Flusso di lavoro ottimizzato per l'isolamento e la coltura a lungo termine di cellule di glioma derivate da pazienti che conservano le caratteristiche tumorali originali

Sommario

Questo studio presenta un protocollo standardizzato per la creazione di linee cellulari di glioma derivate da pazienti (PDGC), garantendone la fedeltà genetica e fenotipica. Il sistema di coltura aderente assistito da estratto della matrice della membrana basale migliora la crescita e l'omogeneità cellulare, rendendo questi modelli preziosi per lo screening dei farmaci e la ricerca sul GBM.

Abstract

Il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primitivo più aggressivo, caratterizzato da elevata eterogeneità e resistenza alle terapie standard. Le linee cellulari tradizionali di glioma spesso non riescono a mantenere le caratteristiche genetiche e fenotipiche specifiche del paziente, limitando la loro rilevanza traduzionale. Per affrontare questo problema, abbiamo creato 50 linee cellulari di glioma derivate da pazienti (PDGC) utilizzando un sistema di coltura di cellule staminali neurali prive di siero. Questo protocollo delinea la raccolta, l'elaborazione e la coltura a lungo termine di campioni tumorali ottenuti da pazienti con GBM, garantendo la conservazione delle caratteristiche molecolari chiave. La nostra metodologia comprende la dissociazione enzimatica del tessuto, la lisi dei globuli rossi e la coltura aderente assistita da estratto di matrice della membrana basale, che migliora la vitalità cellulare e facilita lo screening dei farmaci ad alto rendimento. La caratterizzazione delle PDGC attraverso il sequenziamento dell'intero genoma e la trascrittomica e la colorazione in immunofluorescenza confermano la loro conservazione delle comuni alterazioni genetiche del GBM e dei marcatori delle cellule staminali neurali e dei progenitori. Inoltre, queste cellule mostrano un potenziale tumorigenico in modelli di xenotrapianto. Ottimizzando le condizioni di coltura, questo protocollo fornisce un quadro standardizzato per la generazione di modelli di GBM biologicamente rilevanti per supportare la scoperta terapeutica e gli studi meccanicistici.

Introduzione

Il glioma, il tumore intracranico primario più comune, origina da cellule staminali neurali o progenitrici che hanno subito mutazioni genetiche¹. L'Organizzazione Mondiale della Sanità classifica i gliomi in gradi 1-4 in base a caratteristiche patologiche e molecolari, che vanno dal basso grado all'alto grado². Il glioblastoma (GBM), un glioma di grado 4, rappresenta circa il 57% di tutti i gliomi e il 48% di tutti i tumori maligni primari del sistema nervoso centrale³. I pazienti con GBM affrontano una prognosi infausta, con un tempo di sopravvivenza mediano inferiore a 2 anni e un tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo il 5,4%⁴. Il trattamento standard prevede la massima resezione sicura seguita da radioterapia e chemioterapia con temozolomide⁵. Nonostante questi interventi, il GBM rimane incurabile a causa della sua natura infiltrativa e della resistenza intrinseca alle terapie, creando un urgente bisogno di nuovi approcci terapeutici.

I ricercatori utilizzano comunemente linee cellulari tumorali di derivazione umana come modelli per studiare lo sviluppo del cancro e i meccanismi terapeutici. Tuttavia, le linee cellulari di glioma classiche mantenute in terreno contenente siero e ampiamente passate in vitro mostrano alterazioni significative nelle caratteristiche fenotipiche e nei profili genetici rispetto ai tumori dei pazienti ^6,7,8. Di conseguenza, i modelli di screening preclinico basati su queste linee cellulari spesso non riescono a identificare bersagli terapeutici e molecole che si traducono efficacemente in contesti clinici. Il successo del trattamento con GBM è ulteriormente complicato dall'eterogeneità e dalla plasticità del tumore⁹. Questa eterogeneità si manifesta non solo nei sottotipi trascrittomici (ad esempio, proneurale, mesenchimale) ma anche nei diversi stati di sviluppo delle cellule costituenti¹⁰. Il GBM impiega meccanismi di sviluppo neurologico e contiene sottopopolazioni di cellule staminali di glioblastoma (GSC) che guidano la proliferazione tumorale e mostrano una maggiore resistenza alla radioterapia e alla chemioterapia^11,12. La coltura di cellule di glioma derivate da pazienti in un terreno di cellule staminali neurali prive di siero preserva efficacemente lo spettro di mutazione e i modelli di espressione genica del tumore originale, mantenendo le caratteristiche parziali della GSC⁸.

