Articolo metodologico

Caratterizzazione con imaging dal vivo dei movimenti del centromero durante la profase meiotica maschile in Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/68569

⸱

24 ottobre 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il movimento cromosomico durante la profase meiotica è un fenomeno poco compreso che è fondamentale per la formazione delle spore. Questo protocollo descrive un metodo per acquisire, analizzare e quantificare i movimenti del centromero durante la profase meiotica nei meiociti maschi di Arabidopsis thaliana .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La meiosi è una divisione cellulare, essenziale per la riproduzione sessuale. Durante la profase meiotica, i cromosomi omologhi di origine materna e paterna si riconoscono e si associano, un processo che è facilitato dai loro rapidi movimenti nel nucleoplasma. I movimenti meiotici della profase si basano sull'attaccamento dei cromosomi all'involucro nucleare e sulle forze citoplasmatiche trasmesse ai cromosomi attraverso l'involucro nucleare. Nelle piante, l'accessibilità limitata e la fragilità dei meiociti maschili all'interno delle antere rendono tecnicamente impegnativi gli approcci di imaging dal vivo e l'analisi del movimento cromosomico. Infatti, questi movimenti sono molto rapidi e la loro analisi richiede di trovare le condizioni ottimali di acquisizione. Qui, un metodo efficiente per catturare rapidi movimenti cromosomici durante la profase meiotica maschile in Arabidopsis thaliana è descritto, in filmati time-lapse, seguendo i movimenti dei centromeri marcati in fluorescenza. Si basa sulla dissezione delle antere e sull'acquisizione di immagini mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM), in 3D e nel tempo. L'acquisizione di z-stack meiotici ogni 7 s consente una risoluzione sufficiente per ricostruire e analizzare le traiettorie dei centromeri marcati. I dati estratti vengono successivamente elaborati, consentendo l'analisi quantitativa di questi movimenti cromosomici. Lo sviluppo di modelli a partire da questi dati è essenziale per comprendere il meccanismo del rapido movimento dei cromosomi, compresa la natura e l'intensità delle forze che guidano questo processo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La meiosi è un processo biologico fondamentale che garantisce la trasmissione fedele del materiale genetico da una generazione all'altra. Il processo di meiosi è diviso in due cicli successivi di divisione cellulare, meiosi I e meiosi II. La meiosi I è preceduta da una lunga profase durante la quale i cromosomi omologhi si riconoscono e si accoppiano. Durante questa profase estesa, si verificano numerosi processi biologici. Oltre all'accoppiamento di cromosomi omologhi, questi cromosomi subiscono anche un processo chiamato sinapsi. La sinapsi comporta la formazione di un complesso proteico noto come complesso sinaptonemale, che collega i cromosomi omologhi lungo la loro lunghezza. Il complesso sinaptonemale favorisce la ricombinazione omologa, seguita dallo scambio di materiale genetico tra cromosomi omologhi e dalla formazione di crossover. Questi stabiliscono una connessione fisica tra cromosomi omologhi, facilitando il loro corretto allineamento e la segregazione equilibrata 1,2.

Durante il riconoscimento cromosomico omologo, è noto che i movimenti cromosomici rapidi della profase (RPM) svolgono un ruolo cruciale. Studi condotti su diverse specie modello hanno dimostrato che durante il leptotene, i cromosomi si attaccano all'involucro nucleare (NE). Sono collegati al citoscheletro citoplasmatico attraverso il NE, tramite il complesso proteico LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton)3. Le forze generate nel citoplasma vengono trasmesse ai cromosomi attraverso il complesso LINC, consentendo il movimento dei cromosomi.

Lo studio degli RPM è essenziale per comprendere i meccanismi fondamentali della meiosi, in particolare quelli coinvolti nel riconoscimento dei cromosomi omologhi. Tuttavia, lo studio di questi movimenti richiede specifici esperimenti di imaging dal vivo. La maggior parte degli studi di imaging dal vivo in A. thaliana si concentra sui tessuti somatici e sugli organi vegetativi. Questi studi sono stati condotti per determinare come le cellule danno origine agli organi4. Tali studi sono stati condotti sui meristemi5e sulle radici6. Recentemente, alcuni team hanno sviluppato tecniche per osservare lo sviluppo floreale, compresa la meiosi, in tempo reale in A. thaliana per periodi di diversi giorni 7,8. Tuttavia, questi protocolli possono anche essere impegnativi e difficili da configurare per un numero elevato di campioni.

