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Articolo metodologico

Organoidi corneei derivati da iPSC specifici per pazienti per l'indagine sui disturbi corneali associati all'aniridia

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DOI:

10.3791/68556

⸱

28 luglio 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per generare organoidi corneani da iPSC derivati da pazienti con aniridia, creando un modello specifico per paziente per studiare i disturbi corneali. Questi organoidi imitano caratteristiche strutturali e funzionali chiave, fornendo una piattaforma affidabile in vitro per indagare i meccanismi delle malattie, testare potenziali trattamenti e promuovere approcci rigenerazionali personalizzati per le malattie anteriori degli occhi.

Abstract

L'aniridia è una rara malattia congenita dell'occhio caratterizzata da una parziale o totale assenza dell'iride, ed è spesso associata all'opacizzazione corneale e alla carenza di cellule staminali limbali. Le mutazioni genetiche sottostanti, che influenzano principalmente il gene PAX6, interrompono sia lo sviluppo che la funzione della cornea. Le caratteristiche oculari più comuni, oltre ai difetti dell'iride, sono nistagmo, ipoplasia foveale, cataratta, glaucoma e cheratopatia associata all'aniridia (AAK). Sebbene i modelli in vivo offrano preziose intuizioni sulla patologia dell'aniridia, i modelli in vitro derivati dal paziente sono fondamentali per indagare i meccanismi della malattia e valutare potenziali terapie. In questo studio, presentiamo un modello AAK in vitro utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate dal paziente. Il nostro protocollo prevede la differenziazione graduale degli iPSC in cellule simili a epiteliali corneali all'interno di organoidi tridimensionali autoassemblati, che imitano il microambiente corneale nativo. Attraverso l'ottimizzazione delle condizioni della coltura di differenziazione, abbiamo generato con successo organoidi corneali che ospitano distinte popolazioni cellulari corneali, ricapitolando le caratteristiche strutturali e funzionali chiave della cornea umana.

Introduzione

La cornea è un tessuto avascolare e trasparente che forma lo strato più esterno dell'occhio, composto principalmente da tre strati: uno strato epiteliale esterno, uno strato stromale contenente una matrice extracellulare ricca di collagene popolata da cheratociti, e uno strato cellulareendoteliale 1. La cornea svolge un ruolo essenziale nella visione proteggendo le strutture oculari interne e rifrattando la luce.

Gli aniridi sono un raro disturbo panoculare congenito causato principalmente da mutazioni eterozigoti nel gene a scatola accoppiata 6 (PAX6), un regolatore principale dello sviluppo oculare, e si caratterizza per l'assenza parziale o completa dell'iride2. Oltre all'ipoplasia o all'assenza dell'iride, la maggior parte dei pazienti sviluppa anomalie corneali progressive denominate collettivamente come cheratopatia associata all'aniridia (AAK), che includono difetti epiteliali, disfunzione delle cellule staminali limbari, alterazioni stromali e progressiva opacizzazione corneale, che porteranno infine a un deficit visivo. L'AAK colpisce circa il 78%–90% dei pazienti con aniridia, con una gravità crescentenel tempo 3. Il nostro obiettivo era stabilire un protocollo dettagliato e riproducibile per generare organoidi corneei da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da pazienti con aniridi, al fine di modellare alterazioni corneali rilevanti per la malattia in vitro. Sebbene i modelli animali e gli studi ex vivo abbiano fornito preziose informazioni sulla patogenesi degli aniridi, le differenze specifiche per specie e l'accesso limitato ai tessuti dei pazienti ne limitano la rilevanza traslazionale.

Gli organoidi umani derivati da iPSC sono emersi come potenti sistemi in vitro per modellare lo sviluppo umano e le malattie 4,5. Gli organoidi corneali, in particolare, permettono la generazione di strutture tridimensionali simili a tessuti che assomigliano maggiormente all'architettura corneale nativa, inclusa l'organizzazione epiteliale stratificata, le interazioni stromali-epiteliali e la deposizione della matrice extracellulare, rispetto alle colture monostrato bidimensionali convenzionali, che mancano di organizzazione spaziale, interazioni fisiologiche cellula-cellula e complessitàmicroambientale 4,5. Diverse strategie di differenziazione, tra cui approcci basati su SEAM e basati su progenitori oculari, sono state segnalate come le persone che generano tessuti simili alla cornea a partire dagliiPSC 6. Questi approcci prevedono tipicamente una fase iniziale di induzione della linea oculare, seguita da una specificazione progressiva del tessuto e dalla selezione da popolazioni eterogenee di progenitori oculari. La creazione di organoidi corneali offre l'opportunità di studiare diversi tipi cellulari presenti nel tessutocorneale 7,8. Inoltre, gli organoidi corneei derivati da iPSC dei pazienti con aniridia permettono di studiare il background genetico della malattia e offrono un'opportunità unica per studiare gli aniridi.

