Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

Sommario

Questo protocollo integra un sistema di bioreattore personalizzato con spettroscopia NMR iperpolarizzata ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato in tempo reale nelle cellule vive, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica per studi metabolici e applicazioni di screening farmacologico.

Abstract

Il protocollo presenta un metodo per integrare un sistema di bioreattore costruito internamente con spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) iperpolarizzata a ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato nelle cellule vive in tempo reale. Il protocollo delinea la costruzione di un sistema di bioreattori che consente una temporizzazione precisa dell'iniezione del substrato iperpolarizzato e dell'acquisizione del segnale NMR, mantenendo un ambiente di coltura cellulare stabile. Il metodo rileva in modo affidabile la conversione metabolica del piruvato in lattato entro una finestra di misurazione di 60 s, mantenendo un rapporto segnale/rumore sufficiente durante tutto il processo. La capacità di miscelazione in situ del sistema accelera il rilevamento del segnale NMR e riduce le perdite di rilassamento T₁. Il protocollo include anche istruzioni dettagliate per la preparazione di gel di alginato per incapsulare le cellule e posizionarle all'interno del bioreattore. Il metodo proposto mostra una migliore riproducibilità e accuratezza cinetica rispetto ai metodi convenzionali, indicando potenziali applicazioni negli studi sul metabolismo del cancro e nello screening dei farmaci. Ulteriori perfezionamenti del sistema, come l'adozione di matrici su gel alternative, possono migliorare la sua versatilità in vari studi biologici.

Introduzione

La risonanza magnetica mobile iperpolarizzata, in particolare attraverso la polarizzazione nucleare dinamica (DNP), migliora significativamente l'intensità del segnale NMR¹ e consente il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti metabolici con una sensibilità notevolmente migliorata ^2,3. Questa tecnica è stata applicata con successo in vari sistemi biologici, tra cui il lievito ^4,5, i modelli di cellule tumorali ^6,7,8 e i microrganismi ^9,10. È stato anche utilizzato per monitorare le principali vie metaboliche come la glicolisi^11,12, l'omeostasi redox^13,14 e la regolazione del pH^15,16. Oltre alla ricerca di base, la RMN iperpolarizzata è ora utilizzata nell'imaging clinico attraverso la risonanza magnetica, consentendo la valutazione metabolica dalla scala cellulare a quella di tutto il corpo¹⁷. Questi sviluppi sottolineano la crescente domanda di protocolli accessibili che facilitino l'uso più ampio della RMN iperpolarizzata in diversi contesti biologici.

Nonostante la sua versatilità, l'implementazione di misurazioni metaboliche in tempo reale in cellule vive utilizzando la risonanza magnetica neuronale iperpolarizzata rimane tecnicamente impegnativa. I sistemi convenzionali spesso si basano su configurazioni complesse e specifiche per il laboratorio che mancano di riproducibilità e sono difficili da utilizzare senza una vasta esperienza 8,18,19,20. Ciò rappresenta un grosso ostacolo per i ricercatori che mirano ad adottare questa tecnologia per la ricerca biologica o traslazionale. Rispetto a metodi alternativi come l'imaging ottico o la spettrometria di massa, la risonanza magnetica a ¹³C iperpolarizzata consente il monitoraggio non invasivo e risolto nel tempo di specifiche reazioni metaboliche senza campionamento distruttivo. Fornisce informazioni biochimiche dirette con precisione temporale, il che lo rende adatto per studi dinamici del metabolismo cellulare.

Per affrontare queste limitazioni, questo studio presenta un protocollo pratico e riproducibile specificamente progettato per consentire ai ricercatori di eseguire misurazioni NMR iperpolarizzate del metabolismo delle cellule vive con ostacoli tecnici minimi. Viene descritto un metodo completo per la misurazione di base del metabolismo del piruvato nelle cellule viventi. Sebbene questo protocollo possa essere applicato ad altre ¹³sonde marcate con C, il piruvato è particolarmente adatto grazie al suo rapido assorbimento cellulare, alle vie metaboliche ben caratterizzate e al suo ruolo centrale nel metabolismo cellulare. La procedura consiste in: (i) preparazione di campioni cellulari, (ii) incapsulamento in gel di alginato, (iii) iperpolarizzazione con un polarizzatore DNP e (iv) misurazione NMR ^{a 13}C in tempo reale in uno spettrometro a 400 MHz (Figura 1). Inoltre, vengono forniti i parametri chiave per la costruzione del sistema di bioreattore per garantire la riproducibilità e la compatibilità con l'hardware NMR standard. Il protocollo è ottimizzato per facilitare l'implementazione utilizzando componenti disponibili in commercio e ha lo scopo di aiutare i ricercatori, in particolare quelli nuovi alla tecnica, a determinarne l'idoneità per le loro esigenze sperimentali.