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'imaging di cellule vive e l'analisi della dinamica cromosomica durante la meiosi in A. thaliana. Attraverso l'uso della microscopia confocale, una tecnica semplice per la preparazione del campione, in combinazione con la marcatura fluorescente dei cromosomi, il movimento cromosomico è stato catturato con un'elevata risoluzione spaziale e temporale in brevi periodi di tempo. Il protocollo delinea la preparazione dei tessuti vegetali per l'imaging, l'ottimizzazione dei parametri di imaging per ridurre al minimo la fototossicità e massimizzare la qualità dell'immagine, nonché l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati. Questo metodo consente una quantificazione precisa della dinamica del centromero durante la meiosi, che è fondamentale per comprendere il comportamento cromosomico alla base della formazione di gameti di successo. Questa conoscenza ha implicazioni dirette per l'agricoltura, in particolare nel miglioramento dei programmi di selezione delle colture, facilitando lo studio dei processi di accoppiamento e ricombinazione cromosomica che influenzano la fertilità e la diversità genetica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo utilizza piante transgeniche di A. thaliana che esprimono i transgeni GFP-CENH3 e NUP54-RFP 9,10. Il marcatore CENH3 consente di tracciare il movimento dei centromeri. Il marcatore NUP54 etichetta i pori nucleari e quindi aiuta a distinguere il nucleo. È possibile utilizzare altri marcatori, ma questi devono essere resistenti al fotosbiancamento poiché il campione è continuamente illuminato. Per assicurarsi che il marcatore non subisca il fotobleaching, eseguire l'esperimento nelle stesse condizioni laser e parametri di acquisizione e verificare che il segnale rimanga stabile per tutta la durata dell'acquisizione dell'immagine. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Crescita e coltura delle piante

  1. Semina i semi direttamente nei vasi della serra.
  2. Posizionare i vasi in serra nelle seguenti condizioni: 16 ore giorno/8 ore notte, 20 °C, 70% di umidità.
  3. Lasciare che le piante si sviluppino nella serra per circa 4 settimane. Le piante devono raggiungere uno stadio in cui hanno 5/6 steli fiorali (vedi Figura 1A).

2. Sezionamento delle antere e preparazione dei vetrini

  1. Preparare un vetrino, posizionare al centro un distanziatore (biadesivo con perforazione di 9 mm di diametro, profondità 0,12 mm), avendo cura di rimuovere le pellicole protettive su ogni lato. Questo distanziatore tratterrà il campione e creerà spazio tra il vetrino e il vetrino coprioggetti.
  2. Depositare 8 μL di acqua di rubinetto al centro del distanziatore.
  3. Usando una pinza, scegli un'infiorescenza da uno degli steli principali (vedi Figura 1B) (non usare piccole infiorescenze dagli steli emergenti).
  4. Posizionare l'infiorescenza su un nuovo vetrino sotto uno stereomicroscopio dotato di righello. Selezionare boccioli di fiori di circa 0,5 mm di lunghezza (Figura 1C).
  5. Usando aghi affilati, apri delicatamente le gemme, separando i sepali e i petali per mantenere solo le antere. Fare attenzione a non danneggiare le antere e a non lasciarle asciugare.
  6. Trasferire delicatamente i mazzetti di antera nell'acqua nella cavità distanziatrice. Per evitare la disidratazione, fallo subito dopo aver rimosso i sepali e i petali.
  7. Depositare diversi mazzi di antere all'interno della cavità distanziatrice.
  8. Coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti, evitando bolle d'aria. Per fare ciò, aggiungere 8 μL di acqua su un vetrino coprioggetti e capovolgere con cura il vetrino coprioggetti con la goccia d'acqua sulla cavità del distanziatore. Assicurarsi che i mazzi di antere siano immersi in un totale di 16 μL di acqua e che il vetrino coprioggetti sia ben incollato al distanziatore (vedi Figura 1D; Figura 2).