Nel protocollo attuale, sia le linee iPSC di tipo selvatico che quelle derivate da aniridia sono sottoposte a una strategia di differenziazione identica e multi-stadio, che coinvolge l'esposizione sequenziale alla differenziazione (DM), alla differenziazione retinica (RDM) e ai mezzi di differenziazione corneale (CDM) per un periodo di coltura prolungato di settimane. Un passo sperimentale cruciale è la transizione dalla coltura aderente alle condizioni di sospensione, durante le quali vengono mantenute alcune regioni simili alla cornea per promuovere l'auto-organizzazione epiteliale.

Sebbene questo approccio supporti la generazione riproducibile di strutture epiteliali simili alla cornea adatte alla modellizzazione comparativa della malattia, non riproduce completamente caratteristiche complesse in vivo come l'innervazione neurale o l'organizzazione completa della nicchia limbale, che dovrebbero essere considerate nella valutazione dell'applicabilità del metodo.

In questo contesto, descriviamo un protocollo standardizzato per generare organoidi corneanici da iPSC derivati dal paziente portanti mutazioni PAX6 associate ad aniridi. È importante notare che la strategia di differenziazione stessa non è modificata tra linee di tipo selvatico e derivate da aniridia; invece, fenotipi specifici per malattia emergono dal background genetico specifico del paziente all'interno di un quadro sperimentale altrimenti uniforme.

Nel complesso, questo metodo fornisce una piattaforma robusta e riproducibile per lo studio dello sviluppo corneale e dei meccanismi associati alle malattie di aniridi, e potrebbe servire da base per futuri studi meccanicistici e traslazionali.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state svolte in conformità con le linee guida del comitato etico. Lo studio è stato registrato nel database Human Pluripotent Stem Cell Registry (hPSCreg) e le approvazioni etiche sono state documentate sotto il Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation (MESRI; IE-2018-967)9. Gli iPSC sono designati con i codici AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) e WT (dai donatori sanitari). Inoltre, il comitato etico dell'Università di Hacettepe ha approvato l'uso di questa ricerca, come indicato dal numero di riferimento 16969557-1213. Le linee cellulari umane utilizzate in questo studio richiedevano un'autorizzazione regolatoria nazionale al momento dell'acquisizione. L'approvazione è stata concessa nell'ambito di un quadro di consorzio in cui uno degli autori era coinvolto. Sebbene il presente manoscritto non sia direttamente collegato a quel progetto del consorzio, i materiali biologici utilizzati sono stati ottenuti e autorizzati all'interno di tale quadro etico. Pertanto, l'approvazione di questa università è stata giustamente citata per garantire piena trasparenza normativa. Tutti i dettagli relativi ai materiali, reagenti e apparecchiature utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite all'interno di un gabinetto a flusso laminare (BSL-2) per mantenere un ambiente sterile. Questa configurazione garantisce che tutti i materiali e le attrezzature utilizzati nello studio siano adeguatamente sterilizzati, minimizzando così il rischio di contaminazione e garantendo l'integrità dei risultati sperimentali.

