È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Esame delle caratteristiche anatomiche delle cellule gangliari retiniche sotto eccitotossicità indotta dall'acido N-metil-D-aspartico (NMDA)

1.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/68537

⸱

19 settembre 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo l'uso di un metodo di marcatura della fosfatasi alcalina (AP) geneticamente diretta per studiare le caratteristiche anatomiche e i fenotipi delle retine di topo sotto eccitotossicità indotta da NMDA. In combinazione con diverse linee reporter specifiche per sottotipo di cellule gangliari retiniche (RGC), scopriamo nuovi fenotipi nelle RGC morenti durante il processo degenerativo.

Abstract

Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono i neuroni di uscita della retina, responsabili della trasmissione delle informazioni visive al cervello. Nella retina di topo maturo, sono stati identificati oltre 40 tipi di RGC in base alle caratteristiche genomiche, morfologiche e funzionali. La degenerazione RGC è un segno distintivo di varie malattie retiniche debilitanti, tra cui il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica. Ottenere una comprensione più approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della degenerazione, della sopravvivenza e della resilienza delle RGC in diverse condizioni di malattia è fondamentale per lo sviluppo di interventi terapeutici efficaci. Per studiare la degenerazione delle RGC, abbiamo adottato una tecnica semplice ma potente, precedentemente ampiamente utilizzata negli studi sullo sviluppo retinico per le morfologie delle RGC e la proiezione centrale. Qui, applichiamo questo metodo per valutare i fenotipi anatomici delle RGC sotto eccitotossicità indotta da NMDA. Questo approccio consente la visualizzazione di un gran numero di RGC degeneranti nel tempo, consentendoci di mappare la sequenza degli eventi degenerativi, identificare i fenotipi distintivi delle RGC morenti e distinguere le RGC resistenti al danno indotto da NMDA.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una lesione improvvisa che provoca danni neuronali al cervello. Nelle forme gravi di trauma cranico, come quelle causate da incidenti stradali o collisioni sportive e lesioni da esplosione dovute a esplosioni, le forze meccaniche possono interrompere l'architettura cellulare, portando a infiammazione, stress ossidativo, eccitotossicità e infine morte neuronale 1,2.

La retina, la parte più accessibile del sistema nervoso centrale (SNC), è servita come sistema modello per il trauma cranico per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'eccitotossicità e per sviluppare strategie di intervento terapeutico 3,4,5. I modelli di retina più pertinenti per gli studi di trauma cranico sono il modello di schiacciamento del nervo ottico e l'eccitotossicità delle retine indotta dall'acido N-metil-D-aspartico (NMDA). Nel modello di retina di eccitotossicità indotta da NMDA, le cellule gangliari retiniche (RGC) sono state identificate come il tipo più suscettibile di neuroni retinici perché le RGC utilizzano il glutammato come neurotrasmettitore eccitatorio principale e vari tipi di recettori del glutammato, inclusi i recettori AMPA (AMPAR), i recettori KAPA (KAPAR) e i recettori NMDA, per attivare il potenziale assonale6. Oltre alle RGC, anche altre cellule retiniche e circuiti neurali potrebbero essere influenzati dal trattamento NMDA 7,8,9. L'applicazione intra-vitreale di NMDA provoca un'apertura prolungata del recettore NMDA, che porta a un eccessivo afflusso di calcio nelle cellule, causando un'attività neuronale ipereccitatoria e uno squilibrio dell'omeostasi del calcio 10,11,12,13.

Il recettore NMDA è un complesso eteromerico composto da tre subunità: GluN1, GluN2 e GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, codificato da Grin1, contiene otto isoforme nei topi a causa dello splicing alternativo di Grin1. Esistono quattro diverse subunità GluN2 (a-d), che sono codificate da quattro geni separati: Grin2a-2d. Ci sono due diverse subunità GluN3 (a e b), che sono codificate da Grin3a e 3b. Secondo i dati 19,20 di scRNA-seq, Grin1 è altamente espresso nella maggior parte dei sottotipi di RGC (Figura 1A) e in alcuni sottotipi di cellule amacrine (AC) con livelli di espressione da deboli a moderati (Figura 1B). Grin2a è arricchito in un minor numero di sottotipi RGC e AC, mentre Grin2b è espresso moderatamente nella maggior parte dei sottotipi RGC e in molti sottotipi AC (Figura 1A, B). I livelli di espressione di Grin2c, Grin2d e Grin3b negli RGC e negli AC sono estremamente bassi (Figura 1A, B). L'espressione di Grin3a può essere vista in alcuni sottotipi RGC e debolmente in alcuni AC (Figura 1A, B). Oltre al ruolo dei recettori NMDA, l'eccitotossicità innescata dall'afflusso di calcio attraverso gli AMPAR permeabili al calcio è stata descritta in diversi modelli di malattia21. L'espressione delle subunità del recettore NMDA può fornire indizi sul motivo per cui l'eccitotossicità indotta da NMDA ha come bersaglio principalmente le RGC e le AC 9,10,14,22,23.