3. Osservazione time-lapse al microscopio confocale – Configurazione dell'imaging

NOTA: Il modo per impostare i parametri di imaging dipende dal sistema confocale utilizzato. Per ulteriori considerazioni sui parametri di imaging, vedere la sezione Discussione . Le immagini sono state acquisite utilizzando CLSM e una lente a immersione in acqua 20x. L'utilizzo di un obiettivo a immersione in acqua fornisce una migliore corrispondenza dell'indice di rifrazione, poiché il campione biologico è montato in acqua.

  1. Impostare il microscopio eccitando la GFP a 488 nm e rilevandola con un rivelatore ibrido tra 494 nm e 547 nm.
    NOTA: Il guadagno di offset del rivelatore ibrido è stato impostato su 100. La RFP viene eccitata a 561 nm e rilevata con un rivelatore ibrido tra 584 e 629 nm. Il guadagno di offset del rivelatore ibrido è stato impostato su 130. La velocità di scansione è di 400 Hz e la scansione è bidirezionale. Viene applicata una media di linea pari a 2. I due canali sono stati acquisiti contemporaneamente per ridurre al minimo i tempi di acquisizione. La potenza del laser è stata impostata al 15% per il laser a 488 nm e al 30% per il laser a 561 nm.
  2. Localizza l'antera utilizzando l'illuminazione a campo chiaro.
  3. Utilizzando il canale del campo chiaro, determinare lo stadio meiotico in base alla forma delle cellule.
    NOTA: Per osservare gli RPM sono necessari gli stadi zigotene o pachitene. La variazione del fuoco lungo l'asse Z consente di stimare la forma 3D della cellula. Allo stadio di leptotene, i meiociti mostrano una forma distintamente quadrata e il nucleolo è posizionato al centro del nucleo, rendendoli facilmente identificabili. Durante gli stadi di zigotene e pachitene, i meiociti iniziano ad adottare una forma trapezoidale e il nucleolo migra verso l'involucro nucleare. Allo stadio di diplotene, i meiociti mostrano una morfologia completamente arrotondata10.
  4. Visualizza l'antera sul software. Il segnale RFP è anche un buon indicatore dello stadio meiotico delle cellule.
    NOTA: I meiociti allo stadio zigotene/pachitene mostrano l'etichettatura NUP54 a forma di mezzaluna, corrispondente a un raggruppamento di pori nucleari in un territorio ristretto del NE in questi stadi (Figura 3A). Se necessario, ruotare l'antera in modo che sia posizionata orizzontalmente (vedi Figura 3).
  5. Definisci una dimensione dell'immagine di 400 px per 150 px, con uno zoom digitale di 4, centrando l'antera nell'immagine.
  6. Definire lo spessore del campione da visualizzare per ottenere il maggior numero possibile di meiociti intatti. Tuttavia, è importante limitare il numero di z-slice per ridurre al minimo il tempo di acquisizione. Per uno spessore di 15 μm, vengono realizzate 16 fette z. Gli Z-stack sono stati acquisiti con una dimensione del passo di 1,04 μm.
  7. Per eseguire acquisizioni continue, impostare l'intervallo di tempo su zero nella sezione temporale . Con il microscopio e i parametri sopra descritti, il tempo di acquisizione per 16 fette è di circa 6-8 s. La durata minima dell'acquisizione è di 2 minuti, ma può arrivare fino a 20 minuti.
  8. Inizia l'acquisizione.

4. Analisi delle immagini – Tracciamento del movimento del centromero

NOTA: La ricostruzione dei movimenti del centromero richiede un software di analisi delle immagini in grado di tracciare il movimento 3D. Il software assegnerà un oggetto a un segnale fluorescente, in base ai parametri definiti, ad ogni tempo di acquisizione. Quindi, lo strumento di tracciamento analizza automaticamente gli oggetti in movimento e crea un grafico di derivazione.