1. Generazione di organoidi corneaei derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)

  1. Mantenimento e coltura iniziale di cellule staminali pluripotenti umane indotte dal paziente di aniridia (AAK1, AAK2, AAK3)10 su mezzi condizionati senza alimentazione (Figura 1)
    1. Preparare in anticipo quanto segue: Rivestire un pozzo in una piastra a 6 pozzi con 1 mL di una soluzione di matrice extracellulare (ECM) ghiacciata a una concentrazione di 0,1 mg/mL. Questa procedura di rivestimento deve essere applicata sul ghiaccio, non per solidificare l'ECM, e deve essere lasciata incubare a 37 °C per una durata minima di 30 minuti, rispettando le istruzioni del produttore per garantire una corretta preparazione del substrato.
    2. Scongelare una aliquota criopreservata di 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). Non scongelare completamente le cellule congelate; invece, lascia che la sospensione cellulare congelata nel cryovial si scongeli finché circa metà del volume rimane congelata.
    3. Trasferire immediatamente la sospensione parzialmente scongelata in 1 mL di mezzo di mantenimento completo a temperatura ambiente (RT) contenente 10 μM inibitori della proteina chinasi associata alla Rho (ROCK), pre-allicitati in un tubo da 15 mL. Non usare alcuna pipetta durante il trasferimento.
    4. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti e scarta il soprantantante.
    5. Successivamente risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di mantenimento completo contenente un inibitore ROCK da 10 μM.
    6. Determina la densità cellulare con l'esclusione del blu di tripano. Contare le cellule usando un emocitometro dopo aver colorato la vitalità con il blu di tripano. In breve, mescolare 20 μL di sospensione della cella 1:1 con 20 μL di blu tripano allo 0,4%, seguiti dall'aggiunta di 60 μL di PBS, ottenendo una diluizione finale 1:5 della sospensione originale della cella. Da questa miscela, si caricano 10 μL nella camera dell'emocitometro. Contare le cellule vitali (tripano blu–negativo) in quattro grandi quadrati. Calcola il numero medio di celle per quadrato e moltiplica per 5 (fattore di diluizione della sospensione cellulare) e 10.000 per determinare la concentrazione cellulare finale (cellule/mL).
      Celle/mL = (Numero medio di celle per quadrato) x 5 x 104
    7. Semina le cellule su un pozzo ECM pre-rivestito in una piastra a 6 pozzi, garantendo una densità cellulare di 2 x 104 cellule/cm 2 per pozzo.
    8. Osserva la morfologia e l'attacco cellulare usando microscopia a contrasto di fase a ingrandimento 10x. Successivamente, incubare le placche a 6 pozzi a 37 °C con il 5% di CO₂ per garantire condizioni ottimali di crescita.
      NOTA: L'inibitore ROCK deve essere usato solo durante la notte durante il passaggio o lo scongelamento delle cellule. Durante i cambi giornalieri del substrato, aggiungi delicatamente il substrato lungo la parete del pozzo. Evita di riscaldare il mezzo di mantenimento completo in un bagno d'acqua; invece, bilanciare il mezzo a temperatura ambiente per 15 minuti prima dell'uso.
  2. Fase di differenziazione spontanea (Giorno 0 – 2)
    1. Prepara il mezzo di differenziazione (DM) mescolando i seguenti elementi: 8% di KnockOut Serum Replacement (KSR), 1x amminoacidi non essenziali (NEAA), 1x Glutammax, 1x Penicillin-Streptomycin, e Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F-12).
    2. Quando le colture di hiPSC raggiungono circa il 70%–80% di confluenza, per indurre la differenziazionespontanea 8, aspirare dolcemente e scartare completamente il mezzo, quindi sostituirlo quotidianamente con 1 mL di DM fresco per pozzo fino al Giorno 3, quando viene avviata la fase di differenziazione retinica secondo la timeline sperimentale.
  3. Fase di differenziazione retinica (Giorno 3 – 47)
    NOTA: Il mezzo di differenziazione retinica viene utilizzato per lunghi periodi per permettere la formazione di popolazioni oculari progenitori eterogenee.