Rispetto ai modelli di coltura della neurosfera, la coltura aderente assistita da estratto di matrice della membrana basale promuove una crescita cellulare più stabile e rapida, rendendola più adatta per lo screening chimico e genetico¹³. Utilizzando questo approccio, abbiamo stabilito 50 linee cellulari di GBM derivate da pazienti e le abbiamo caratterizzate attraverso il sequenziamento dell'intero genoma, il sequenziamento trascrittomico e lo screening delle librerie di farmaci della FDA per esplorare potenziali strategie terapeutiche. Questa risorsa fa progredire la ricerca sul glioma, con risultati dettagliati pubblicati nei nostri studi precedenti¹⁴. Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per sviluppare linee cellulari di glioma derivate da pazienti (PDGC).

Protocollo

Questo protocollo utilizza campioni di glioma, tessuto e sangue derivati da pazienti ottenuti attraverso collaborazioni ospedaliere. Tutte le procedure di campionamento e i protocolli sperimentali hanno ricevuto l'approvazione dal Comitato Etico del Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (KY 2020-093-02 e KY 2014-021-02). I pazienti forniscono il consenso informato firmato prima dell'intervento chirurgico e tutte le informazioni sull'identità vengono sottoposte a anonimizzazione prima che i campioni vengano trasferiti al laboratorio. I ricercatori devono ottenere l'approvazione del loro comitato etico istituzionale e ottenere il consenso del paziente prima di attuare questo protocollo.

1. Preparazione prima dell'elaborazione del campione

1. Sterilizzare forbici, pinzette e altri strumenti mediante sterilizzazione in autoclave.
2. Preparare il terreno di coltura PDGC combinando 47,5 mL di DMEM/F12, 500 μL di N2, 1 mL di B27, 500 μL di 100x Penicillina/Streptomicina, 250 μL di 100x sostituto della glutammina, 100 μL di 2,5 M HEPES, 100 μL di glucosio al 30%, 50 μL di 50 mM β-mercaptoetanolo, 1,5 mL di 1 μg/mL di fattore di crescita epidermico (EGF), e 1,5 mL di 1 μg/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF).
3. Preparare 1 tampone per lisi dei globuli rossi (ACK) sciogliendo 8,29 g di cloruro di ammonio, 1 g di bicarbonato di potassio e 37 mg di EDTA in acqua, quindi diluendo a 1 L.
4. Posizionare gli strumenti sterilizzati, il tampone PBS, i contenitori per i rifiuti, le provette da centrifuga e altri materiali di consumo in una cabina di biosicurezza ed eseguire la disinfezione UV per 30 minuti.
5. Mettere l'azoto liquido in un contenitore isolato.

2. Raccolta del campione del paziente

NOTA: Condurre tutte le procedure di raccolta dei tessuti in condizioni rigorosamente sterili per prevenire la contaminazione batterica delle colture cellulari successive. Mantenere la tecnica asettica durante l'intero flusso di lavoro.

