl Cap PE)	Avanti Polar lipids	870273	In cloroformio
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (sale sodico) (DPPG)	Avanti Polar lipidi	840455	In cloroformio
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)	Avanti Polar lipids	850355	In cloroformio
Micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti (SensoPlate)
Actina (alfa-actina muscolo scheletrico, coniglio)	HYPERMOL	8101-01
Atto488-Actin (alfa-actina muscolo scheletrico, coniglio)	HYPERMOL	8153-01
Atto655-DOPE	ATTO-TEC	AD 655-16	Sonicatore
	Branson	1510R-MTH	Pulitore ad ultrasuoni Bransonic
Biotina-Actina (alfa-actina muscolo scheletrico, coniglio)	HYPERMOL	8109-01
BSA	Sigma Aldrich	A6003
Centrifuga	Eppendorf	5424R
Centrifuga	Eppendorf	5804 R
Cloroformio	Sigma Aldrich	67-66-3
Colesterolo (ovino)	Avanti Polar lipids	700000	In cloroformio
Decane	TCI Deutschland GmbH	D0011
Fascin (umano, ricombinante)	Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)	CS-FSC01-A
Ficoll70	Sigma Aldrich	F2878
Iodixanol (OptiPrep)	Sigma Aldrich	D1556
LSM800 microscopio a scansione	Carl Zeiss		C-Apochromat 40  &volte; &sottilesp;/1.2 obiettivo ad immersione in acqua. Laser a stato solido pompati a diodi: 488  nm e 640  Nm.
Olio minerale	Sigma Aldrich	8042-47-5
Miosina II (muscolo scheletrico di coniglio)	Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)	MY02-A
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific Inc.	31000
Osmometro	Fiske Associates		Micro-Osmometro Fiske modello 120
Greiner Bio-One	GmbH	07-000-109