I metodi convenzionali per valutare i fenotipi retinici indotti da NMDA grossolano includono la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) per rilevare anomalie istologiche, il test TUNEL per la morte cellulare e la colorazione con immunofluorescenza (IF) utilizzando un biomarcatore specifico per tipo di cellula 8,10,24,25,26 . A livello cellulare, l'imaging confocale e le tecniche di riempimento del colorante sono state utilizzate per studiare la sequenza di eventi nelle RGC morenti nel modello retinico indotto da NMDA. Questi metodi hanno fornito preziose informazioni sui compartimenti subcellulari delle RGC morenti e hanno permesso l'identificazione dei tipi di RGC resilienti che sopravvivono sotto l'insulto NMDA 27,28.

Qui, impieghiamo la colorazione con fosfatasi alcalina (AP) geneticamente attivata per studiare le caratteristiche anatomiche e i fenotipi dei neuroni retinici di topo sotto eccitotossicità indotta da NMDA 29,30,31. La logica per la scelta di questo metodo è dovuta alla sua semplicità, economicità e capacità di ottenere una panoramica completa delle caratteristiche anatomiche dei sottotipi neuronali nell'intera retina, rendendolo adatto per valutazioni macroscopiche e analisi comparative su larga scala. Questo approccio fornisce nuove informazioni su come i neuroni retinici distinti e geneticamente marcati rispondono all'NMDA sia a livello grossolano che subcellulare. Prevediamo che questa strategia sarà ampiamente applicabile per valutare i cambiamenti morfologici in vari modelli di malattia che influenzano l'architettura neuronale e l'organizzazione sinaptica 4,26,32,33.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali hanno seguito la politica del servizio sanitario pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la McGovern Medical School dell'Università del Texas a Houston. Le composizioni delle soluzioni sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Iniezione di tamoxifene

  1. Mescolare 30 mg di tamoxifene con 30 μL di etanolo. In acqua sub-bollente, scaldare 1 ml di olio di semi di girasole e la miscela di tamoxifene/etanolo.
  2. Dopo che il tamoxifene si è sciolto nell'etanolo, aggiungere rapidamente 1 ml di olio di semi di girasole riscaldato alla soluzione di tamoxifene. Mescolare bene pipettando.
  3. Sono stati utilizzati topi di entrambi i sessi a varie età tra i 2 e i 6 mesi. Iniettare la soluzione di tamoxifene alla dose di 100 μg/g di peso corporeo per via intraperitoneale utilizzando una siringa da insulina. Determinare il numero di iniezioni di tamoxifene in base alla linea del topo. In questo protocollo, il tamoxifene è stato somministrato una volta al giorno per quattro giorni consecutivi.
    NOTA: Poiché la soluzione di tamoxifene è mescolata con olio denso, è difficile da maneggiare con una siringa dotata di un ago staccabile. Pertanto, per l'iniezione di tamoxifene è preferibile una siringa da insulina con un ago collegato.
  4. Alloggiare il topo in gruppi di non più di 5 in gabbie ventilate individualmente. fino all'iniezione di NMDA.