Protocollo

1. Configurazione del bioreattore (Figura 2A-B)

1. Assemblaggio del tubo NMR
   1. Utilizzare un tubo NMR con tappo a vite (diametro 10 mm, lunghezza 178 mm) con tappo aperto per l'inserimento del tubo.
   2. Preparare un setto per fiala in silicone/PTFE (diametro 9 mm) e inserire una provetta in PEEK attraverso di esso per una tenuta ermetica (Figura supplementare 1).
   3. Inserire il setto con tubo in PEEK chimicamente resistente (diametro interno 1,0 mm, diametro esterno 1,6 mm, spessore della parete 0,3 mm, lunghezza 1 m) nell'apertura del tappo modificato.
   4. Posizionare il setto tra la provetta NMR e il suo tappo aperto e fissarlo chiudendo saldamente il tappo. Questa configurazione mantiene il setto in posizione e fornisce una tenuta sufficiente per evitare perdite durante la perfusione o l'iniezione.
2. Impostazione del tubo di mandata del fluido (Figura 2C)
   1. Collegare il tubo in PEEK alle porte di ingresso e uscita del tubo NMR per consentire la perfusione continua. Fissare i collegamenti utilizzando un set di raccordi senza flangia per evitare perdite.
3. Installazione dei componenti di riscaldamento medio
   1. Collegare il tubo in PEEK a una pompa peristaltica regolabile su una portata stabile di circa 0,2 mL/min, garantendo una circolazione continua del fluido tramite un kit di circolazione esterno. Mettere il serbatoio del fluido in un bagnomaria impostato a 37 °C per mantenere la temperatura.
4. Aggiunta di un componente per la prevenzione delle perdite di gel
   1. Tagliare una spugna densa per adattarla al diametro del tubo NMR. Inserire la spugna nella parte inferiore del tubo per evitare perdite di gel di alginato e consentire un flusso medio.
5. Fabbricazione e inserimento del componente di fissaggio in spugna stampato in 3D (Figura 2D-F)
   1. Stampa in 3D un supporto cilindrico (diametro esterno 9,1 mm, lunghezza 20 mm, con un foro centrale di 1,5 mm di diametro) utilizzando una resina fotopolimerica compatibile con la stampa 3D stereolitografica. Le specifiche di progetto sono fornite nell'allegato File Supplementare 1.
   2. Inserire un capillare in vetro borosilicato (diametro esterno 1,5 mm, diametro interno circa 0,9 mm, lunghezza 90 mm) attraverso il foro preformato del supporto stampato in 3D.
   3. Fissare la spugna alla piattaforma sul supporto utilizzando resina polimerizzabile ai raggi UV con proprietà di resistenza all'acqua. Polimerizzare per 30 s sotto luce UV per garantire la solidificazione.
   4. Inserire il supporto assemblato con la spugna nel tubo NMR.

2. Preparazione delle cellule (iniziare 2 settimane prima della misurazione)

1. Scongelare rapidamente le cellule congelate (SCCVII o HeLa) in un bagno d'acqua a 37 °C. Trasferire circa 1 × 10-6 cellule in 10 mL di terreno RPMI-1640 integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino e l'1% (v/v) di penicillina-streptomicina.
2. Colture di cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e passaggio ogni 2-3 giorni una volta raggiunta la confluenza del 70%-80%. Continuare la coltura per circa 2 settimane per ottenere ~4 x 10⁷ cellule, stimate da cinque piastre di 10 cm cresciute a circa il 90% di confluenza (ciascuna produce ~8 x 10⁶ cellule).

