In vivo Microscopia confocale: una procedura operativa standard per il rilevamento degli acari Demodex al margine palpebrale

Sommario

La microscopia confocale in vivo è una tecnica di imaging promettente ad alta risoluzione. Presentiamo la seguente procedura per i medici per rilevare Demodex al margine palpebrale in vivo.

Abstract

L'infestazione da acari Demodex può causare infiammazione del margine palpebrale e la blefarite da Demodex potrebbe dare origine a una serie di condizioni oculari nei casi clinici. Numerosi medici diagnosticano l'infestazione oculare da acari Demodex attraverso l'epilazione delle ciglia e l'osservazione delle ciglia al microscopio ottico in vitro. Tuttavia, la presenza di acari residui dopo la rimozione delle ciglia e il dolore associato alla procedura sono limitazioni delle cure cliniche standard.

La microscopia confocale in vivo (IVCM) è una tecnica di imaging non invasiva che consente ai medici di osservare in dettaglio gli acari Demodex sul margine palpebrale senza epilazione. Questa tecnica consente un'analisi indolore che può essere completata in <30 minuti. Nonostante la crescente attenzione prestata a questo esame, potrebbe essere inaccessibile a molti oftalmologi senza una vasta esperienza. Questo articolo presenta una procedura operativa standard per la visualizzazione degli acari Demodex al margine palpebrale con IVCM per promuovere una maggiore adozione di questo metodo nel lavoro clinico.

Introduzione

La blefarite è una delle diagnosi oftalmiche più comunemente riscontrate nella pratica clinica. Le prove suggeriscono un'associazione significativa tra la presenza di acari Demodex e blefarite¹. L'infestazione da acari coinvolge sia il danno diretto causato da Demodex² sia le risposte immunitarie innescate dalle sue secrezioni, che possono fungere da vettore per i batteri e potenzialmente contribuire allo sviluppo della blefarite³. La blefarite da demodex (DB) provoca uno spettro di eventi insoddisfacenti, tra cui danni alla cornea e alla superficie oculare¹, che influiscono negativamente sulla qualità della vita del paziente ^4,5.

Demodex è un acaro parassita che abita i follicoli piliferi e le ghiandole sebacee, così come le aree ad essi vicine⁶. Il rilevamento di Demodex all'interno o intorno ai follicoli delle ciglia può aiutare nella diagnosi di DB⁷. La diagnosi clinica di DB prevede l'epilazione delle ciglia e l'osservazione di Demodex al microscopio ottico. Tuttavia, è noto che molti acari che risiedono in profondità all'interno del follicolo possono rimanere nell'orifizio dopo la rimozione delle ciglia ^8,9,10, portando potenzialmente a una sottostima del numero di acari. La microscopia confocale in vivo (IVCM), uno strumento di imaging non invasivo in oftalmologia, offre un approccio alternativo per la visualizzazione di Demodex all'interno o intorno ai follicoli delle ciglia in vivo¹¹. Questa tecnica fornisce una visione delle microstrutture della superficie oculare e delle palpebre con una risoluzione simile all'istologia¹¹. Gli acari possono essere identificati visivamente in base alla loro morfologia e motilità caratteristiche. Tuttavia, l'IVCM può presentare sfide tecniche per gli oftalmologi che non hanno una vasta esperienza con questa modalità di imaging¹².

Per facilitare l'adozione dell'IVCM nelle applicazioni cliniche di routine, tra cui la diagnosi differenziale e il follow-up delle palpebre sane e della DB, proponiamo una procedura operativa standard (SOP) per l'osservazione degli acari Demodex al margine palpebrale. Questo protocollo fornisce ai medici un approccio sistematico per il rilevamento degli acari in vivo.