2. Iniezione di soluzione NMDA negli occhi del topo

  1. Preparare 20 mM di soluzione NMDA in 1x PBS sterile. Lavare il Nano-iniettore con un ago da 35G collegato utilizzando etanolo al 100% 20x, quindi lavare con acqua ultrapura sterile per altri 20x. Riempire il nano-iniettore con 1 μL di soluzione NMDA.
  2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di una ketamina/xilazina in una miscela di soluzione 1X PBS (80/10 mg per kg di peso corporeo). Valutare l'incoscienza in base alla risposta di ritiro riflessa al pizzicamento della coda e delle dita dei piedi.
  3. Posizionare il topo anestetizzato su uno stereomicroscopio. Posiziona il mouse con l'occhio destro rivolto verso l'alto e il naso rivolto verso il lato destro. Applicare una goccia di soluzione di proparacaina cloridrato allo 0,5% sul bulbo oculare destro per l'anestesia locale.
  4. Utilizzare un ago per iniezione sterile da 30 G per perforare il limbus a ore 7, creando un piccolo foro. Monitorare la posizione e la direzione dell'ago con lo stereomicroscopio. Assicurarsi che la dimensione dell'ago per iniezione sia leggermente più grande dell'ago per nano-iniezione per consentire un facile inserimento.
  5. Rimuovere con cautela l'ago per iniezione dal bulbo oculare e smaltirlo correttamente. Utilizzare lo stereomicroscopio come guida, inserire l'ago per nanoiniezione nel vitreo attraverso il limbus con un angolo di 45°.
  6. Iniettare lentamente 1 μL di soluzione NMDA nel vitreo. Dopo l'iniezione, tenere l'ago per nanoiniezione nel vitreo per circa 10 secondi per evitare il deflusso della soluzione iniettata.
  7. Estrarre con cautela e lentamente l'ago per nanoiniezione dall'occhio. Applicare l'unguento oftalmico all'eritromicina allo 0,5% sulla cornea dell'occhio iniettato.
  8. Posiziona il mouse in una gabbia su un termoforo. Monitorare il mouse ogni 15 minuti fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Ospita il topo per una o due settimane fino alla raccolta dei tessuti.

3. Raccolta dei tessuti e colorazione con fosfatasi alcalina (AP)

  1. Eutanasia del topo con asfissia da CO2, seguita da lussazione cervicale. Taglia con cura i muscoli che si collegano al bulbo oculare e al nervo ottico con le forbici Vanna.
  2. Il bulbo oculare è stato quindi prelevato con una pinza e trasferito in provette da 2,0 ml marcate separate.
  3. Fissare i bulbi oculari in formalina tamponata neutra al 10% per 10 minuti a temperatura ambiente. Montare le retine su un filtro a membrana in nitrato di cellulosa come descritto di seguito.
    1. Trasferire i bulbi oculari in piastre di Petri da 10 cm contenenti 1x PBS. Tenere il tessuto muscolare attaccato al bulbo oculare usando una pinza. Creare un foro sul limbus utilizzando un ago per iniezione da 30G. Inserite la punta delle forbici Vanna nel foro e tagliate intorno all'ora serrata. Rimuovere la lente dall'oculare utilizzando una pinza.
    2. Fai 3-4 tagli sull'oculare e usa una pinza per tenere l'RPE e rimuovere delicatamente l'RPE dalla retina.
    3. Tagliare un pezzetto di filtro a membrana in nitrato di cellulosa e immergerlo in 1x PBS. Posizionare la retina isolata sul filtro. Spingi delicatamente un'area periferica della retina con la punta di un pennello fine per attaccare il bordo della retina al filtro.
    4. Tenere il bordo del filtro ed estrarlo lentamente dal PBS 1x, assicurandosi che la retina rimanga attaccata e si appiattisca sul filtro. Posiziona la retina/filtro su un tovagliolo di carta per 1 minuto per fissare la retina attaccata al filtro.
    5. Trasferire la retina/filtro in una capsula di Petri con 1x PBS. Rimuovere con cura eventuali detriti, peli e vitreo dalla retina utilizzando una pinza e/o un pennello fine, per quanto possibile. Per distinguere le retine iniettate e non iniettate, taglia i filtri in forme diverse.
  4. Trasferire la retina/filtro in una capsula di Petri. Fissare la retina in formalina tamponata neutra al 10% per 5 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
  5. Preparare un bagnomaria a 65 °C. Preriscaldare 30 mL di 1x PBS in un becher di vetro da 50 mL. Trasferire la retina/i filtri direttamente nel PBS 1x preriscaldato. Incubare le retine a 65°C per 30 minuti.
    NOTA: Il trattamento termico inattiva l'attività endogena dell'AP, che provoca la colorazione di fondo nella retina. È fondamentale trattare la retina nella soluzione riscaldata per eliminare efficacemente questo sfondo.
  6. Dopo il trattamento termico, trasferire le retine in una piastra di Petri da 30 mm contenente tampone AP (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2).
  7. Incubare le retine nel tampone AP a temperatura ambiente per 5 minuti con una leggera agitazione.
    NOTA: Questo passaggio scambia il tampone nella retina da 1x PBS a tampone AP, prevenendo la precipitazione chimica durante lo sviluppo del colore.
  8. Sostituire il tampone AP con una soluzione colorante (30 μL di 10 mg/mL di BCIP e 60 μL di 10 mg/mL di NBP in 10 mL di tampone AP).
  9. Posizionare la capsula di Petri in una scatola che non includa la luce. Sviluppare la reazione AP a temperatura ambiente per 1 o 2 giorni con una leggera agitazione fino a quando l'intensità della colorazione AP è soddisfacente per l'imaging.
  10. Arrestare la reazione lavando le retine con 1x PBS per 5 minuti, 2x, a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
  11. Postfissare le retine con formalina tamponata neutra al 10% per 10 minuti a temperatura ambiente con leggera agitazione.
  12. Lavare le retine con 1x PBS per 5 min, 3x, a temperatura ambiente con leggera agitazione. Disidratare le retine incubandole in etanolo al 30%, seguito da etanolo al 50% per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente con leggera agitazione.
  13. Usa un pennello fine per rimuovere delicatamente le retine dalla carta da filtro. Disidratare le retine prive di filtro in etanolo al 70% per 30 minuti, seguite da due incubazioni di 30 minuti in etanolo al 100% a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
  14. Pulire le retine in una capsula di Petri di vetro con una soluzione chiarificante di benzil benzato/alcol benzilico (2:1, v/v) per 30 minuti a 2 ore a temperatura ambiente con leggera agitazione.
    NOTA: Questa procedura di pulizia non deve essere eseguita durante la notte, poiché un'incubazione prolungata può spesso comportare la perdita della colorazione AP. La soluzione di chiarificazione può sciogliere la plastica, quindi la procedura deve essere eseguita in un contenitore di vetro.
  15. Per montare le retine su un vetrino, applicare del nastro biadesivo sul vetrino per creare una piattaforma per il vetrino coprioggetti e la retina. Posizionare le retine sul vetrino, riempire lo spazio con una soluzione detergente, applicare il vetrino coprioggetti e sigillare il vetrino con smalto per unghie per fissare la retina e il vetrino coprioggetti.
  16. Imaging delle retine colorate con AP utilizzando un microscopio Zeiss Apotome.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

