Articolo metodologico

Sintesi del 13C 2-retinile acetato e preparazione della dose per i test di diluizione dell'isotopo del retinolo

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DOI:

10.3791/68535

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22 agosto 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

In questo articolo

Sommario

L'acetato di retinile è solitamente marcato con due 13C quando la gascromatografia-combustione-rapporto isotopico viene utilizzata per l'analisi del siero e del latte materno. Questo articolo descrive la sintesi del 13C 2-retinile acetato e la preparazione di dosi per i test di diluizione dell'isotopo del retinolo da somministrare con una pipetta a spostamento positivo o una siringa di tubercolina.

Abstract

Il test di diluizione isotopica del retinolo (RID) è il metodo più sensibile per valutare lo stato della vitamina A stimando le riserve epatiche totali, considerate lo standard di riferimento. Per la rilevazione con spettrometria di massa del rapporto gascromatografia-combustione-isotopico, 13C viene aggiunto alla frazione retinolo. La procedura sintetica per il 13C-retinile acetato inizia con il β-ionone presente in natura. In breve, il C18-tetraene chetone viene sintetizzato dal β-ionone e purificato. Se si desidera un acetato di 13C 4-retinile, il carbanione del trietilfosfonoacetato marcato con 13C2 può essere utilizzato per aggiungere due 13C alla porzione β-ionone prima di aggiungere i tre atomi di carbonio dell'acetone per sintetizzare il chetone C18-tetraene. Se si desidera un acetato di 3-retinile 13C, i tre atomi di carbonio dell'acetone potrebbero essere marcati con 13C.

Per l'acetato di 13C 2-retinile più comunemente usato per future analisi mediante spettrometria di massa del rapporto isotopico gas-cromatografia-combustione, viene utilizzata una procedura di Wittig-Horner modificata e il chetone tetraene C18 non marcato viene fatto reagire con il carbanione del trietilfosfonoacetato marcato con 13C2 per aggiungere due-13C alle posizioni 14 e 15 della molecola di retinolo. L'estere etilico risultante viene ridotto ad alcol ed esterificato a 13C 2-retinile acetato con anidride acetica. L'isomero all-trans viene purificato con allumina deattivata in acqua all'8% utilizzando solventi relativamente innocui e altamente volatili - esani ed etere etilico - che vengono rimossi mediante evaporazione rotativa e sonificazione di dosi di olio. Il prodotto è caratterizzato da spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), cromatografia su strato sottile (TLC) e cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) rispetto agli standard analitici. La dose concentrata viene conservata disciolta in olio di soia a -80 °C. Le dosi finali vengono diluite in olio di soia (~200 μL/dose) e quantificate mediante spettroscopia UV-Vis rispetto all'olio di soia veicolo. Le dosi vengono misurate per la somministrazione all'uomo con una pipetta a spostamento positivo o siringhe di tubercolina per il test RID. Utilizzando ipotesi appropriate, vengono calcolate le riserve corporee totali e vengono stimate le riserve epatiche totali.

Introduzione

La diluizione isotopica del retinolo (RID) è l'unico biomarcatore dello stato della vitamina A che misura le riserve totali di vitamina A (TBS) del corpo in modo quantitativo e, con ipotesi appropriate, può stimare le riserve epatiche totali (TLR). È il modo più delicato per misurare lo stato della vitamina A e l'impatto degli interventi contenenti retinolo preformato o carotenoidi provitamina A. Sebbene tecnicamente impegnativa, la RID è accurata e minimamente invasiva perché richiede solo campioni di sangue rispetto alle biopsie epatiche1. Il test RID prevede la somministrazione di acetato di retinile deuterato o marcato con 13C, a seconda della piattaforma dello spettrometro di massa. Prima della somministrazione della dose, viene raccolto un campione di sangue di base, che è essenziale quando si utilizzano 13C-label, ma può essere eseguito su un sottogruppo selezionato in modo casuale. Un secondo campione viene raccolto dopo che l'acetato di retinile marcato con 13C è stato miscelato con TBS1.

Gli interventi di vitamina A per prevenire la carenza includono la fortificazione alimentare, la biofortificazione, la diversificazione della dieta e l'integrazione. Tuttavia, in alcuni paesi, ci sono stati interventi sovrapposti rivolti alle stesse persone, che hanno portato all'ipervitaminosi A2, richiedendo quindi un quadro di monitoraggio per valutare i risultati del programma. Pertanto, sono necessari metodi che misurino quantitativamente lo stato della vitamina A. In collaborazione con gli Stati membri, l'Agenzia internazionale per l'energia atomica (AIEA) promuove l'uso pacifico degli isotopi nella ricerca e nelle valutazioni, il che supporta l'applicazione del test RID. Il test RID sta guadagnando slancio e potrebbe presto essere utilizzato in indagini su larga scala per valutare lo stato della vitamina A da carenza a eccesso nei paesi che implementano interventi di vitamina A3.