Protocollo

Questo protocollo si concentra sulla SOP utilizzata per l'osservazione di Demodex al margine palpebrale con IVCM (Figura 1). Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Eye Hospital, Wenzhou Medical University (approvazione IRB n. H2023-022-K-20) e il requisito del consenso individuale per questa analisi retrospettiva è stato revocato a causa della natura retrospettiva. Le procedure qui descritte fanno riferimento alle descrizioni che sono state riportate in precedenza 11,13,14,15,16.

Figura 1: Il dispositivo per la tomografia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparare il dispositivo e il programma

1. Accendere il computer.
   1. Dopo che viene visualizzato il desktop, spostare l'interruttore a bilanciere sul retro del dispositivo da O a I. Cercare il bagliore verde dell'interruttore a bilanciere che indica che il dispositivo è acceso prima di iniziare qualsiasi esame.
      NOTA: l'accensione del dispositivo prima di avviare il computer può causare un errore di connettività.
   2. Avviare il software e configurare le impostazioni del programma prima dell'esame. Nel menu Configurazione , selezionare Opzioni (File supplementare 1: Figura supplementare S1); quindi, seleziona la casella Mostra numeri immagine per visualizzare il numero immagine per ogni immagine. Inoltre, selezionare la casella Mostra informazioni all'uscita per evitare l'arresto involontario del software.
      NOTA: La visualizzazione delle miniature delle immagini come icone di grandi dimensioni facilita l'osservazione diretta dei risultati. Non modificare frequentemente le impostazioni.
2. Preparativi prima dell'esame
   1. Pulisci l'obiettivo con salviette per la pulizia dell'obiettivo. Disinfettare il poggiatesta e la mentoniera con batuffoli di cotone imbevuti di alcol per evitare infezioni derivanti da germi patogeni trasmessi da parti sporche del dispositivo.
   2. Regolare la mentoniera. Assicurarsi che la posizione orizzontale della mentoniera sia corretta: premere insieme le due leve nere per tirare in avanti la mentoniera fino a quando non si innesta.
   3. Spostare la fotocamera all'indietro. Ruotare la vite di regolazione per assicurarsi che si allontani dal paziente prima dell'esame.
   4. Applicare una goccia (circa 0,02 ml) di gel oftalmico a base di Carbomer come gel di contatto sulla superficie anteriore della lente del microscopio del dispositivo.
      NOTA: Assicurarsi che il gel di contatto sia privo di bolle d'aria e che ne venga utilizzata solo una piccola quantità. Troppo gel di contatto applicato sulla superficie anteriore della lente del microscopio del dispositivo può fluire nell'obiettivo e aderire ai componenti meccanici, causando danni al dispositivo.
   5. Rimuovere un cappuccio sterile in polimetilmetacrilato (PMMA) monouso dal coperchio protettivo e premere saldamente i lati del cappuccio sulla lente del microscopio del dispositivo senza toccare la superficie anteriore del cappuccio (Figura 2).
      NOTA: Per montare correttamente il tappo in PMMA, assicurarsi che il gel di contatto sia a contatto con la superficie posteriore del tappo senza bolle d'aria. I tappi sono conservati nell'apposito contenitore per evitare danni alla confezione sterile. Non utilizzare tappi con imballaggio danneggiato, che potrebbe comportare il rischio di infezioni durante l'esame.
   6. Applicare una singola goccia di sostituto lacrimale in gel sulla superficie anteriore del cappuccio come ponte in gel tra il cappuccio e la palpebra (Figura 2).
      NOTA: Per evitare confusione tra i gel, utilizziamo lo stesso gel oftalmico a base di Carbomer per entrambe le applicazioni: il sostituto lacrimale del gel e il gel utilizzato come agente tra la lente del microscopio e il cappuccio.
   7. Creare una nuova cartella paziente o selezionare una cartella paziente esistente.

Figura 2: Il corretto montaggio del tappo in PMMA e l'applicazione del gel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparare il paziente

NOTA: Non eseguire questo esame se l'integrità corneale è dubbia.