L'applicazione di NMDA nel vitreo induce la morte per RGC, che è stata convenzionalmente rilevata utilizzando la colorazione istologica o la colorazione in immunofluorescenza (IF) con marcatori RGC. Nel nostro contesto sperimentale, utilizzando la strategia IF convenzionale con un marcatore pan-RGC RBPMS, abbiamo confermato che il numero di RGC è diminuito di circa il 65%, 1 settimana dopo l'iniezione di NMDA (Figura 2E-G). Studi precedenti hanno scoperto che le RGC che espr...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema di marcatura AP sparsa geneticamente diretto in combinazione con una serie di linee di topi geneticamente manipolati per esaminare gli eventi degenerativi indotti da NMDA in vari sottotipi RGC e AC e abbiamo scoperto diversi fenotipi caratteristici 29,31,39. Il fenotipo più evidente è la significativa riduzione di RGC e AC nelle retine iniettate co...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health-National Eye Institute al C.A.M. (EY024376) e in parte dal National Eye Institute Vision Core Grants P30EY028102 (UTHealth). Riconosciamo anche il sostegno finanziario dello Stephen Lasher Endowment (UTHealth) e del Raye White Endowment (UTHealth).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5% unguento oftalmico eritromicina Bausch+Lomb24208-910-55
0,5% proparacaina cloridrato Bausch+Lomb24208-730-06
10% formalina tamponata neutra VWR89370-094
10 cm di petridiscoCorning430167
10x PBSFisher ScientificoBP399Diluire in acqua per creare 1x PBS e autoclave.
Tubo da 2,0 mlVWR525-1136
Ago per iniezione calibro 30EXELINT Internazionale26437
30 mm di petriaccaFalcone35208
Benzil alcol Acros Organics447000010
Benziato di benzileAcros Organics105860010
Filtro a membrana in nitrato di cellulosaCitiva7188-002
Vetrino di coperturaScienze della microscopia elettronica72204-01
Nastro biadesivoScozzese597020
EtanoloLaboratori Decon2716Evitare i bioreagenti Fisher (Cat#: BP2818) per la disidratazione dopo la colorazione AP. Questo reagente distorce la retina.
ForcipeTED PELLA505
TermoforoTeratherm710298-001
Siringa da insulinaBD329424
KetaminaDechra17033010110
MicroscopioZeissAxio Imager 2
Smalto per unghieScienze della microscopia elettronica72180
Iniettore NanofilStrumenti di precisione mondialiNANOFIL
Ago NanofilStrumenti di precisione mondialiNF25BL
Kit di reagenti NBT/BICPInvitrogenN6547
NMDASigma-AldrichVisualizzazione del materiale M3262
PennelloKingart6650
Vetri scorrevoliFisher Scientifico12-550-15
StereomicroscopioMoticoDM143
Olio di semi di girasoleSigma-AldrichS5007
TamoxifeneSigma-AldrichT5648Conservare la soluzione di tamoxifene a 4 gradi C in una scatola a tenuta di luce. Utilizzare la soluzione di tamoxifene entro una settimana.
Forbici Vanna Strumenti per la scienza15000-00
Bagno d'acquaLinea Lab-Line18052
XilazinaDechra17033-0099-05Nome prodotto: Rompun