In precedenza, l'acetato di 10,11,14,15-13 C 4-retinile è stato sintetizzato utilizzando le modifiche di Bergen et al. per l'acetato di retinile deuterato 4,5. Questo composto è stato utilizzato in esperimenti sul ratto6 e sull'uomo con spettrometria di massa con gascromatografia-combustione-rapporto isotopico (GCCIRMS) adattato per l'analisi7. Da questi preziosi esperimenti, abbiamo determinato che GCCIRMS era così sensibile che non erano necessarie quattro 13C per il test RID utilizzando GCCIRMS. Pertanto, il costo del tracciante è ridotto utilizzando solo due 13C nelle posizioni 14 e 15 della molecola di retinolo (Figura 1). Questa modifica riduce i costi associati alla sintesi e porta a un aumento delle rese grazie alla via sintetica. In questo articolo, viene descritto un protocollo su larga scala per la sua sintesi.

GCCIRMS è più sensibile di altri tipi di spettrometria di massa per la misurazione degli isotopi stabili8 e può rispondere ai cambiamenti nella dieta e ai cambiamenti naturali di arricchimento di C 13nel retinolo sierico. Questo è stato descritto nei gerbilli9 e negli esseri umani10che consumavano mais, e negli esseri umani arruolati in un intervento vegetale11. Infatti, l'abbondanza naturale di 13C varia tra le diverse popolazioni e deve essere determinata nei soggetti arruolati nelle valutazioni RID12. Tuttavia, piccoli sottogruppi sono stati utilizzati per la misurazione dell'arricchimento naturale con il RID nei bambini ghanesi e thailandesi13,14 e nelle donne thailandesi15. L'arricchimento individuale di 13C al basale deve essere determinato per la determinazione più accurata della TBS al livello individuale12.

Protocollo

NOTA: Quando si arruolano soggetti umani per ricerche, interventi o studi valutativi, l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) deve essere perseguita con adeguate procedure di consenso informato.

1. Sintesi di 13C2 -acetato di retinile (Figura 2)

NOTA: Tutte le procedure sintetiche e la quantificazione vengono eseguite sotto l'illuminazione fluorescente dell'oro per prevenire la degradazione e l'isomerizzazione del composto.