  1. Pre-elaborazione delle immagini
    1. Per facilitare l'analisi dei movimenti, eseguire l'elaborazione delle immagini post-acquisizione. Ad esempio, un processo di estrazione adattiva delle informazioni (algoritmo di deconvoluzione) può essere utilizzato per rivelare strutture e dettagli fini e migliorare la qualità dell'immagine.
  2. Tracciamento globale del centromero
    1. Traccia tutti i centromeri dell'immagine: utilizza un modulo spot per tracciare automaticamente le macchie (nel tempo).
    2. Scegli il canale sorgente, in questo caso verde. Indicare il diametro XY, 1 μm, per il centromero marcato GFP-CENH3. Il rilevamento degli oggetti identifica tutti gli oggetti nell'immagine (Figura 3B).
    3. Modifica la qualità del rilevamento in base all'intensità del segnale utilizzando il grafico nella parte inferiore della finestra di controllo.
    4. Utilizzare un algoritmo di tracciamento del movimento auto-regressivo per tracciare le traiettorie (Figura 3C). La visualizzazione di tutte le traiettorie facilita l'identificazione dei meiociti dai tessuti somatici (Video 1).
  3. Tracciamento dei centromeri in un singolo meiocita
    NOTA: Utilizzando un software di visualizzazione 3D, controllare i nuclei e le traiettorie e analizzare solo i nuclei che sono intatti e non sono stati ritagliati in nessun punto durante l'acquisizione. L'analisi di un meiocita rifilato produce dati errati.
    1. Tracciamento automatico del centromero
      NOTA: Quando si analizza un singolo nucleo, il processo viene riavviato dall'inizio.
      1. Utilizza il modulo spot per tracciare i punti (nel tempo) sul nucleo selezionato, definendo una regione di interesse (ROI) corrispondente utilizzando l'opzione Segmenta solo una regione di interesse e traccia i punti (nel tempo).
      2. Seleziona un ROI che includa correttamente il nucleo in tutte e tre le dimensioni e nel tempo. (Figura 4A).
      3. Utilizzare gli stessi parametri dell'intera antera per il rilevamento del centromero (Figura 4B) e il tracciamento (Figura 4C).
      4. In un grafico di lineage (Figura 4F), sono indicate tutte le traiettorie. Le traiettorie al di fuori del meiocita analizzato possono essere rimosse (Figura 4C). Seleziona le tracce ed eliminale utilizzando il tasto Canc sulla tastiera. Questi possono essere facilmente identificati utilizzando il visualizzatore 3D del software.
    2. Correzione manuale dell'inseguimento del centromero
      NOTA: Nella maggior parte dei casi, le traiettorie devono essere corrette manualmente perché il software di tracciamento non è in grado di distinguere tra centromeri troppo vicini tra loro.
      1. Utilizzare la modalità Modifica per eliminare o aggiungere un oggetto. Assicurarsi che l'oggetto sia stato aggiunto nel piano corretto.
      2. Collegare manualmente i nuovi oggetti in modalità Modifica Tracce utilizzando il tracciato di derivazione, dopo un'attenta e approfondita analisi personale della cellula in 3D. Le figure 4E,G mostrano le traiettorie corrette rispettivamente sull'immagine del meiocita e sul tracciato lineare. Il video 2 mostra le traiettorie di un meiocita dopo la correzione.
      3. Esportazione dei dati
        1. Esporta i dati di tracciamento in un foglio di calcolo per facilitare l'ulteriore elaborazione e analisi dei dati. Questi file contengono le tabelle di misura risultanti dal tracciamento eseguito con il software.
        2. Assicurati che il file del foglio di calcolo esportato contenga le seguenti variabili: Tempo, che registra il punto temporale di ogni misurazione; ID traccia, che identifica in modo univoco ogni traccia; Displacement Delta X, Y, Z, che rappresenta il cambiamento di posizione in tre dimensioni in ogni punto temporale; e Posizione X, Y, Z, che memorizza la posizione assoluta di ogni oggetto nello spazio.