1. Raccogliere campioni di sangue prima dell'intervento e asportare il tessuto tumorale dal cervello del paziente. Per i tumori di grandi dimensioni e altamente infiltrativi in cui è difficile distinguere il tumore dal tessuto normale circostante, massimizzare la resezione del tessuto peritumorale preservando le aree cerebrali funzionali critiche. Separare circa 500-2.000^mm3 di tessuto centrale tumorale e inserirlo in provette da centrifuga da 15 mL contenenti 10 mL di terreno di conservazione ipotermico.
2. Sigillare le provette del campione, metterle in una ghiacciaia e trasportarle rapidamente in laboratorio per l'elaborazione.
   NOTA: Assicurarsi che l'intervallo tra la raccolta del campione e l'elaborazione non superi le 6 ore a 4 °C. Durante la raccolta del campione, escludere accuratamente il tessuto bruciato e le aree di necrosi tumorale. La superficie delle incisioni tissutali è spesso bruciata dalla lama elettrica utilizzata durante l'intervento chirurgico, il che può compromettere la vitalità cellulare in coltura.

3. Elaborazione dei campioni di sangue

1. Centrifugare le provette per campioni di sangue a 1.000 × g per 10 minuti ed eliminare lo strato superiore di plasma.
2. Trasferire lo strato rimanente di globuli bianchi e globuli rossi in una provetta da centrifuga da 50 mL. Aggiungere 10 ml di 1x ACK e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per lisare i globuli rossi.
3. Aggiungere 40 ml di PBS per terminare la lisi, mescolare delicatamente e centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti.
4. Scartare il surnatante, aggiungere 3 ml di 1x ACK e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per una seconda fase di lisi dei globuli rossi.
5. Aggiungere 12 mL di PBS per terminare la lisi, mescolare delicatamente e centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti.
6. Scartare il surnatante, risospendere il pellet di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in 1 mL di PBS, trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 510 × g per 10 min.
7. Scartare il surnatante, congelare il pellet PBMC in azoto liquido e conservare a -80 °C.

4. Lavorazione del tessuto tumorale

1. Rimuovere la soluzione di conservazione dei tessuti dalla provetta del campione e lavare il tessuto in PBS per rimuovere i coaguli di sangue visibili e il tessuto necrotico. Eseguire un secondo lavaggio PBS sul tessuto rimanente.
2. Tagliare la parte di tessuto più intatta e fissarla per una notte in paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C.
   NOTA: La dimensione del tessuto fissato è di circa 10 mm. Saltare questo passaggio se il campione è piccolo.
3. Tagliare 2-4 piccoli pezzi di tessuto, trasferirli in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, congelarli in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
   NOTA: La dimensione di piccoli pezzi di tessuto varia tipicamente da 5 a 10 mm, a seconda della quantità di DNA e RNA necessaria per il sequenziamento.
4. Mettere il tessuto tumorale rimanente in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e tritare fino a ottenere una pasta fine usando le forbici mantenendo il ghiaccio.
5. Aggiungere 1-3 mL di soluzione per il distacco cellulare e trasferire il tessuto tritato nella provetta per la digestione. Digerire il tessuto utilizzando un dissociatore tissutale a 37 °C per 16 minuti.
6. Aggiungere 3 volte il volume di PBS per arrestare la digestione e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga con un filtro cellulare da 70 μm. Macinare delicatamente il tessuto attraverso il colino con una piccola asta per massimizzare la raccolta cellulare. Centrifugare a 510 × g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
7. Aggiungere 1-3 mL di 1x ACK e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per lisare i globuli rossi. Aggiungere 4 volte il volume di PBS per fermare la lisi, mescolare delicatamente e centrifugare a 510 × g per 10 minuti per rimuovere il surnatante.
8. Risospendere le cellule nel terreno PDGC e seminare parte della sospensione cellulare in piastre di coltura. Porre le piastre in un'incubatrice ipossica a 37 °C. Congelare le cellule rimanenti nel terreno di coltura contenente il 10% di DMSO.
   NOTA: In genere, per campioni di tessuto che misurano circa 10-20 mm, seminiamo da 1/3 a 1/10 della sospensione cellulare in un piatto di 6 cm con 3 mL di terreno di coltura e le cellule rimanenti vengono crioconservate in 2-4 fiale, a seconda della resa cellulare.
9. Rivestire le piastre aggiungendo l'estratto della matrice della membrana basale al PBS ghiacciato in un rapporto 1:100 e incubare le piastre a temperatura ambiente su un incubatore agitatore per 2 ore. Scartare il PBS prima di aggiungere il terreno di coltura PDGC.
   NOTA: Eseguire tutti i successivi passaggi cellulari e colture utilizzando piastre rivestite di matrice di membrana basale.
10. Dopo 2 giorni, trasferire le cellule coltivate su piastre rivestite di matrice di membrana basale rivestite di estratto per consentire l'adesione e la crescita cellulare.