  1. Sintetizzare l'acetato di β-ionile in un grande lotto a partire da β-ionone disponibile in commercio. Ad esempio, coprire l'idruro di sodio (NaH) (4 g, 0,16 mole) con 100 ml di etere. Aggiungere trietilfosfonoacetato non marcato (36 g, 0,16 mole) in 100 mL di etere goccia per goccia e agitare per 2 ore. H2 viene rilasciato e la sospensione iniziale diventa limpida e ambrata.
    ATTENZIONE: L'idruro di sodio (NaH) è un forte agente riducente utile in un'ampia gamma di reazioni chimiche. Tuttavia, gli incendi di laboratorio possono verificarsi a causa della sua reazione altamente esotermica con l'acqua nell'atmosfera16,17. Si consiglia di accedere a una scheda di dati di sicurezza; sono state pubblicate ulteriori linee guida per la manipolazione di solidi moderatamente piroforici come il NaH18. Tenerlo sospeso in olio o solvente non reattivo durante la manipolazione, il lavaggio dei recipienti di reazione e i contenitori di stoccaggio con gas inerte (come azoto o argon), il raffreddamento del recipiente di reazione e la conservazione in contenitori sigillati conservati in un ambiente asciutto. Nel nostro laboratorio, il NaH viene trasferito in piccole quantità (~1 g) in un ambiente di azoto in fiale e quindi conservato in un essiccatore sigillato fino al momento dell'uso.
  2. Aggiungere β-ionone (21 g, 0,12 mole) in 40 mL di etere e reagire per una notte (~15 h a 20 °C). Il giorno 2, spegnere la reazione con acqua ed estrarre l'acetato di etil-β-ionilidene in esani e lavare ripetutamente con acqua in una serie di imbuti separatori per massimizzare il recupero. Essiccare lo strato organico (MgSO4 anidro), filtrare e concentrare
    NOTA: La cromatografia su strato sottile (TLC) di solito rileva solo impurità minori in questa fase della sintesi. Questo può essere conservato per un periodo prolungato a -80 °C prima di procedere con i passaggi successivi.
  3. Far reagire l'acetato di etil-β-ionilidene (28 g, 0,11 mole) con 120 mL di idruro di litio alluminio molare (LiAlH4) in etere etilico. Immergere il recipiente di reazione in un bagno di acetone con ghiaccio secco e mescolare continuamente la soluzione per ottenere β-ionilidene etanolo.
    ATTENZIONE: L'idruro di litio e alluminio (LiAlH4) è un forte agente riducente. Accedere a una scheda di sicurezza e fare riferimento a linee guida aggiuntive per la manipolazione di solidi moderatamente piroforici come LiAlH418,19. L'obiettivo principale della maggior parte delle precauzioni di sicurezza è ridurre al minimo il rischio di esposizione di LiAlH4 all'atmosfera e prevenire reazioni incontrollate. Ciò comporta generalmente il mantenimento di questi composti sospesi in olio o solvente non reattivo durante la manipolazione, il lavaggio dei recipienti di reazione e i contenitori di stoccaggio con gas inerte (come azoto o argon), il raffreddamento del recipiente di reazione e lo stoccaggio di LiAlH4 in contenitori sigillati conservati in un ambiente asciutto. Nel nostro laboratorio, l'idruro di litio e alluminio viene acquistato in flaconi sigillati da 1 molare invece della forma in polvere, con i volumi necessari rimossi con una siringa e l'atmosfera del flacone sostituita con azoto.
  4. Sciogliere 28 g (0,12 mole) di β-ionilidene etanolo in 300 ml di esani. Aggiungere circa 50 g al giorno di MnO2 al 90% per 3 giorni (51 g, 52 g e 54 g) e mescolare la miscela di reazione per più tempo (spesso 2 giorni a 20 °C). Infine, aggiungere 35 g di MnO2 e lasciare agire per una notte di circa 15 ore; La reazione è completa per circa il 90%. Filtrare e lavare la β-ionilidene acetaldeide dal MnO2 con diclorometano.
  5. Sciogliere la β-ionilidene acetaldeide grezza (22 g, 0,10 mole) in 150 mL di acetone agitando costantemente e aggiungere 10 mL di idrossido di sodio 1 N per goccia. Lasciare la reazione per 6 ore.
  6. Estrarre il tetraene chetone C18 con esani e lavare ripetutamente con acqua utilizzando una serie di imbuti separatori per massimizzare il recupero. Essiccare la soluzione risultante con un evaporatore rotante per ottenere cis-trans C18 tetraene chetone grezzo. Poiché l'isomero trans è più desiderabile per gli studi sull'uomo, purificare la miscela su gel di silice deattivato con acqua al 4% (300 g) utilizzando un gradiente lento di acetato di etile allo 0-10% in esano.
  7. Mescolare NaH (1,2 g, 0,05 mole) con 50 mL di etere. Aggiungere 13C 2-trietilfosfonoacetato (11 g, 0,049 mole) disciolto in 50 mL di etere goccia a goccia e agitare per 2 ore. Sciogliere C18 tetraene chetone (12 g, 0,044 mole) in 50 mL di etere e reagire per una notte per circa 15 ore a 20 °C.
  8. Spegnere la reazione con acqua ed estrarre l'estere etilico dell'acido 14,15-13 C 2-retinoico con esani e lavare con acqua in un imbuto separatore. Essiccare lo strato organico con MgSO4 anidro e concentrare; Purificare con allumina neutra disattivata all'8% in acqua (400 g) con un etere etilico lento da 0 a 3% in gradiente di esano per ottenere isomeri cis/trans.
    NOTA: Spesso, la prima purificazione contiene contaminanti come giudicato da TLC. I contaminanti vengono visualizzati facendo reagire la piastra TLC con vapore di iodio. Quando sono presenti contaminanti, è fondamentale ripurificare su 400 g di allumina neutra disattivata all'8% con esani al 100% per ottenere un estere etilico puro di acido 14,15-13 C 2-retinoico.
  9. Ridurre 14,15-13C 2-retinoico acido etil estere (3,7 g) con 15 mL di 1 molare di litio alluminio idruro in un bagno di acetone con ghiaccio secco mescolando per ottenere 14,15-13 C2-retinolo (Figura 1).
  10. Sciogliere 14,15-13 C 2-retinolo (3,5 g) in 20 mL di trietilammina. Mescolando la soluzione, mescolare 3,5 mL di anidride acetica con 7 mL di trietilammina e aggiungere goccia a goccia al pallone. Lasciare il matraccio per una notte in frigorifero per la formazione del 14,15-13 C 2-retinile acetato (circa 15 h).
  11. Estrarre 3,9 g di acetato grezzo di 14,15-13 C 2-retinile in esani, essiccare, concentrare e purificare su 500 g di allumina neutra deattivata all'8% con un etere etilico lento 0-3% in gradiente di esano. Monitora le frazioni con uno spettrofotometro ultravioletto visibile (UV-Vis) a 325 nm. Rimuovere tutti i solventi rimanenti con un rotoevaporatore. Valutare il prodotto finale con HPLC e rilevamento a fotodiodo per determinare il rapporto cis/trans. Un esempio di un sistema avanzato a gradiente per separare il profilo cis/trans utilizzando la cromatografia liquida ad ultrapressione è disponibile nella Figura S1 supplementare.
    NOTA: Il rapporto cis/trans è solitamente del >95% all-trans in questa fase.
  12. Per la conservazione, sciogliere l'acetato all-trans 14,15-13 C 2-retinile in olio di soia alimentare senza altri additivi e conservare in vetro ambrato lavato con azoto a -80 °C ed etichettare come pasta concentrata.

2. Preparazione della dose di soluzioni oleose di acetato di retinile marcato con isotopi stabili

NOTA: L'acetato di retinile marcato isotopicamente è stato somministrato in capsule20 o in soluzioni oleose fornite con una pipetta a spostamento positivo da 250 μl21 o una siringa medica22 (Figura 3). Abbiamo testato la stabilità delle capsule (Figura 4), descritta di seguito.