    1. Prepara il mezzo di differenziazione retinica (RDM) mescolando i seguenti elementi: 8% KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 2% B27, 1x Penicillina-Streptomycina e DMEM/F-12.
    2. Dopo 2 giorni di differenziazione spontanea, si rinfresca quotidianamente il substrato di coltura aspirando con cura il mezzo DM e sostituendolo con 1 mL di mezzo RDM fresco per pozzo. Continua così per un totale di 30 giorni.
      NOTA: È previsto un aumento significativo della densità cellulare durante questo periodo di 30 giorni. È essenziale effettuare osservazioni microscopiche della densità cellulare in diverse aree di ciascun pozzo. Per prevenire il sollevamento cellulare, bisogna evitare il lavaggio e prestare attenzione durante i cambi di mezzo. Aggiungi il materiale attraverso la parete del pozzo. Bilancia il mezzo a RT per 15 minuti prima dell'uso.
    3. Al giorno 32, le cellule raggiungono uno stato apparente di confluenza e formano aggregati 2.5D multistrati. A questo punto, avvia la transizione alla coltura a sospensione raschiando delicatamente l'intero pozzo usando una punta di pipetta da 1000 μL. Durante questo processo, frammenta lo strato cellulare in piccoli grappoli.
      NOTA: Sebbene tutte le cellule vengano rilasciate dalla superficie della coltura, gli aggregati multistrato 2.5D vengono raccolti e trasferiti preferenzialmente in coltura in sospensione (Figura Supplementare 1), poiché il loro arricchimento favorisce un autoassemblaggio più rapido e la formazione di organoidi più grandi rispetto a cellule singole o frammenti monostrato.
    4. Immediatamente dopo la raschiatura, raccogliere i cluster cellulari risultanti e trasferirli in piastre di coltura a basso attacco a 6 pozzi contenenti RDM per stabilire le condizioni di coltura in sospensione.
    5. Mantenere le cellule in coltura in sospensione per ulteriori 15 giorni, con sostituzione giornaliera del mezzo utilizzando 2 mL di RDM fresco per pozzo. Durante i primi 2 giorni di coltura in sospensione, evitare il cambiamento del medio per evitare la perdita di piccoli cluster cellulari. Durante la coltura in sospensione, le cellule si auto-organizzano gradualmente e danno origine a strutture 3D, trasparenti, simili alla cornea, monitorate regolarmente tramite microscopia a contrasto di fase a ingrandimenti 4x e 10x.
  4. Fase di differenziazione corneale (Giorno 48 – 90)
    1. Prepara il mezzo di differenziazione corneale (CDM) mescolando i seguenti elementi: 8% KOSR, 1x NEAA, 1x Glutammax, 1x N2-MAX, 1x Insulina-Transferrina-Selenio, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF e DMEM/F-12.
    2. Dopo i primi 15 giorni (dal giorno 32 al giorno 47) di coltura della sospensione in piastre a basso attacco (37 °C, 5% CO₂), sostituire la RDM con la CDM mantenendo gli aggregati in condizioni di sospensione al giorno 47. Rinfrescare il CDM a giorni alterni con 2 mL per pozzo, assicurandosi che gli organoidi siano sempre completamente sommersi nel mezzo di coltura. Durante questo periodo, emergono progressivamente strutture primordiali corneali (CP) trasparenti e simili a bolle.
    3. Continuare la coltura in sospensione in CDM fino al giorno 90, permettendo una maggiore maturazione e segregazione spaziale delle regioni CP trasparenti da compartimenti tissutali più opachi.
    4. Al giorno 90, separare meccanicamente le regioni CP trasparenti dai compartimenti tessuti più opachi utilizzando pinze e pinzette sterilizzate quando si prevedono analisi specifiche a valle specifiche per CP.
      NOTA: L'isolamento meccanico delle regioni CP viene eseguito quando le analisi richiedono specificamente strutture arricchite da CP. Se altri compartimenti tissutali o l'architettura organoide complessiva sono di interesse, gli organoidi possono essere mantenuti intatti per preservare l'eterogeneità strutturale.
    5. Continuare la coltura di sospensione in CDM per strutture CP isolate o organoidi intatti, a seconda dell'obiettivo sperimentale.