3. Preparazione del gel di alginato

1. Preparazione della soluzione di alginato
   1. Sciogliere la polvere di alginato di sodio biologico per la ricerca in acqua deionizzata per preparare una soluzione al 2% (p/v). Incubare la soluzione per una notte a 25 °C o superiore con una leggera agitazione end-over-end. Utilizzare un rotatore per provette impostato a circa 10-20 giri/min per evitare la formazione di bolle e garantire una dissoluzione uniforme.
2. Incapsulamento delle cellule in gel di alginato
   1. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (v/v) al piatto da 10 cm. Inclinare la pirofila in modo da coprire l'intera superficie e aspirare la tripsina-EDTA in eccesso.
   2. Incubare la capsula a 37 °C per 2 minuti.
   3. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura al piatto. Pipettare delicatamente su e giù per staccare le cellule. Raccogliere l'intera sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
   4. Prelevare circa 10 μl di sospensione e contare il numero di cellule utilizzando un contacellule. In genere, sono necessarie circa 1 × 10⁷ celle per le procedure successive, ma il numero effettivo dovrebbe essere confermato mediante misurazione.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 120 × g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 mL di soluzione di alginato al 2% (p/v). Pipettare lentamente per ridurre al minimo la generazione di bolle.
3. Formazione di gel per reticolazione del calcio (Figura 3)
   1. Aggiungere 10 mL di soluzione di CaCl₂ 50 mM a una provetta da centrifuga da 50 mL (Figura 3A).
   2. Prelevare 300 μl della miscela cellula-alginato in una siringa da 0,5 mL dotata di un ago da 30 G da 10 mm e fissarla al tappo della provetta da centrifuga (Figura 3B).
   3. Chiudere bene il tappo della provetta da centrifuga con la siringa fissata su di essa e centrifugare delicatamente l'intero gruppo a 200 × g per 5 minuti. Rimuovere la soluzione surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il gel caricato con cellule nel terreno (Figura 3C-D).
4. Caricamento del gel nel tubo NMR
   1. Trasferire il gel incapsulato nella provetta NMR utilizzando una pipetta Pasteur. Inserire il dispositivo in spugna e garantire una tenuta ermetica.
   2. Preriscaldare il serbatoio del fluido (contenente il 5% (v/v) D₂O) preparato al punto 1.3.2 in un bagno d'acqua a 37 °C e farlo circolare a una velocità di circa 500 μL/h per stabilizzare le condizioni.
   3. Assicurarsi che non vi siano perdite prima di inserire il tubo NMR nel magnete. Mantenendo dritto il tubo in PEEK, inserire il tubo NMR nel magnete. Regolare la dimensione del gel, il numero di microsfere e la velocità di pipettaggio in base al tipo di cellula e ai requisiti sperimentali.

4. Preparazione della sonda iperpolarizzata utilizzando un polarizzatore DNP (Figura 4)

1. Preparazione della fiala del campione
   1. Aggiungere 18 μL di acido piruvico [^1-13C] (14,2 M) drogato con 25 mM OX063 a una fiala di campione. Collegare la fiala al percorso del fluido del sistema polarizzatore DNP.
2. Polarizzazione del campione
   1. Inserire la fiala nell'unità di alesaggio del polarizzatore DNP (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar). Applicare l'irradiazione a microonde a circa 188 GHz (22 mW) per 60-80 minuti.
3. Monitoraggio del segnale durante la polarizzazione
   1. Utilizzare lo spettrometro NMR a stato solido integrato nel sistema DNP per monitorare l'intensità del segnale ^{a 13}C. Registra i dati del segnale ogni 5 minuti utilizzando il software NMR (SPINit).
4. Sciogliere e preparare la soluzione iperpolarizzata
   1. Sciogliere rapidamente il campione polarizzato in 3,2 mL di tampone di dissoluzione preriscaldato (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg/L EDTA). Assicurarsi che la soluzione raggiunga la temperatura biologica (308-313 K, pH ~7) prima di trasferirla per la misurazione NMR.
      NOTA: Prestare attenzione quando si maneggiano componenti ad alta pressione. Preriscaldare il tampone di dissoluzione a ~461 K per garantire un trasferimento efficiente e l'integrità del campione.