  1. Subito dopo la sintesi, sciogliere l'acetato di retinile marcato in ~15 ml di olio vegetale non fortificato (ad esempio, olio di soia alimentare) prima che inizi a cristallizzare e conservarlo in una fiala ambrata da 24 ml a -30-80 °C fino al momento di preparare le dosi finali.
    1. Se è stato acquistato l'acetato di retinile etichettato, staccare con cautela la parte superiore della fiala sigillata sottovuoto incidendo con una lima o rompere il sigillo su un flacone con tappo a vite. A seconda della massa necessaria, mettere una quantità pesata in una bottiglia ambrata marrone da 24 ml e aggiungere una piccola quantità di olio vegetale (10 ml saranno probabilmente sufficienti). Sonicare la miscela fino a quando non diventa una soluzione limpida.
  2. Stimare la quantità di olio finale necessaria moltiplicando il numero di soggetti per 200 μL. Ad esempio, se devono essere arruolati 60 soggetti, preparare circa 70 dosi per avere abbastanza per lo spreco (circa il 10-20%). Pertanto, 70 × 200 μL sono 14 mL.
    NOTA: Non fare affidamento sulla massa dell'olio sintetico o dei cristalli. È necessario utilizzare uno spettrofotometro per quantificare le dosi. Tutta la vitamina A sintetica contiene solventi residui. Questi possono essere dissipati per sonificazione o sotto un leggero flusso di azoto, ma sono la ragione principale per cui la massa da sola non può essere utilizzata per determinare le dosi degli isotopi.
    Se le soluzioni di acetato di retinile marcate vengono conservate per molto tempo nel congelatore senza essere utilizzate, devono essere rianalizzate per determinare se si è verificata una degradazione sostanziale.
  3. Per quantificare l'acetato di retinile:
    1. Accendere lo spettrofotometro UV-Vis (preferibilmente uno spettrofotometro a scansione a doppio raggio) e il computer collegato, se applicabile. Avviare lo spettrofotometro UV-Vis seguendo le istruzioni del produttore. Lasciare che lo spettrofotometro si riscaldi per almeno 30 minuti prima della lettura.
    2. Installare due matracci e tappi volumetrici da 25 mL e riempire ciascuno con 25 mL di esano quasi fino alla linea. Etichettare una fiaschetta "Olio" o "Bianco" e l'altra "Vitamina A" o "Dose"; quindi, mettere da parte la fiaschetta di vitamina A fino a quando gli spazi vuoti non sono stati eseguiti.
    3. Versare un po' di olio di soia puro in un bicchiere di plastica usa e getta e aggiungere 20-40 μl al pallone dell'olio per svuotare il sistema.
      NOTA: Usiamo spesso 20 μl, ma finché il bianco e il volume di dose dell'isotopo sono gli stessi, si può usare di più.
    4. Capovolgere 4-5 volte per mescolare l'olio e gli esani, quindi sciacquare entrambe le cuvette di quarzo dello spettrofotometro con questa soluzione e riempirle entrambe ~75%.
    5. Inserire entrambe le cuvette nello spettrofotometro, facendo attenzione a non toccare la parte anteriore e posteriore trasparenti (maneggiare solo per i lati smerigliati). Per una precisione ottimale, rivolgere la parte anteriore numerata di ciascuna cuvetta abbinata verso l'utente.
    6. Chiudere lo sportello di blocco della luce sopra i campioni.
    7. Fare clic sulla funzione Blank o Baseline e consentire al sistema di misurare l'assorbanza di base di olio ed esani. Questo corregge l'assorbimento della soluzione di esani Oil Blank. Scansione da 260 a 400 nm; Verificare che la lettura sia "zero" a 400 nm al termine di questo processo. In caso contrario, premi il pulsante zero ed esegui nuovamente la scansione. Una volta completato, il sistema è pronto per misurare l'assorbanza della dose di acetato di retinile.
    8. Eliminare il contenuto della cuvetta del campione e riempirla con la soluzione di esani dosati. Posizionare il campione nel punto appropriato e scansionare gli spettri. Seleziona il picco e leggi l'assorbanza. L'acetato di retinile puro ha solo un massimo di lambda a 325 nm.
      NOTA: Se si ha più di un picco o se ne ha uno a 280 nm, l'acetato di retinile si è degradato e non deve essere utilizzato per il dosaggio.
  4. Calcoli per il passaggio 2.3
    NOTA: L'E 1%, 1 cm per il retinolo è 1.810 a 325 nm in esani. Quantificherai l'acetato di retinile in equivalenti di retinolo.
    1. Dividere l'assorbanza per 0,181 per ottenere i μg/mL di soluzione.
    2. Moltiplicare per 25 mL per ottenere il μg in 20 microlitri di soluzione oleosa.
      NOTA: Esempio: l'assorbanza di 20 μL di olio in 25 mL di esani è 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 μg/mL × 25 mL = 40,75 μg in 20 μL di olio
      Se hai bisogno di 286 μg per la dose, sono 140,4 μl. Si tratta di 1 μmole, ma 288 μg di 13C 2-retinolo saranno prodotti nell'intestino a causa dell'etichetta. Potresti voler fare una diluizione per avvicinarti alla quantità di dose di 200 μL e ripetere la quantificazione di cui sopra.
  5. Preparazione delle capsule per testare la stabilità
    1. Separare le capsule nel fondo bianco più grande e nei tappi blu più piccoli.
    2. Posizionare il fondo delle capsule bianche nelle scatole dei puntali per pipetta (96 capsule per scatola) e chiuderle per evitare che la polvere penetri nelle capsule e mettere i tappi blu in un sacchetto di plastica con cerniera durante la notte. Scartare le capsule incrinate.
    3. Lasciare che la soluzione di olio di acetato di retinile raggiunga la temperatura ambiente. Versare una piccola quantità (~5 ml) in un bicchierino di plastica non utilizzato.
    4. Preparare una pipetta a ripetizione caricando la siringa da 5 ml (dove 1 = 100 μl) e impostandola su "2" per erogare 200 μl per ogni pressione del grilletto.
    5. Caricare l'olio di acetato di retinile nella pipetta a ripetizione sollevando il braccio di caricamento. Erogare almeno 4 aliquote da 200 μL nella tazza per eliminare le bolle d'aria dal puntale.
    6. Erogare 1 aliquota da 200 μl per il fondo della capsula bianca toccando leggermente la punta della pipetta con la parete interna della capsula e premendo il grilletto.
    7. Una volta che la pipetta a ripetizione è quasi vuota, aspirare altro olio.
    8. Dopo aver completato un intero set di 96 capsule, erogare nuovamente l'olio nella tazza e poi iniziare a far scorrere leggermente i tappi blu su ciascun fondo bianco, facendo attenzione a non rompere i tappi.
    9. Dopo che tutti i tappi sono sulle capsule, sollevare ogni capsula, assicurarsi leggermente che il tappo sia ben fissato, quindi riposizionarlo nella scatola dei puntali.
    10. Conservare le capsule alle temperature e alle condizioni prescelte. L'oscurità può essere ottenuta conservando le capsule in rastrelliere sotto un foglio di alluminio. Di seguito sono riportati alcuni esempi:
      un.  in congelatore: -20 °C al buio
      b.  in frigorifero: 4 °C al buio
      c. sul banco: 20 °C (temperatura ambiente) al buio
      d. sul banco ma lasciato fuori: 20 °C (temperatura ambiente) esposto a una normale illuminazione fluorescente
      e.  in forno, replicando temperature ambiente più elevate in altri luoghi: 37 °C al buio