Riferimenti

  1. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).
  2. Zetterberg, H., Blennow, K. Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions. Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).
  3. Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (5), 3440-3450 (2013).
  4. Lund, B. J., Rule, G. T. Pressure wave dosimetry for "Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury". Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1348-1349 (2014).
  5. Peterson, S. L., et al. Retinal Ganglion Cell Axon Regeneration Requires Complement and Myeloid Cell Activity within the Optic Nerve. J Neurosci. 41 (41), 8508-8531 (2021).
  6. Boccuni, I., Fairless, R. Retinal Glutamate Neurotransmission: From Physiology to Pathophysiological Mechanisms of Retinal Ganglion Cell Degeneration. Life. 12 (5), 638(2022).
  7. Shen, Y., Luo, X., Liu, S., Nawy, S. Rod bipolar cells dysfunction occurs before ganglion cells loss in excitotoxin-damaged mouse retina. Cell Death Dis. 10 (12), 905(2019).
  8. Lambuk, L., et al. Dose-dependent effects of NMDA on retinal and optic nerve morphology in rats. Int J Ophthalmol. 12 (5), 746-753 (2019).
  9. Asami, Y., et al. Age-dependent changes in the severity of capillary degeneration in rat retina following N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity. Curr Eye Res. 40 (5), 549-553 (2015).
  10. Siliprandi, R., et al. N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity in the adult rat retina. Vis Neurosci. 8 (6), 567-573 (1992).
  11. Chidlow, G., Osborne, N. N. Rat retinal ganglion cell loss caused by kainate, NMDA and ischemia correlates with a reduction in mRNA and protein of Thy-1 and neurofilament light. Brain Res. 963 (1-2), 298-306 (2003).
  12. Shi, J. M., Jiang, Y. Q., Liu, X. Y. Morphological changes of retina after N-methyl-D-aspartate induced damage in rats. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 29 (3), 287-291 (2004).
  13. Nakazawa, T. Mechanism of N-methyl-D-aspartate-induced retinal ganglion cell death. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 113 (11), 1060-1070 (2009).
  14. Shen, Y., Liu, X. L., Yang, X. L. N-methyl-D-aspartate receptors in the retina. Mol Neurobiol. 34 (3), 163-179 (2006).
  15. Bai, N., et al. NMDA receptor subunits have different roles in NMDA-induced neurotoxicity in the retina. Mol Brain. 6, 34(2013).
  16. Cull-Candy, S., Brickley, S., Farrant, M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr Opin Neurobiol. 11 (3), 327-335 (2001).
  17. Wang, J. X., Furukawa, H. Dissecting diverse functions of NMDA receptors by structural biology. Curr Opin Struct Biol. 54, 34-42 (2019).
  18. Chou, T. H., Kang, H., Simorowski, N., Traynelis, S. F., Furukawa, H. Structural insights into assembly and function of GluN1-2C, GluN1-2A-2C, and GluN1-2D NMDARs. Mol Cell. 82 (23), 4548-4563.e4 (2022).
  19. Tran, N. M., et al. Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  20. Yan, W., et al. Mouse Retinal Cell Atlas: Molecular Identification of over Sixty Amacrine Cell Types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  21. Guo, C., Ma, Y. Y. Calcium Permeable-AMPA Receptors and Excitotoxicity in Neurological Disorders. Front Neural Circuits. 15, 711564(2021).
  22. Lucas, D. R., Newhouse, J. P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina. AMA Arch Ophthalmol. 58 (2), 193-201 (1957).
  23. Karl, M. O., et al. Stimulation of neural regeneration in the mouse retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19508-19513 (2008).
  24. DeParis, S., Caprara, C., Grimm, C. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are resistant to N-methyl-D-aspartic acid excitotoxicity. Mol Vis. 18, 2814-2827 (2012).