5. Configurazione NMR

1. Preparazione dello spettrometro NMR
   1. Caricare il campione nella provetta NMR e inserirlo nello spettrometro.
   2. Esegui il blocco, la sintonizzazione, la corrispondenza e lo shimming sulla console NMR utilizzando la procedura automatizzata con il campione inserito, per ottimizzare la risoluzione spettrale e la stabilità del segnale.
2. Impostazione dei parametri di acquisizione
   1. Caricare una sequenza di acquisizione impulsi ^{a 13}C (ad esempio, zg2d) con il disaccoppiamento protonico abilitato (ad esempio, 13-CPD).
   2. Impostare l'angolo di inversione a 90° utilizzando un impulso di 1 μs (P1). Impostare il tempo di acquisizione su 1,376 s, la larghezza spettrale su 23.663 Hz e il numero di punti di acquisizione (TD) su 65.536. Impostare il ritardo di rilassamento (D1) su 0 s.
   3. Impostare il numero di incrementi di tempo (TD1) su 150 per acquisire 150 spettri sequenziali in modalità pseudo-2D. Regolare il guadagno del ricevitore su un valore basso (ad es. ~1) per evitare la saturazione del segnale da campioni iperpolarizzati.
      NOTA: A causa dell'elevata intensità del segnale dell'NMR iperpolarizzato, impostare il guadagno del ricevitore su un valore basso (ad es. ~1), che in genere corrisponde a meno dell'1% del guadagno massimo disponibile. Il guadagno del ricevitore è un parametro interno, senza unità, che controlla l'amplificazione del segnale. Valori troppo alti possono causare la saturazione del segnale.

6. Misurazione NMR

1. Preparazione per la misurazione
   1. Riempire l'intero percorso del tubo di ingresso dal tubo di ingresso al tubo NMR con un tampone di dissoluzione per evitare l'intrappolamento dell'aria (Figura 2B). Il tubo di ingresso viene utilizzato sia per la perfusione media che per l'iniezione di sonda iperpolarizzata.
   2. Controllare attentamente che non siano presenti bolle d'aria nel tubo di ingresso o all'interno del tubo NMR, poiché le bolle in questa regione possono interferire con l'acquisizione del segnale durante le misure NMR.
2. Preparazione per l'iniezione di soluzione iperpolarizzata
   1. Arrestare la pompa peristaltica per arrestare temporaneamente la circolazione del fluido prima di iniettare la soluzione iperpolarizzata attraverso il tubo di ingresso.
   2. Avviare l'acquisizione spettrale circa 10 s prima di sciogliere il substrato iperpolarizzato per garantire che il segnale venga catturato immediatamente all'arrivo al sito di rilevamento NMR dopo l'iniezione.
   3. Aspirare 1 mL di soluzione con una siringa quando esce dal polarizzatore DNP.
3. Iniezione della soluzione iperpolarizzata e conferma del segnale
   1. Portare la valvola a tre vie all'ingresso del bioreattore in posizione B per iniettare la soluzione iperpolarizzata nel tubo NMR.
   2. Riportare la valvola in posizione A dopo l'iniezione per riprendere la circolazione del fluido e prevenire il riflusso.
   3. Confermare l'avvenuta iniezione e l'arrivo del substrato osservando un aumento del segnale di decadimento a induzione libera (FID) nel software di acquisizione.

7. Elaborazione e analisi dei dati

1. Elaborazione dei dati spettrali
   1. Caricare lo spettro NMR risolto nel tempo nel software di elaborazione dati. Se i dati sono memorizzati in formato file ser, individuare e caricare il file appropriato.
2. Analisi degli spettri
   1. Eseguire la trasformazione di Fourier (FT) per convertire il FID grezzo nel dominio della frequenza. Applicare la correzione di fase manualmente o automaticamente. Eseguire la correzione della linea di base per rimuovere le distorsioni.
3. Visualizzazione della conversione dei metaboliti
   1. Traccia i segnali di andamento temporale per il piruvato C1 (~171 ppm) e il lattato C1 (~183 ppm).
4. Quantificazione della conversione metabolica
   1. Calcolare l'area sotto la curva (AUC) per i picchi di piruvato e lattato.
   2. Determinare il rapporto [Lattato]/[Piruvato] dividendo l'AUC del lattato per quella del piruvato.
      NOTA: L'AUC viene utilizzata al posto dell'altezza del picco per ridurre al minimo l'influenza degli artefatti di ronzio causati dal grande segnale iperpolarizzato [1-¹³C] del piruvato. I valori di AUC sono ottenuti dalla semplice somma delle intensità del segnale all'interno dell'intervallo di integrazione definito per ciascun picco.

Risultati

In questo studio, un sistema fabbricato è stato accoppiato alla spettroscopia NMR ^{iperpolarizzata 13}C per misurare il metabolismo del piruvato nelle cellule vive in tempo reale. I principali segnali rilevati nello spettro NMR ^{1D 13}C corrispondevano al piruvato (circa 171 ppm) e al lattato (circa 183 ppm)²¹, permettendoci di valutare la conversione metabolica del piruvato in lattato in condizioni fisiologiche (Figura 4).