3. Somministrazione della dose

NOTA: La pipetta a spostamento positivo è stata confrontata direttamente con le siringhe di tubercolina per determinare l'accuratezza e la precisione tra i tecnici (Figura 5).

Le dosi vengono somministrate utilizzando pipette a spostamento positivo Rainin da 250 μL o siringhe di tubercolina da 1 mL.

  1. Scongelare le dosi congelate o metterle in un frigorifero con impacchi di ghiaccio se si va sul campo. Durante il trasporto, le dosi di solito si scongelano.
  2. Rimuovere la fiala di vetro ambrato dal frigorifero e aprirla. Conservare la fiala in una "tazza" o in un bicchiere per evitare che si ribalti.
  3. Inserire la punta della pipetta o la siringa della tubercolina nell'olio e aspirare una piccola quantità. Premere rapidamente lo stantuffo per spostare eventuali bolle che potrebbero essersi formate. Aspirare lentamente la quantità di volume necessaria nella pipetta o nella siringa. Assicurati che non ci siano bolle.
  4. Pulisci l'esterno della punta con un fazzoletto. Non toccare l'estremità del puntale della pipetta o della siringa perché questo estrarrà il liquido.
  5. Metti la punta in bocca al partecipante, rilascia l'olio in bocca e istruisci la persona a chiudere la bocca e deglutire.
    NOTA: È utile se i partecipanti possono inclinare leggermente la testa all'indietro per il dosaggio.
  6. Dopo la dose, somministrare un "chaser" o uno spuntino grasso che fornisca almeno 10 g di grassi. Per i bambini piccoli, somministrare 1 ml di olio non fortificato consegnato su un cucchiaio di plastica come cacciatore. Per i bambini più grandi e gli adulti, mezzo panino al burro di arachidi, patate bianche fritte o una baguette con crema spalmabile al cioccolato sono buoni spuntini di follow-up.
    NOTA: Dovrebbe essere condotta una ricerca informativa per determinare quale spuntino è accettabile a livello locale.

Risultati

A partire dal β-ionone disponibile in commercio, sono stati sintetizzati 28 g di acetato di etil-β-ionilidene. Dopo la riduzione, 22 g di β-ionilidene acetaldeide sono stati fatti reagire con acetone in condizioni basiche per produrre C18-tetraene chetone; Sono stati ottenuti 12 g di C18-tetraene chetone purificato, che era ~90% all-trans. Questo è stato successivamente fatto reagire con il carbanione di 13C 2-trietilfosfonoacetato utilizzando una procedura di Wittig-Horner modificata per aggiungere due 13C nelle posizioni 14, 15 della molecola di retinolo. L'estere etilico risultante (resa di 3,7 g) è stato ridotto all'alcol ed esterificato a 13C 2-retinile acetato con anidride acetica disciolta in trietilammina. La vitamina sintetica è stata purificata con allumina deattivata con acqua all'8% utilizzando solventi organici altamente volatili: esani ed etere etilico. La preparazione risultante è stata caratterizzata utilizzando spettroscopia UV-Vis, TLC e HPLC. Per la conservazione a lungo termine, l'acetato di retinile marcato viene conservato disciolto in olio di soia a -80 °C.