5. Coltura cellulare e passaggio

1. Una volta che le cellule aderiscono alle piastre di coltura, rimuovere le cellule non aderenti e sostituire o integrare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.
   NOTA: La capacità di adesione varia tra le diverse celle. Anche in presenza di estratto della matrice della membrana basale, una piccola frazione di cellule può rimanere non aderente, come BNI7-11, che richiede una coltura continua in sospensione. Inoltre, alcune cellule mostrano un modello di crescita semi-aderente, come BNI20. Pertanto, è essenziale un'attenta osservazione dello stato cellulare. Per le cellule non aderenti, si può notare un aumento delle cellule sospese. Se gli aggregati cellulari appaiono come strutture scure, simili al cotone, e non mostrano cambiamenti significativi nel tempo, sono in genere incapaci di espandersi a lungo termine.
2. Quando le cellule raggiungono la confluenza, aggiungere una soluzione di dissociazione cellulare per staccare le cellule. Terminare la dissociazione con 3x PBS e centrifugare a 250 × g per 3 min. Passaggio delle celle con un rapporto da 1:2 a 1:4. Congelare le cellule rimanenti nel terreno di coltura contenente il 10% di DMSO.
3. Continuare a passare per almeno 10-20 generazioni per stabilire una linea cellulare stabile.
   1. Documenta la morfologia delle celle con immagini durante ogni passaggio e registra i numeri di passaggio. Etichettare chiaramente il congelamento iniziale della cella con informazioni dettagliate (ad esempio, numeri di passaggio).
   2. Una volta che la linea cellulare si è stabilizzata, raccogliere 2-3 provette di pellet cellulari (300.000-1.000.000 cellule/provetta) e conservarle a -80 °C.

6. Operazioni sperimentali successive

1. Per i campioni fissati con PFA, dopo la fissazione notturna, disidratare i campioni attraverso una serie graduata di soluzioni di etanolo mediante immersione sequenziale in etanolo al 60%, etanolo al 70%, etanolo all'80%, etanolo al 90%, etanolo al 95% e due cambi di etanolo al 100%, ciascuno per 40 minuti. Successivamente, eliminare i campioni in due cambi di xilene, ciascuno per 40 minuti, quindi infiltrarli con due cambi di soluzione di paraffina, ciascuno per 40 minuti. Infine, incorporare i campioni disidratati e infiltrati in blocchi di paraffina per il successivo sezionamento e colorazione¹⁵.
2. Per i pellet di PBMC, il tessuto tumorale o i campioni di cellule tumorali conservati a -80 °C, estrarre DNA e RNA per vari studi omici, tra cui il sequenziamento dell'intero genoma, il sequenziamento dell'esoma, il sequenziamento dell'RNA di massa e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, se necessario.
3. Utilizzare linee cellulari PDGC stabili per la creazione di modelli di xenotrapianto di topo, lo screening di farmaci ad alto rendimento, la ricerca sui meccanismi e altri esperimenti correlati.
   1. Per stabilire il modello di xenotrapianto ortotopico intracranico di PDGC, dissociare e contare le cellule, quindi risospenderle in una miscela 1:1 di estratto di matrice di membrana basale e PBS ghiacciato fino a una concentrazione finale di 100.000 cellule/μL. Iniettare 5 μL della sospensione cellulare stereotassicamente nello striato sinistro di topi immunodeficienti di 6-8 settimane utilizzando una microsiringa e uno strumento stereotassico standard. Impostare le coordinate di iniezione relative al bregma come segue: +0,5 mm antero-posteriore (AP), -1,9 mm mediale-laterale (ML) e -3,6 mm dorso-ventrale (DV).
   2. Generare PDGC che esprimono luciferasi e stabilire xenotrapianti intracranici per l'imaging in bioluminescenza della crescita tumorale.
      1. Impacchettare il gene reporter della luciferasi-tdTomato in particelle lentivirali, quindi infettare i PDGC con il lentivirus confezionato per stabilire un'espressione stabile¹⁶.
      2. Dopo l'infezione, selezionare le cellule tdTomato-positive mediante citometria a flusso per ottenere una popolazione cellulare stabile che esprime luciferasi.
      3. Prima dell'imaging, iniettare la D-luciferina per via intraperitoneale alla dose di 10 μL/g di peso corporeo utilizzando una soluzione di D-luciferina da 15 mg/mL. Anestetizzare i topi con isoflurano e attendere 10 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina. Posizionare i topi nel sistema di imaging a bioluminescenza. Impostare il tempo di esposizione in modalità automatica durante l'imaging¹⁷.