Qualità spettrale e dinamica del segnale
I risultati rappresentativi di misurazioni ripetute sullo stesso campione utilizzando cellule SCCVII, una linea di carcinoma a cellule squamose di topo frequentemente utilizzata negli studi di risonanza magnetica iperpolarizzata, sono mostrati nella Figura 5. La prima misurazione ha mostrato un chiaro aumento del segnale del lattato, indicando una conversione metabolica attiva. Tuttavia, le misurazioni successive effettuate a intervalli di 1,5 ore hanno mostrato un progressivo declino dell'attività metabolica. Questa riduzione dipendente dal tempo riflette probabilmente lo stress biologico o l'adattamento indotto dall'iniezione iniziale di piruvato. In particolare, una simile modulazione metabolica transitoria è stata riportata in vivo utilizzando la risonanza magnetica iperpolarizzata e l'EPRI, dove l'ossigenazione del tumore è temporaneamente diminuita dopo la somministrazione di piruvato²². Questi risultati dimostrano che la ripetibilità di queste misurazioni consente il monitoraggio non distruttivo dei cambiamenti metabolici dinamici, un vantaggio difficile da ottenere con i metodi distruttivi²³.

Per valutare l'applicabilità di questo protocollo ad altri tipi di cellule, sono state condotte ulteriori misurazioni utilizzando le cellule HeLa, una linea cellulare tumorale umana ampiamente utilizzata. Come mostrato nella Figura 6, le cellule HeLa hanno anche mostrato una chiara conversione da piruvato a lattato. Sebbene l'intensità del segnale sia gradualmente diminuita a causa del rilassamento del T₁, il rapporto segnale/rumore è rimasto sufficiente per tutto il periodo di acquisizione di 60 s. Questi risultati suggeriscono che l'attuale protocollo è ampiamente applicabile e può fungere da strumento versatile per la profilazione metabolica in tempo reale in vari tipi di cellule.

Sebbene il rapido decadimento del segnale sia una limitazione intrinseca della risonanza magnetica nucleare basata su DNP, il nostro sistema di miscelazione in situ riduce al minimo il ritardo tra la dissoluzione e la misurazione, migliorando così la sensibilità di rilevamento. Ulteriori perfezionamenti, come l'ottimizzazione della composizione della matrice di gel, possono espandere l'applicabilità di questo metodo a una gamma più ampia di sistemi biologici.

Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro complessivo dalla coltura cellulare alla misurazione NMR iperpolarizzata. Il processo inizia con la coltura cellulare (~2 settimane), seguita dalla preparazione del gel di alginato (~60 min) per incapsulare le cellule per una misurazione stabile. Successivamente, l'iperpolarizzazione viene eseguita utilizzando un sistema polarizzatore DNP (~60 min) e la misurazione NMR viene condotta utilizzando uno spettrometro NMR a 400 MHz (~5 min). Le fotografie a destra mostrano gli strumenti corrispondenti utilizzati in questo flusso di lavoro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione del bioreattore per la misura NMR iperpolarizzata. (A) Diagramma schematico della configurazione del bioreattore. Il terreno di coltura viene introdotto nella provetta NMR attraverso l'ingresso A e successivamente diretto verso i rifiuti. Le perle di alginato contenenti cellule vive vengono poste all'interno della provetta NMR. Durante le misure NMR iperpolarizzate, la sonda iperpolarizzata viene iniettata attraverso l'ingresso B, etichettato come ingresso della sonda iperpolarizzata. (B) Fotografia dell'intera configurazione del bioreattore, con i tubi di ingresso e uscita chiaramente etichettati. (C) Vista ravvicinata dell'interruttore del tubo di ingresso, che mostra l'ingresso A (perfusione media) e l'ingresso B (iniezione di sonda iperpolarizzata). (D) Progettazione CAD e (E) fotografia rappresentativa del componente di fissaggio in spugna stampato in 3D posizionato all'interno del tubo NMR. Il componente include un foro per guidare un capillare di vetro che eroga la soluzione di substrato iperpolarizzato e una piattaforma per contenere una spugna. Il componente stesso non si adatta perfettamente alla parete interna del tubo NMR; (F) invece, viene inserita una spugna attorno ad esso per riempire lo spazio. Questa struttura stabilizza il componente e consente al fluido di scarto di fluire verso l'alto attraverso la spugna, eliminando la necessità di un foro di uscita aggiuntivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Preparazione del gel di alginato. (A) Illustrazione schematica e (B) fotografia dell'apparato per la formazione di sfere di gel di alginato. L'immagine a sinistra mostra l'intera configurazione, compresa la provetta da centrifuga con una siringa fissata al coperchio modificato. L'immagine in alto a destra mostra un coperchio con un piccolo foro per la punta della siringa, mentre l'immagine in basso a destra mostra un coperchio con un'apertura quadrata per un posizionamento stabile della siringa. La provetta da centrifuga è pre-riempita con 10 mL di soluzione di cloruro di calcio, consentendo alla soluzione di alginato che esce dalla punta della siringa di subire la gelificazione, formando sfere di gel di alginato. (C) Immagine microscopica rappresentativa che mostra la morfologia delle palline di gel di alginato. (D) Immagine microscopica rappresentativa che mostra la morfologia di sfere di gel di alginato contenenti cellule HeLa. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rappresentazione schematica delle fasi di preparazione per la misura NMR e l'iperpolarizzazione. Durante il processo di accumulo DNP di ~60 minuti, la configurazione NMR viene eseguita in parallelo per ridurre al minimo i ritardi. La preparazione prevede il caricamento di perline di alginato nel tubo NMR, seguito dalla regolazione del blocco ^{di 1}ora, dallo spessore e dalla messa a punto della sonda per garantire che il sistema sia pronto per la misurazione immediata. Dopo la dissoluzione e la miscelazione in situ , la spettroscopia NMR ^{a 13}C risolta nel tempo rivela chiari picchi di piruvato e lattato. I picchi osservati a circa 171 ppm, 179 ppm e 183 ppm corrispondono rispettivamente al piruvato, al piruvato idrato e al lattato. Per la misurazione NMR sono state utilizzate circa 4 × 10⁷ cellule HeLa incapsulate in gel di alginato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rilevamento risolto nel tempo di segnali di piruvato e lattato in misurazioni ripetute. Gli spettri NMR iperpolarizzati ¹³C dello stesso campione incapsulato in cellule SCCVII sono stati acquisiti a intervalli di 1,5 ore per valutare la fattibilità di misure ripetute non distruttive. Le intensità di picco del piruvato (cerchi aperti) e del lattato (cerchi pieni, scalate di 1000×) sono tracciate nel tempo per ogni acquisizione. (A) Prima misurazione. (B) La seconda misurazione, dopo 1,5 ore, rivela una marcata riduzione della produzione di lattato. (C) La terza misurazione, dopo un'altra 1,5 ore, ha confermato una bassa attività metabolica sostenuta. L'analisi quantitativa basata sull'area sotto la curva (AUC) ha mostrato che il rapporto [Lattato]/[Piruvato] è diminuito da 0,00134 (prima misurazione) a 0,00019 (seconda) e 0,00027 (terza). La concentrazione finale di cellule nel gel di alginato era di circa 1,0 ×^10-7 cellule/mL (4 × 10-7 cellule in 4 mL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Conversione del piruvato in lattato nelle cellule HeLa. I segnali NMR iperpolarizzati ¹³C risolti nel tempo di piruvato e lattato sono stati misurati in cellule HeLa vive. L'intensità del segnale del piruvato viene normalizzata al suo valore massimo al tempo zero. L'intensità del segnale del lattato è scalata di un fattore di 10³ per la visibilità. L'analisi quantitativa basata sull'area sotto la curva (AUC) ha mostrato un rapporto [Lattato]/[Piruvato] di 0,00121. La concentrazione finale di cellule nel gel di alginato era di circa 7,5 × 10⁶ cellule/mL (3 × 10⁷ cellule in 4 mL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura supplementare 1. Immagini rappresentative del setto della fiala utilizzato nel sistema del bioreattore. (A) Setto in silicone/PTFE (diametro 9 mm) prima dell'uso. (B) Lo stesso setto in uso effettivo, con tubo in PEEK inserito attraverso fori perforati. L'elasticità del materiale del setto gli consente di risigillarsi attorno al tubo, mantenendo condizioni di tenuta all'aria durante l'iniezione del substrato iperpolarizzato. Clicca qui per scaricare questa figura