Lo schema sintetico di successo per l'acetato di 14,15-13 C 2-retinile descritto sopra è illustrato nella Figura 2. Il percorso totale che inizia con β-ionone è composto da sette fasi. La prima resa è stata di 0,9 g di acetato all-trans 14,15-13 C 2-retinile. Le frazioni di isomeri cis/trans (1,2 g) sono state combinate e ripurificate su 300 g di allumina neutra deattivata in acqua all'8% per ottenere ulteriori 0,3 g di acetato di 2-retinile all-trans 14,15-13 C.

Per determinare la stabilità dell'acetato di retinile nelle capsule, l'acetato di retinile (1 g) è stato disciolto in esani e purificato mediante cromatografia a colonna aperta utilizzando 300 g di allumina disattivata in acqua all'8% con esani come solvente. L'acetato di retinile è stato monitorato mediante spettroscopia TLC e UV-Vis e sono state utilizzate solo le frazioni pure. Questo processo è identico a quello utilizzato nella sintesi e purificazione dell'acetato di 13C 2-retinile nel laboratorio Tanumihardjo per il test RID come descritto sopra. L'acetato di retinile purificato è stato disciolto in olio di soia, il solvente organico rimosso dall'evaporatore rotante e altro olio è stato aggiunto fino a una concentrazione finale di 7,5 μM (per produrre 1,5 μmole per 200 μL, il punto medio tra la dose per un adulto e un bambino per il test RID quando GCCIRMS viene utilizzato per l'analisi). La concentrazione è stata determinata mediante spettroscopia UV-Vis come descritto sopra.

Un'aliquota di 200 μl di olio è stata distribuita in capsule di cellulosa di dimensioni 3 (volume massimo 300 μl) per lo studio di stabilità. Le capsule di ogni dose sono state conservate in cinque condizioni. L'oscurità è stata ottenuta conservando le capsule in rastrelliere sotto un foglio di alluminio. Per ogni condizione sono state preparate capsule (150) per un totale di 750 capsule: i) in congelatore: -20 °C al buio; ii) in frigorifero: 4 °C al buio; iii) sul banco: 20 °C (temperatura ambiente) al buio; iv) sul banco ma lasciato fuori: 20 °C (temperatura ambiente) esposto a luce fluorescente standard; v) in forno, replicando temperature ambiente più elevate in altri luoghi: 37 °C al buio.

Nello studio sulla stabilità della capsula, sono state misurate tre capsule di ciascuna condizione in ogni punto temporale (-20 °C, 4 °C, buio a temperatura ambiente, luce a temperatura ambiente, 37 °C). Tutte le capsule sono state lasciate a temperatura ambiente (le capsule a temperatura ambiente sono state analizzate per prime); La variazione di temperatura provoca una variazione dell'assorbanza. Le capsule sono state misurate a 480 giorni. Le capsule sono rimaste stabili per nove mesi a -20 °C e 4 °C (Figura 4).

È stato condotto un confronto tra i metodi per confrontare le siringhe monouso di tubercolina con le pipette a spostamento positivo Rainin come standard di riferimento. La pipetta volumetrica Rainin è stata calibrata con acqua, tenendo conto della temperatura e della pressione locali, e quindi testata con tre puntali in triplicato per determinare il volume di olio target erogato con l'impostazione di 200 μl su una pesa tarata. Il protocollo di erogazione è stato condotto da 10 tecnici di livello di esperienza. Per ogni tecnico, otto siringhe sono state testate in triplicato e confrontate con la pipetta di riferimento. I lati della pipetta sono stati puliti con un fazzoletto e l'olio è stato erogato nella navicella di pesatura ad angolo, garantendo il massimo rilascio dell'olio. I tecnici erano all'oscuro dei risultati della massa erogata durante tutto il protocollo; La massa d'olio è stata registrata da un tecnico separato. Il processo è stato ripetuto con 200 μL di olio di soia utilizzando otto siringhe di tubercolina (ad esempio, Norm-Ject).

Il software statistico R è stato utilizzato per adattare un modello di componenti di varianza (FitVCA)22 (Figura 5). I fattori di variabilità misurati includevano tecnico, siringa all'interno del tecnico ed errore di replica. Il valore medio (IC 95%) della somministrazione della siringa rispetto al volume di erogazione della pipetta è stato di 0,996 (0,912, 1,08). La varianza da errore replicato rappresentava il 64,8% della varianza totale, indicando che la maggiore fonte di variabilità proveniva da misurazioni ripetute all'interno della stessa siringa. La varianza percentuale tra tecnico e siringa all'interno del tecnico è stata molto più bassa, contribuendo rispettivamente al 22,9% e al 12,3%.