1. Per ottenere la collaborazione del paziente e ridurre al minimo i potenziali rischi, spiegare al paziente quanto segue:
   1. Assicurare al paziente che l'esame con il dispositivo è sicuro anche se tocca la palpebra. Informare il paziente che il suo occhio sarà anestetizzato da una goccia di un anestetico topico sul margine palpebrale.
   2. All'inizio dell'esame, chiedere al paziente di posizionare il mento sulla mentoniera e di appoggiare la fronte contro il poggiatesta durante la procedura di esame per ottenere la migliore qualità dell'immagine.
   3. Informare il paziente che il dispositivo verrà spostato vicino alla palpebra fino a quando il cappuccio in PMMA non lo toccherà. Assicurali che non sentiranno alcun dolore mentre il dispositivo tocca la loro palpebra, anche se sentiranno il contatto del cappuccio in PMMA. Chiedi loro di far sapere immediatamente al medico se avvertono dolore durante l'esame.
   4. Informare il paziente che deve mantenere lo sguardo fisso mentre il medico acquisisce le immagini del margine palpebrale per l'osservazione del Demodex. Chiedi al paziente di far sapere al medico se avverte affaticamento; Potranno sedersi e riposare per un po' prima di continuare l'esame. Saranno informati una volta terminato l'esame.
2. Seguire le istruzioni sulla confezione dell'anestetico topico e/o del gel per gli occhi per evitare controindicazioni ai farmaci. Chiedi al paziente se ha allergie per confermare che le allergie del paziente non sono controindicazioni dell'anestetico topico e/o del gel per gli occhi.
   NOTA: Reazioni allergiche all'anestetico topico e/o al gel per gli occhi possono verificarsi a seguito di allergie non identificate.
3. Applicare una goccia di Proparacaina cloridrato, un anestetico topico, sul margine della palpebra da esaminare.
   NOTA: Se si verifica una reazione allergica, sciacquare immediatamente con soluzione fisiologica.