Figura 2 supplementare: Spettro NMR ¹³C iperpolarizzato risolto nel tempo acquisito dopo miscelazione esterna. Spettro rappresentativo risolto nel tempo del metabolismo del piruvato [^1-13C] misurato utilizzando un sistema NMR da banco dopo miscelazione esterna di piruvato iperpolarizzato e cellule al di fuori del tubo NMR. Clicca qui per scaricare questa figura

File supplementare 1: Progettazione CAD del supporto cilindrico. Clicca qui per scaricare questo file

Discussione

Passaggi critici del protocollo
Il successo di questo protocollo dipende da diversi passaggi critici. In primo luogo, è importante garantire una corretta dissoluzione e trasferimento del piruvato ^{di 13}C iperpolarizzato per mantenere un elevato rapporto segnale/rumore. Per catturare la conversione metabolica precoce del piruvato in lattato, i tempi dell'iniezione della sonda iperpolarizzata e l'acquisizione NMR devono essere sincronizzati. Inoltre, è importante mantenere la vitalità cellulare durante l'esperimento. Le deviazioni da questi parametri possono comportare una riduzione dell'attività metabolica e la perdita di segnale.

Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo
Sebbene questo protocollo fornisca un approccio robusto per il monitoraggio metabolico in tempo reale, alcune modifiche possono migliorarne l'applicabilità. Ad esempio, la regolazione dell'angolo di inversione dell'acquisizione NMR può bilanciare l'intensità del segnale e il decadimento della polarizzazione per ottimizzare la raccolta dei dati. Inoltre, sebbene sia stato introdotto un metodo per preparare stabilmente gel di alginato di una certa dimensione, la dimensione dei gel da creare può essere facilmente regolata selezionando una siringa o un ago. Questo può contribuire a riprodurre un ambiente ipossico²⁴ oltre a prevenire la fuoriuscita delle cellule dal tubo NMR. Inoltre, il gel di alginato diventa denso e viscoso all'interno del tubo NMR, soprattutto nell'area di misurazione NMR. Se l'aria penetra durante l'iniezione del terreno di coltura o della sonda iperpolarizzata dal tubo in PEEK, è probabile che rimanga nel sito di misurazione NMR, il che porterà a una diminuzione della qualità dello spettro.

Limitazioni del metodo
Sebbene le misure iperpolarizzate abbiano il vantaggio di un'elevata sensibilità dei segnali NMR, hanno dei limiti intrinseci. A causa del rilassamento T₁ del ^{piruvato iperpolarizzato di 13}C, la durata delle misurazioni metaboliche è limitata a circa 1 minuto, limitando l'osservazione dei cambiamenti metabolici a lungo termine. Inoltre, è difficile misurare un campione di cellule diverse ore dopo che è stato misurato una volta, il che può essere correlato al gocciolamento di una grande quantità di piruvato in una misurazione. Questo è lo stesso del fatto che gruppi imparentati hanno misurato gli spettri un giorno dopo¹⁸, e l'intervallo di misurazione deve essere così lungo.

Importanza del metodo rispetto alle tecniche esistenti
Rispetto ai saggi metabolici convenzionali, il nostro metodo ha un vantaggio rispetto alle misurazioni degli endpoint come la spettrometria di massa e i saggi biochimici in quanto fornisce informazioni in tempo reale sul metabolismo cellulare. Sebbene simili spettri NMR iperpolarizzati possano essere ottenuti senza l'uso di un bioreattore, la capacità di avviare immediatamente le misure con la miscelazione in situ è vantaggiosa, data la rapidità di rilassamento. Inoltre, le cellule possono essere preimpostate in un ambiente stabile prima dell'iniezione, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica dell'analisi metabolica. Questo vantaggio è supportato da un esperimento supplementare (Figura 2 supplementare), in cui gli spettri risolti nel tempo sono stati acquisiti utilizzando un sistema NMR da banco dopo miscelazione esterna. In questa configurazione, un ritardo di circa 30 s tra la miscelazione e l'acquisizione del segnale ha portato a una significativa perdita di polarizzazione, influenzando in particolare la rilevazione del lattato. Ciò conferma che la miscelazione in situ migliora la fedeltà delle misure cinetiche in condizioni con rapido decadimento di T₁ . Tuttavia, vale la pena notare che l'intensità del segnale in questa configurazione in situ era inferiore, probabilmente a causa della diluizione causata dalla perfusione media, un problema che deve ancora essere ottimizzato.