L'analisi dei sottogruppi è stata eseguita suddividendo i tecnici in due gruppi (n = 5/gruppo) in base all'esperienza. La somministrazione media normalizzata della siringa era simile tra i due gruppi, ma l'IC del 95% era più stretto per i tecnici con più esperienza; 1,001 (0,939, 1,063) e 0,998 (0,900, 1,100), rispettivamente. Tra i tecnici più esperti, la maggior parte della varianza proveniva dalla siringa all'interno del tecnico (57,0%) e dall'errore di replica (42,9%), mentre per i tecnici meno esperti, la maggior parte della varianza proveniva dal tecnico (32,7%) e dall'errore di replica (67,2%).

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Figura 1: La struttura del retinolo con i carboni numerati. Le 13C vengono solitamente aggiunte nelle posizioni 14 e 15 per l'uso con la gascromatografia-spettrometria di massa a combustione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Lo schema sintetico dell'acetato di 14,15-13 C 2-retinile utilizzato nei test di diluizione degli isotopi del retinolo quando la spettrometria di massa del rapporto gascromatografia-combustione-isotopi viene utilizzata per l'analisi del siero o del latte materno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Una siringa di tubercolina da 1 mL senza volume morto sulla punta e la pipetta a spostamento positivo da 250 μL utilizzata per il dosaggio negli studi con tracciante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Curve di degradazione dell'acetato di retinile conservato in capsule in cinque diverse condizioni. Le condizioni sono -20 °C, 4 °C, 20 °C (temperatura ambiente) al buio, 20 °C (temperatura ambiente) con luce fluorescente standard e 37 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi della componente della varianza della quantità di erogazione della dose confrontando siringhe di tubercolina da 1 ml con una pipetta a spostamento positivo da 250 μl tra 10 tecnici all'oscuro dei risultati durante la valutazione. I valori sono la massa d'olio erogata (200 μL) dalle siringhe normalizzata alla pipetta a spostamento positivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1 supplementare: Un esempio del controllo finale della purezza dell'acetato di retinile 14,15-13C mediante cromatografia liquida ad ultrapressione. Gli spettri corrispondenti sono caratteristici delle forme cis/trans della vitamina. Le condizioni UPLC erano il solvente A 70:25:5 (acetonitrile:acqua:isopropanolo) con 10 mM di acetato di ammonio e il solvente B era il 75% di acetonitrile e il 25% di isopropanolo. La colonna utilizzata era una colonna Acquity UPLC, BEH C18 da 1,7 μM, 2,1 x 100 mm. La colonna è stata impostata a 29 °C e la velocità di flusso è stata di 0,4 mL/min. Il gradiente è iniziato con il 100% di solvente A e si è mantenuto per 5,0 minuti, seguito da una transizione al 98% di solvente B entro 7 minuti e si è mantenuto per 8 minuti prima di tornare al 100% di solvente A in 1 minuto e di essere mantenuto per 4 minuti di equilibrio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Mentre ci sono fonti commerciali di acetato di retinile deuterato e 13marcato con C, ci sono più percorsi sintetici per il retinolo in letteratura per chimici organici qualificati. Abbiamo scelto un percorso sintetico da seguire per l'acetato di retinile deuterato e abbiamo apportato le opportune regolazioni per aggiungere 13C alla spina dorsale della porzione di retinolo, descritte sopra. La sintesi del 14,15-13 C 2-retinile acetato è stata realizzata utilizzando una procedura in sette fasi a partire dal β-ionone disponibile in commercio. β-ionone è un componente vegetale presente in natura e contribuisce alle fragranze, come quelle delle rose. Il passaggio più cruciale nella via sintetica è la formazione del chetone tetraene C18. Questo composto intermedio deve essere puro almeno al 90% affinché le fasi successive producano buone rese.

La marcatura è stata eseguita utilizzando una procedura di Wittig-Homer modificata con 13C 2-trietilfosfonoacetato disponibile in commercio. I composti marcati vengono utilizzati nel test RID per determinare la TBS e stimare la TLR. Il metodo utilizza GCCIRMS per l'analisi del retinolo purificato dal siero o dal latte materno di individui a cui sono stati somministrati livelli fisiologici dei composti marcati. Le dosi più comuni sono 1 μmole per i bambini e 2 μmole per gli adulti. Mentre l'analisi GCCIRMS è sensibile per l'arricchimento isotopico, l'analisi del siero richiede un minimo di 400 μL di siero per ottenere una massa di retinolo sufficiente per l'introduzione nel GC.

Il test C-RID 13è stato utilizzato in studi clinici23,24 e in gruppi di bambini africani25 con piani futuri per renderlo accessibile al lavoro basato sulla popolazione. Abbiamo eseguito gli esperimenti con capsule e siringhe per indagare se queste modifiche sono adatte al lavoro sulla popolazione. Le capsule dovevano essere in posizione verticale o perdevano; Abbiamo rapidamente scartato l'idea che potessero essere conservati in normali flaconi di pillole ambrate per l'uso sul campo. Le capsule sono rimaste stabili solo per ~9 mesi a temperature di frigorifero e congelatore. La produzione di capsule sigillate può migliorare la stabilità riducendo la minore esposizione all'atmosfera durante la conservazione. L'uso delle capsule deve essere testato e convalidato da gruppi di utenti prima dell'implementazione.