2. Caratterizzazione degli organoidi corneali

  1. Valutazione morfologica e strutturale degli organoidi
    1. Monitorare regolarmente gli organoidi corneei usando microscopia a campo chiaro a ingrandimenti 4x e 10x. Valutare dimensioni, trasparenza e morfologia complessiva in momenti temporali definiti e documentare i cambiamenti strutturali tramite l'acquisizione dell'immagine.
  2. Caratterizzazione basata sull'immunofluorescenza
    1. Fissazione dell'organoide corneale
      1. Prepara soluzioni al 4% di PFA e al 30% di saccarosio prima della fissazione. Prendi l'organoide corneae dalla coltura con una scoopera autoclaviata. Trasferire l'organoide nel PFA al 4% in un tubo da 1,5 mL e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
      2. Dopo l'incubazione, si elimina con cura il PFA dal tubo senza danneggiare l'organoide corneacale. Aggiungi 1 mL di soluzione di saccarosio al 30% nel tubo e posizionalo a 4 °C. Dopo 24 ore, preparare e etichettare tubi da 5 mL e azoto liquido per la fissazione dell'OCT.
      3. Scarta con cura la soluzione di saccarosio dal tubo. Trasferire l'organoide nella cucchiera sterile. Con una pipetta da 20 μL, rimuovere con cura la soluzione di saccarosio in eccesso dall'organoide.
      4. Versa OCT nel tappo del tubo da 5 mL e inserisci l'organoide nell'OCT. Usa un altro scooper sterile per trasferire l'organoide nel cappuccio contenente OCT.
      5. Aggiungi OCT per coprire la superficie dell'organoide corneale. Inserire i palloncini nell'OCT con un ago per ottenere sezioni chiare dell'organoide.
      6. Chiudi il tappo dei tubi da 5 mL e usa una pinzetta per immergere l'azoto liquido. Conservare i campioni a -20 °C fino alla sezionazione.
      7. Tagliali a 5 μm di spessore usando un criostato e conservali anche a -20 °C fino alla colorazione. Mantieni uno spessore della sezione e un'orientazione dei tessuti costanti per garantire una colorazione riproducibile.
    2. Colorazione IF
      1. Per preparare le sezioni organoidi corneache per la colorazione IF, lava le vetrine 3 volte con PBS-T (0,3% Triton X-100) a RT per 10 minuti.
      2. Pulisci il vetrino con carta velina e crea un bordo con una penna PAP. Aggiungere una quantità adeguata di soluzione bloccante per coprire completamente la sezione tissutale (tipicamente 100 – 200 μL per vetrina, a seconda del confine della penna PAP) e incubarla a RT per 1 ora.
      3. Aspira la soluzione di blocco e crea un bordo con la penna PAP. Aggiungere i 150 μl di soluzioni primarie di Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPasi, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, i tassi di diluizione sono elencati nella Tabella dei Materiali) sul vetrino e incubarlo a RT per 1 ora.
      4. Lava 2 volte con PBS-T (0,3% Triton X-100) a RT per 10 minuti. Rifai il bordo con una penna PAP.
      5. Aggiungere i 150 μl di soluzione secondaria di Ab (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, i tassi di diluizione sono elencati nella Tabella dei Materiali) sul vetrino e incubarlo a RT in condizioni di buio per 2 ore. Lava 2 volte con PBS-T (0,3% Triton-X) a RT per 10 minuti. Pulisci le guide e monta con soluzione DAPI.
      6. Per gli iPSC non differenziati, esegui bloccaggio e permeabilizzazione dopo la fissazione e procedi con la colorazione utilizzando lo stesso protocollo. Visualizza i campioni colorati usando microscopia a fluorescenza o confocale a ingrandimenti 4x e 10x.

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Risultati

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno rivelato nulla.

Ringraziamenti

Questo studio è finanziato da TÜBİTAK 121N276 e dal Programma Congiunto Europeo sulle Malattie Rare e parzialmente supportato dall'Unione Europea (Programma Chair ERA Horizon 2020, RareBoost Project Grant n.952346). L'A.C.K. è sostenuta dalla borsa di studio di dottorato YÖK 100/2000 e dalle borse di studio TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 mL serological pipettesZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150Intervallo di diluizione: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152Intervallo di diluizione: 1:100 - 1:800
Autoclave VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010con vitamina A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscope DMI1OlympusCKX41
Biological Safety Cabinets Class IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol dilutions
Extracellular Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtome RM2235LeicaRM2235
Mounting mediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Culture Plates (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 and P1000 pipettesGilsonF167350
ParaffinVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antibody Aquaporin mAbabcamab9566Intervallo di diluizione: 1:50-1:200
Primer Antibody CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253Intervallo di diluizione: 1:50-1:500
Primer Antibody CK19ProteinTech14965-1-APIntervallo di diluizione: 1:150-1:600
Primer Antibody CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLIntervallo di diluizione: 1:50-1:200
Primer Antibody CK5Thermo MA517057Intervallo di diluizione: 1:200-1:1000
Primer Antibody Collagen Type IVabcamab6586Intervallo di diluizione: 1:100-1:500
Primer Antibody KeratocanBiossbs-11054RIntervallo di diluizione: 1:50-1:200
Primer Antibody Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Intervallo di diluizione: 1:50-1:500
Primer Antibody N-Cadherinabcamab76011Intervallo di diluizione: 1:50-1:500
Primer Antibody p63SANTACRUZ   sc-25268Intervallo di diluizione: 1:50-1:500
Primer Antibody Pax6NovusNBP2-44576Intervallo di diluizione: 1:50-1:200
RNA isolation kitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inihibitor (Y-27632)TOCRIS1254
SlidesStarFrostMBB-0302-55AAdesivo, macinato
Stainless steel forceps no:5Sigma F6521-1EA
Stainless Stell Scalpel Sterile N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthesis Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagentThermo15596026
Trypan blueGIBCO15250061
Ultra low attachment (ULA) 6-well  plate Corning3471
Water bathNüveNb9

Riferimenti

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