3. Eseguire un esame

1. Osserva prima l'occhio destro. Spostare la telecamera di scansione a sinistra dal punto di vista dell'operatore. OD verrà selezionato automaticamente nella sezione Impostazioni dal riconoscimento destra-sinistra della telecamera.
2. Spostare la telecamera CCD verso sinistra. Ruotare l'obiettivo della telecamera CCD per regolare l'immagine della telecamera CCD (l'immagine di controllo) perpendicolarmente all'asse ottico della telecamera laser dello scanner.
3. Inizia un nuovo esame.
   1. Osservare la finestra di dialogo Dati esame e nella scheda Dati esame , selezionare Heidelberg Retina Tomograph-Cornea dall'elenco a discesa Dispositivo (File supplementare 1: Figura supplementare S2) e osservare la finestra di dialogo Impostazioni modulo cornea visualizzata.
   2. Selezionare FOV 400 dall'elenco a discesa Lente di campo e fare clic su OK per confermare (File supplementare 1: Figura supplementare S3).
   3. Attendi fino all'apertura della finestra di acquisizione ; Vengono visualizzate l'immagine dal vivo della telecamera laser a scansione e l'immagine di controllo. Se l'immagine di controllo non viene visualizzata, assicurarsi che il cavo della telecamera CCD sia collegato correttamente alla telecamera CCD, quindi riavviare la finestra di acquisizione.
4. Impostare i fattori nella finestra di acquisizione (File supplementare 1: Figura supplementare S4): selezionare 1x dall'elenco a discesa Fattore di zoom CCD per impostare la dimensione dell'immagine di controllo. Selezionare le caselle Luminosità automatica e Auto per controllare automaticamente la luminosità delle immagini dal vivo e controllarle. Tuttavia, se il controllo automatico della luminosità è disattivato, utilizzare il cursore per controllare la luminosità del controllo e le immagini dal vivo. Verificare che sia stato selezionato il tipo di scansione della sezione in modo che venga acquisita e memorizzata una singola immagine ogni volta che si preme l'interruttore a pedale.
5. Acquisire un'immagine di riferimento.
   1. Prima di iniziare un'acquisizione, disattivare il controllo automatico della luminosità e spostare il cursore verso sinistra per regolare la luminosità dell'immagine. Regolare il piano focale con il perno di regolazione in modo che il riflesso luminoso iniziale venga visualizzato nell'immagine dal vivo della telecamera laser a scansione dopo l'oscuramento, indicando la superficie anteriore del cappuccio in PMMA.
      NOTA: Il microscopio consente regolazioni focali di 10 μm.
   2. Fare clic su Ripristina nella sezione Posizione di messa a fuoco [μm] e attendere che il valore di Posizione di messa a fuoco [μm] diventi 0; L'immagine corrente è indicata come immagine di riferimento. Disattiva il ripristino automatico e seleziona la casella Luminosità automatica ; La luminosità dell'immagine dal vivo verrà controllata automaticamente.
   3. Se nella sezione Posizione di messa a fuoco [μm] vengono visualizzate linee tratteggiate al posto dei valori, o se i valori visualizzati non cambiano nonostante le regolazioni del piano focale, assicurarsi che il cavo della lente del microscopio sia collegato correttamente.
      NOTA: La posizione di messa a fuoco [μm] per la pachimetria visualizza la posizione del piano focale dell'immagine attualmente visualizzata in micron. Se il piano focale viene spostato successivamente, la posizione effettiva del piano focale viene calcolata rispetto alla posizione dell'immagine di riferimento.
6. Alzare o abbassare l'altezza del lettino da visita per il paziente. Posizionare il mento del paziente sulla mentoniera e la fronte contro il poggiafronte (Figura 3A, B). Regolare l'elevazione del mento tramite l'apposita vite di regolazione nera del dispositivo in modo che le palpebre superiori del paziente siano allineate con i segni rossi sulla colonna del poggiatesta.
7. Dire al paziente di guardare in basso davanti alla fonte di luce fissa del puntatore e di mantenere lo sguardo fisso (Figura 3A, B).
   NOTA: Il movimento degli occhi durante la raccolta delle immagini potrebbe causare una scarsa qualità dell'immagine e danni alla superficie oculare.
8. Usa un batuffolo di cotone per capovolgere la palpebra superiore, esponendo completamente la radice delle ciglia e il margine palpebrale. Posizionare il riflesso del raggio laser a livello della palpebra superiore del paziente ruotando la vite di regolazione del dispositivo. Spostare lentamente la telecamera laser a scansione verso il margine superiore della palpebra del paziente fino a toccare delicatamente il centro del cappuccio in PMMA verticalmente (Figura 3C). Se il paziente riferisce disagio, fare una pausa e controllare l'allineamento del tappo in PMMA.
   NOTA: Non esercitare troppa pressione sulla palpebra del paziente. Il contatto tra la calotta in PMMA e la palpebra del paziente a causa di un ponte in gel insufficiente, del movimento degli occhi e della testa del paziente e/o di un movimento troppo forte della telecamera dell'operatore potrebbe ferire la superficie oculare e la palpebra.
9. Scansiona attentamente la radice delle ciglia dal lato temporale verso il lato nasale del margine palpebrale con minuti movimenti orizzontali del margine palpebrale, consentendo la valutazione delle ciglia e dei loro follicoli. Scansiona e acquisisci immagini ruotando l'obiettivo del microscopio del dispositivo in senso orario o antiorario, modifica gradualmente il piano di messa a fuoco per osservare l'intero follicolo e la radice delle ciglia e prendi nota delle diverse profondità visualizzate nell'immagine dal vivo della fotocamera laser a scansione. Acquisisci immagini scansionando da sei a dieci follicoli piliferi delle ciglia per occhio, con campionamento distribuito nelle regioni temporale, media e nasale del margine palpebrale.
   NOTA: Se un piccolo riflesso viene visualizzato nell'immagine dal vivo della fotocamera laser a scansione e persiste quando si cambia la posizione del piano focale, ciò potrebbe indicare la presenza di bolle d'aria nel gel di contatto. Per risolvere questo problema, rinnovare il gel di contatto.
10. Salva le immagini manualmente e registra tutte le immagini sospette di acari Demodex premendo il pedale. Abilita il feedback audio del pedale per verificare la corretta acquisizione dell'immagine. Se non vengono visualizzate strutture palpebrali e nell'immagine dal vivo della telecamera laser a scansione sono visibili solo strati limite altamente riflettenti, ciò potrebbe indicare che il contatto tra la calotta in PMMA e il margine palpebrale del paziente è interrotto. Per risolvere questo problema, riallineare la telecamera fino a quando il cappuccio in PMMA tocca correttamente il margine palpebrale del paziente.
11. Se l'immagine dal vivo appare sfocata, distorta o non mostra la struttura del follicolo pilifero, questi problemi potrebbero indicare che il paziente sta muovendo la testa o sta sbattendo le palpebre. Ricorda al paziente di concentrarsi sulla luce di fissazione per ridurre al minimo il movimento. Se possibile, regolare la luminosità, il piano focale e la posizione di scansione per migliorare la qualità dell'immagine.
12. Se la telecamera laser a scansione deve essere regolata o il paziente avverte affaticamento o dolore, chiedere al paziente di sedersi, spostare indietro la telecamera laser a scansione e regolare nuovamente la fotocamera. Se il paziente continua a provare disagio durante l'esame e non mostra segni di sollievo dai sintomi dopo il riposo, interrompere e riprogrammare la procedura per garantire la sicurezza del paziente.
13. Se un paziente viene esaminato più volte durante il giorno, memorizzare tutte le immagini nella stessa scheda di esame nella finestra di visualizzazione delle immagini.
14. Esamina l'occhio sinistro, sposta la telecamera a destra dal punto di vista dell'operatore e attendi che il sistema operativo venga selezionato automaticamente. Rimuovere il cappuccio in PMMA dal dispositivo, inserire un nuovo cappuccio in PMMA sulla lente del microscopio del dispositivo e ripetere i passaggi precedenti.