  25. Fogo, G. M., Shuboni-Mulligan, D. D., Gall, A. J. Melanopsin-Containing ipRGCs Are Resistant to Excitotoxic Injury and Maintain Functional Non-Image Forming Behaviors After Insult in a Diurnal Rodent Model. Neuroscience. 412, 105-115 (2019).
  26. Cui, Q., Ren, C., Sollars, P. J., Pickard, G. E., So, K. F. The injury resistant ability of melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. Neuroscience. 284, 845-853 (2015).
  27. Christensen, I., et al. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Glutamatergic Excitotoxicity Is Type-Specific. Front Neurosci. 13, 219(2019).
  28. Yang, N., Young, B. K., Wang, P., Tian, N. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Optic Nerve Injury is Type Specific. Cells. 9 (3), 677(2020).
  29. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480 (4), 331-351 (2004).
  30. Badea, T. C., Nathans, J. Morphologies of mouse retinal ganglion cells expressing transcription factors Brn3a, Brn3b, and Brn3c: analysis of wild type and mutant cells using genetically-directed sparse labeling. Vision Res. 51 (2), 269-279 (2011).
  31. Jamal, L., Kiyama, T., Mao, C. A. Genetically Directed Sparse Labeling System for Anatomical Studies of Retinal Ganglion Cells. Methods Mol Biol. 2092, 187-194 (2020).
  32. Hinds, J. W., Hinds, P. L. Early ganglion cell differentiation in the mouse retina: an electron microscopic analysis utilizing serial sections. Dev Biol. 37 (2), 381-416 (1974).
  33. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  34. Mao, C. A., et al. T-box transcription regulator Tbr2 is essential for the formation and maintenance of Opn4/melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 34 (39), 13083-13095 (2014).
  35. Chen, C. K., et al. Characterization of Tbr2-expressing retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 529 (15), 3513-3532 (2021).
  36. Zhang, X. M., et al. Highly restricted expression of Cre recombinase in cerebellar Purkinje cells. Genesis. 40 (1), 45-51 (2004).
  37. Kiyama, T., et al. Essential Roles of Tbr1 in the Formation and Maintenance of the Orientation-Selective J-RGCs and a Group of OFF-Sustained RGCs in Mouse. Cell Rep. 27 (3), 900-915.e5 (2019).
  38. Kiyama, T., Chen, C. K., Zhang, A., Mao, C. A. Differential Susceptibility of Retinal Neurons to the Loss of Mitochondrial Biogenesis Factor Nrf1. Cells. 11 (14), 2203(2022).
  39. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23 (6), 2314-2322 (2003).
  40. Mao, C. A., et al. Eomesodermin, a target gene of Pou4f2, is required for retinal ganglion cell and optic nerve development in the mouse. Development. 135 (2), 271-280 (2008).
  41. Shi, M., et al. Genetic interactions between Brn3 transcription factors in retinal ganglion cell type specification. PLoS One. 8 (10), e76347(2013).
  42. Muzyka, V. V., Brooks, M., Badea, T. C. Postnatal developmental dynamics of cell type specification genes in Brn3a/Pou4f1 Retinal Ganglion Cells. Neural Dev. 13 (1), 15(2018).
  43. Liu, S., Aldinger, K. A., Cheng, C. V., Kiyama, T., Dave, M., McNamara, H. K., Zhao, W., Stafford, J. M., Descostes, N., Lee, P., et al. NRF1 association with AUTS2-Polycomb mediates specific gene activation in the brain. Mol Cell. 81 (22), 4663-4676.e8 (2021).
  44. Kiyama, T., Altay, H. Y., Badea, T. C., Mao, C. A. Pou4f1-Tbr1 transcriptional cascade controls the formation of Jam2-expressing retinal ganglion cells. Front Ophthalmol. 3, 1175568(2023).
  45. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Eccitotossicità da NMDADegenerazione delle RGCRetina di topoMorfologia cellulareSopravvivenza cellulareResilienza cellulareMalattie retinicheFenotipi anatomiciMarcatura cellulare
Esame delle caratteristiche anatomiche delle cellule gangliari retiniche sotto eccitotossicità indotta dall'acido N-metil-D-aspartico (NMDA)
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.