Risultati

Nella Figura 1 viene fornita una panoramica completa del flusso di lavoro del protocollo. I campioni dei pazienti includono sangue periferico e tessuto centrale tumorale. I campioni di sangue vengono sottoposti a centrifugazione per rimuovere il plasma seguita da due cicli di lisi ACK per ottenere PBMC che fungono da controlli per le analisi di sequenziamento. I campioni tumorali vengono lavati con PBS per rimuovere i coaguli di sangue e le aree necrotiche prima di essere trasformati in picc...

Discussione

L'eterogeneità del GBM presenta sfide terapeutiche significative. Le linee cellulari convenzionali di GBM spesso sviluppano background genetici omogenei e perdono le caratteristiche tumorali del paziente dopo una coltura prolungata in terreno contenente siero, limitando il loro valore traduzionale. L'ottimizzazione delle condizioni di coltura del GBM e la standardizzazione dei flussi di lavoro di elaborazione dei campioni dei pazienti sono essenziali per massimizzare le limitate risorse ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
70 μ filtro cellulare m	Falcon	352350
Soluzione di distacco cellulare accutasi,	BioLegend	423201
Cloruro di ammonio	, Aladdin	60-92-4
Anticorpo anti-Sox2	Merckmillipore	AB5603
Mezzo di montaggio anti-sbiadimento con DAPI	Beyotime	P0131
anticorpo anti-nestina	NOVUS	NB100-1604
B27 senza integratore vitaminico	Gibco	12587010
BD FACSAria Citometro a flusso a fusione	BD Biosciences	/
Piatto per coltura cellulare	NEST	705001
D-luciferina, sale di potassio	Invitrogen	L2916
DMEM/F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glucosio	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	sostituto della glutammina
Kit di colorazione ematossilina-eosina	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
Human bFGF	Origene	TP750002
EGF umano	Novoproteina	C029-500μ g
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	terreno di conservazione ipotermico
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	bioluminescenza sistema di imaging
Matrigel	Corning	356231	matrice della membrana basale
Microsiringa	Hamilton	80300
N2 Integratore	Gibco	17502048
Nunclon Sphera Piastra a 6 pozzetti	Thermo Scientific	174932	piastre di attacco ultra-basso
Paraformaldeide	Sangon Biotech	A500684-0500
PBS tampone	Solarbio	P1010-100*2L
Penicillina/Streptomicina	Solarbio	P8420/S8290
Bicarbonato di potassio	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD dissociatore tissutale	RWD Life Science	DSC-410
Strumento stereotassico standard	RWD Life Science	68801
Provetta per il trattamento di campioni di tessuto	RWD Life Science	SCT-100
β-mercaptoetanolo	Sigma	M3148-100mL