Figura 3: Posizionamento del paziente. (A,B) Il paziente viene posizionato. (C) Il cappuccio viene regolato in modo da toccare la palpebra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Dopo l'esame

1. Abbandonare l'esame; Assicurarsi che le immagini dei follicoli delle ciglia siano memorizzate e che le immagini acquisite vengano visualizzate nella finestra di visualizzazione delle immagini. In caso contrario, l'acquisizione dell'immagine potrebbe non essere riuscita o i dati potrebbero non essere stati salvati. Innanzitutto, escludi potenziali malfunzionamenti dell'apparecchiatura, come problemi di connessione al software o guasto del pedale. Dopo la risoluzione dei problemi, spiegare la situazione al paziente e ripetere l'esame.
2. Chiedere al paziente di non strofinarsi gli occhi dopo l'esame fino a quando l'effetto dell'anestesia locale non è diminuito.
3. Rimuovere il tappo in PMMA dal dispositivo.
4. Pulire la lente del microscopio con salviette per la pulizia delle lenti.
5. Selezionare Ordina per tempo di acquisizione (veloce) nella finestra di dialogo Opzioni e osservare le immagini acquisite dei follicoli delle ciglia visualizzate in ordine dal lato temporale al nasale (File supplementare 1: Figura supplementare S5) - l'ordine di scansione della radice delle ciglia lungo il margine palpebrale. Rivedere tutte le immagini, selezionare le immagini di alta qualità per l'analisi (Figura 4) ed eliminare le immagini di bassa qualità. Chiedi a un osservatore di valutare le immagini per la presenza di acari e registrare il numero di follicoli ciglia con acari Demodex in totale per ciascun occhio.
   NOTA: Le immagini di alta qualità mostrano una chiara morfologia dell'acaro e la parte dell'acaro ripresa dovrebbe essere la più grande possibile, idealmente superiore a 100 μm. Se non sono disponibili immagini di alta qualità, è necessaria una valutazione indipendente da parte di un secondo osservatore. Se i risultati dei due osservatori sono incoerenti, un terzo osservatore deve pronunciarsi per risolvere la discrepanza e stabilire il risultato finale per l'inclusione nel rapporto.
6. Creare report inserendo l'immagine di alta qualità dal lato temporale a quello nasale nella lightbox per il report. Dai modelli di report e dai formati di conteggio degli acari (vedere File supplementare 2), selezionare un modello di report appropriato per descrivere i risultati in base ai risultati dell'esame.