Importanza e potenziali applicazioni
Questo metodo può aprire la strada ad applicazioni nella comprensione delle proprietà metaboliche di diverse forme di vita. La misurazione in tempo reale dei flussi metabolici consente ai ricercatori di valutare dinamicamente gli effetti degli inibitori metabolici. L'integrazione di questo approccio con altre tecniche di misurazione può migliorare ulteriormente l'accuratezza dell'analisi del metabolismo intracellulare.

Immaginiamo un flusso di lavoro sperimentale pratico in cui la metabolomica distruttiva e ad alto rendimento viene utilizzata per identificare i percorsi candidati, seguita da una convalida in tempo reale utilizzando la NMR ^{iperpolarizzata 13}C per valutare la funzione enzimatica e la dinamica del flusso nelle cellule viventi. Questo approccio consente il rilevamento diretto delle risposte metaboliche transitorie in condizioni fisiologiche, cosa difficile da ottenere utilizzando saggi immunologici o sensori a fluorescenza, che in genere misurano i livelli di metaboliti statici o richiedono sonde esogene. Mentre l'imaging a fluorescenza e i saggi immunologici sono indispensabili rispettivamente per la localizzazione spaziale e lo screening ad alto rendimento, la risonanza magnetica magnetica iperpolarizzata fornisce una lettura funzionale complementare che cattura la cinetica di reazione in modo non distruttivo. Questa strategia non solo facilita le intuizioni meccanicistiche a livello cellulare, ma funge anche da ponte verso applicazioni diagnostiche su scala tissutale o dell'organismo. In particolare, la capacità di catturare cambiamenti metabolici funzionali in tempo reale può supportare la diagnosi precoce di disturbi metabolici e risposte terapeutiche in sistemi biologici complessi.

Sono stati compiuti progressi anche nello sviluppo di sonde metaboliche mirate a diverse vie metaboliche e substrati sintetici progettati per enzimi specifici, ampliando le possibilità per la ricerca metabolica^25,26. Inoltre, i progressi nelle tecniche di iperpolarizzazione, come la somministrazione di substrati iperpolarizzati direttamente dal polarizzatore all'NMR attraverso un tunnel magnetico²⁷, possono migliorare la ritenzione del segnale e ampliare le potenziali applicazioni di questo metodo nella ricerca biomedica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acido piruvico [1-13C]	Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.	CLM-8077
Stampante 3D	Elegoo	Saturno 2
Cloruro di calcio	Nacalai Tesque, Inc.	06729-55
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Kit di circolazione esterna per pompa	COME UNO	1-4141-02
Siero fetale bovino	Gibco	10270106
Set di raccordi senza flangia	Scienze GL Inc.	6010-46390
Capillare in vetro con nucleo	Narishige	GDC-1.5	Diametro interno ~0,9 mm, lunghezza 90 mm
Pompa di circolazione magnetica	COME UNO	1-4141-01
MestReNova	Ricerca Mestrelab		Software per l'elaborazione e l'analisi spettrale NMR
La mia siringa	Nipro Corporation	8277	0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 pz
OX063	Strumenti di Oxford Co. Ltd. e Polarize IVS Co. Ltd.	-
Tubo in PEEK	COME UNO	3-780-05
penicillina-streptomicina	Nacalai Tesque, Inc.	26252-94
Mini pompa peristaltica Bio	ATTO	1221200	Alta precisione, tipo ad ampia portata per un flusso medio stabile
Resina	Tecnologia Siraya	Nero fumé
RPMI-1640 Medio	Nacalai Tesque, Inc.	30264-85
Setto per fiala in silicone/PTFE	Scienze GL Inc.	1030-50009
Alginato di sodio 80-120	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	194-13321
Programmi SPINit	RS2D		Software NMR nel polarizzatore DNP
Spugna	-	-	Spugna disponibile in commercio tagliata a misura per la stabilizzazione del gel
Rubinetto a tre vie	COME UNO	3-6247-04
Topspin	Bruker		Software di acquisizione ed elaborazione dati NMR
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher Scientifico	07086-74
Resina polimerizzabile UV	BONDIC	BD-SKCJ
Bagno d'acqua	COME UNO	1-5832-41	Robot Termico TR Serie TR-1α per il mantenimento di 37 gradi Temperatura C
Wilmad Tubo NMR con tappo a vite	Sigma	Z271977	Frequenza 400 MHz, diametro 10 mm, lunghezza 178 mm.