Le soluzioni oleose finali sono stabili a temperatura ambiente per ~2 mesi, ma una volta che iniziano a degradarsi, la degradazione continua rapidamente. Non esiste un'attività parziale accettabile per i test RID poiché la quantità dosata viene utilizzata nel calcolo della TBS. È meglio conservare le soluzioni sugli impacchi di ghiaccio sul campo durante l'uso e ricongelarle il prima possibile dopo il completamento del dosaggio. È meglio portare solo poche dosi in più del necessario per la giornata e mantenere il resto congelato. Il congelamento e lo scongelamento non influiscono su queste soluzioni perché l'olio stesso contiene antiossidanti. Le soluzioni oleose sono più robuste dei campioni di sangue, ma devono comunque essere tenute sempre al buio e congelate quando non vengono utilizzate.

Le dosi vengono somministrate utilizzando pipette a spostamento positivo Rainin da 250 μL o siringhe di tubercolina da 1 mL. Le pipette a spostamento d'aria non sono adatte per dosi disciolte in olio. Il nostro laboratorio ha confrontato sperimentalmente questi due metodi (vedi Risultati rappresentativi). La somministrazione con la pipetta o la siringa è simile con alcune deviazioni. Le pipette a spostamento positivo Rainin sono consigliate per la ricerca o gli studi clinici, ma le siringhe possono essere utilizzate per lavori basati sulla popolazione. Si consigliano siringhe con poco volume morto nella punta per massimizzare la precisione della dose (ad es. Norm-Ject).

I calcoli per il test RID includono la quantità di dose somministrata e l'errore nella quantità di dose somministrata è proporzionale all'errore nella stima risultante della TBS. Per l'uso di siringhe di tubercolina rispetto alle pipette a spostamento positivo, la somministrazione media normalizzata della siringa era vicina a 1, indicando che le siringhe possono fornire un'erogazione accurata della dose per gli studi di popolazione. I limiti di confidenza del 95% erano circa ±8% della dose target erogata. I tecnici con più esperienza precedente con le siringhe avevano un IC più stretto del 95% (± 6%) e un contributo di varianza inferiore da parte del tecnico rispetto ai tecnici con meno esperienza (± 10%). Ciò suggerisce che prima dell'implementazione sul campo dovrebbe essere eseguito un protocollo di formazione e la convalida con l'olio per veicoli. Questi risultati meritano un'ulteriore convalida in ogni laboratorio che desidera utilizzare siringhe di tubercolina monouso come metodo di somministrazione economico e rapido per somministrare le dosi nei test dose-risposta e RID negli studi basati sulla popolazione.

Abbiamo optato per la pipetta a spostamento positivo per la ricerca e gli studi clinici che utilizzano il test RID per massimizzare l'accuratezza a livello individuale, poiché l'accuratezza e la precisione riportate sono del ≤1%. In confronto, il test dose-risposta relativa modificato è qualitativo e nessun calcolo si basa sulla quantità di dose somministrata1. Pertanto, abbiamo raccomandato l'uso di siringhe per il test in sondaggi basati sulla popolazione e che la dose venga sciolta in circa 0,7 ml di veicolo.

Il test RID è un metodo sensibile per quantificare la TBS e stimare il TLR, che è lo standard di riferimento per valutare lo stato della vitamina A. È stato utilizzato in molte applicazioni di ricerca utilizzando la marcatura al deuterio o al 13C. Le applicazioni attuali e future utilizzeranno il test RID in contesti clinici e sottogruppi di popolazione nelle indagini. La semplificazione del dosaggio sarà importante per queste applicazioni.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse con il contenuto di questo manoscritto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH-R01 DC019357 e dal progetto di ricerca coordinato dell'AIEA E43035. Ringraziamo Nicholas Keuler del gruppo di consulenza statistica dell'Università del Wisconsin-Madison per l'assistenza nell'analisi del confronto del metodo delle siringhe monouso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anidride aceticaSigma Aldrich242845
acetoneSigma Aldrich179124
in ossido di alluminioSigma Aldrich199974
BecherQualunqueQualsiasi azienda di fornitura di vetro 
beta-iononeSigma AldrichW259500
etereSigma Aldrich673811
pipette in vetro pasteurQualunqueQualsiasi azienda di fornitura di vetro 
esaniSigma178918
trietilfosfonoacetato marcatoSigma Aldrich293202
soluzione di litio alluminio idruroAcros organics199511000
ossido di manganeseSidma Aldrich310700
pipette a spostamento positivoRainin17008579
acetato di retinileSigma AldrichR4632
Imbuti separatoriQualunqueQualsiasi azienda di fornitura di vetro 
gel di siliceSigma Aldrich1.07734
idruro di sodioAldrich223441
idrossido di sodioFisher ScientificoS318-100
spettrofotometroQualsiasi scansioneIl doppio raggio è preferito
trietilamminaSigma Aldrich471283
trietilfosfonoacetatoAldrichCodice: T61301
siringa per tubercolinaNorma-JectCodice 19G334
olio vegetalesoiaSupermercato
matracci tarati (25 mL)QualunqueQualsiasi azienda di fornitura di vetro 

Riferimenti

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