Figura 4: Demodex all'interno del follicolo cigliare. (Immagini: 400 μm x 400 μm). (A)Tre acari Demodex sono osservati all'interno del follicolo (freccia gialla) e una singola ciglia è contrassegnata (freccia bianca). (B) Cinque acari Demodex sono osservati all'interno del follicolo (freccia gialla) e una singola ciglia è contrassegnata (freccia bianca). Poiché gli acari possono migrare attraverso diverse profondità, l'imaging su un singolo piano focale può catturare porzioni frammentate di singoli acari, risultando così in una rappresentazione morfologica incompleta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Spegnere il dispositivo dopo il lavoro ogni giorno

1. Dopo aver chiuso tutte le finestre di dialogo e le finestre, chiudere il software.
2. Spegnere il computer.
3. Spegnere il dispositivo spostando l'interruttore a bilanciere sul retro del dispositivo da I a O. Per prestazioni ottimali del sistema e sicurezza dei dati, spegnere prima il software e quindi spegnere il dispositivo.
   NOTA: Il dispositivo non deve essere tenuto acceso ininterrottamente per troppo tempo, soprattutto per più di un'intera giornata.
4. Mantenere regolarmente il gruppo di continuità (UPS) collegato all'apparecchiatura e garantirne il corretto funzionamento per evitare la perdita di dati o il malfunzionamento del dispositivo causato da improvvise interruzioni di corrente.
5. Esegui backup regolari, ad esempio utilizzando l'archiviazione NAS (Network-Attached Storage).

Risultati

Seguendo la SOP sopra descritta, abbiamo esaminato i pazienti con sospetto di infestazione da Demodex nel 2024. Inoltre, la Corte ha confrontato i dati del 2023 in cui tale SOP non era stata applicata. Come mostrato nella Figura 5, il numero di pazienti sottoposti all'IVCM per il rilevamento di Demodex nel 2024 è significativamente più alto rispetto all'anno precedente. Questa SOP consente l'esame di pazienti di diverse età, dai 4 anni ai 92 anni.

Discussione

L'ectoparassita Demodex è uno dei parassiti più comuni nell'uomo. Questi acari vivono nei follicoli delle ciglia, nelle ghiandole di Meibomio (MG) e nelle ghiandole sebacee e sono trasparenti, di forma allungata e misurano 0,15-0,4 mm di lunghezza¹⁷. L'IVCM eseguito utilizzando il dispositivo fornisce immagini in tempo reale di 400 μm x 400 μm con una risoluzione laterale di 1 μm/pixel e un ingrandimento di 800x. Attraverso IVCM, è possibile acquisire imm...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Gel oftalmico a base di carbomer, Vidisic	Bausch e Lomb, Berlino, Germania	8187195
Heidelberg Eye Explorer Software	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Germania	Versione 1.3.3.0
Tomografo Heidelberg Retina III	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Germania	HRT3-08398
Proparacaina cloridrato	Laboratori Alcon, Fort Worth, Texas, Stati Uniti	8387271
TomoCap	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Germania	18829	Tappo in PMMA