5. Analisi dei dati

NOTA: questa parte descrive il flusso di lavoro dell'analisi dei dati utilizzando gli script R11 eseguiti in RStudio12. Possono essere recuperati dall'archivio Data INRAE all'indirizzo: 10.57745/V1NNFI. Tutte le cifre sono generate utilizzando ggplot213 per visualizzare le metriche calcolate. Gli script eseguono in sequenza i seguenti passaggi: La sottoconfigurazione meiomove. Lo script R viene prima eseguito per inizializzare l'ambiente R, caricare le librerie necessarie e definire le variabili globali. Il link allo script è: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. Lettura e selezione dei dati
    NOTA: Lo script da utilizzare è memorizzato come: meiomove-sub-loader.R."
    1. Raccogli tutti i singoli file Excel contenenti i dati di tracciamento e uniscili in un unico file consolidato.
    2. Salvare il file unito in formato TSV (valori separati da tabulazioni) per garantire la compatibilità con le ulteriori fasi di elaborazione dei dati.
    3. Calcola le posizioni x, y, z accumulando i valori di spostamento nel tempo, assicurandoti che la traiettoria spaziale di ogni oggetto tracciato sia ricostruita accuratamente. Questo è stato fatto per compensare un bug nel software che esportava posizioni XYZ errate.
  2. Pulizia dei dati
    NOTA: Lo script da utilizzare viene memorizzato come: meiomove-sub-clean.R."
    1. Rimozione delle tracce corte, definite come quelle con una durata minima di 50 s. Queste tracce non contengono un numero sufficiente di punti dati per un'analisi significativa, in quanto possono introdurre rumore o imprecisioni.
    2. Identificare ed eliminare le tracce in cui la posizione (X, Y, Z) rimane costante nel tempo, in quanto indicano artefatti o strutture statiche che non sono rilevanti per l'analisi.
    3. Filtra i valori di spostamento mancanti (voci NA) per garantire l'integrità dei dati ed evitare errori di calcolo nei passaggi successivi.
    4. Rileva ed elimina le tracce in cui i valori di spostamento ottenuti dal software di analisi delle immagini differiscono in modo significativo da quelli ricalcolati, garantendo coerenza e affidabilità nei dati di tracciamento.
  3. Correzione della deriva delle cellule meiotiche
    NOTA: Lo script da utilizzare viene memorizzato anche come: meiomove-sub-clean.R."
    1. Tiene conto della possibile deriva durante l'acquisizione distinguendo tra centromeri meiotici e somatici. Questo passaggio garantisce che i movimenti osservati corrispondano a processi biologici piuttosto che ad artefatti sperimentali.
    2. Applicare la correzione della deriva regolando le posizioni delle cellule meiotiche rispetto alle cellule somatiche, che fungono da riferimento stabile.
  4. Generazione dell'output
    NOTA: Lo script da utilizzare viene memorizzato come: meiomove-sub-metrics.R."
    1. Calcola la velocità istantanea ad ogni passo temporale per tenere traccia delle variazioni della velocità di movimento nel tempo.
    2. Calcola l'angolo di sterzata, che rappresenta il cambiamento di direzione del movimento tra fasi temporali consecutive, fornendo informazioni sui modelli di traiettoria. Il risultato viene memorizzato come: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Output 1).
    3. Calcola il rapporto di sbraccio utilizzando celltrackR14, che quantifica la distanza di spostamento di un oggetto tracciato rispetto alla sua posizione iniziale, fornendo un'indicazione del comportamento esplorativo. Il risultato viene memorizzato come: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Output 2).
    4. Calcola la velocità media per ogni singola traccia per riassumere le caratteristiche di movimento durante l'intero periodo di osservazione. Calcola l'angolo di sterzata medio per pista per analizzare la direzionalità del movimento generale e i modelli comportamentali. Il risultato viene memorizzato come: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Output 3).
    5. Determinare la posizione del baricentro in ogni passo temporale per ogni traccia cella. Il centroide è la media delle posizioni del centromero in un dato meiocita.
    6. Calcola la dimensione del centroide ad ogni passo temporale, che fornisce una misura della dispersione spaziale dei centromeri attorno alla loro posizione media. Le variazioni delle dimensioni del centroide nel tempo forniscono informazioni sulla consistenza globale tra le tracce del centromero. Il risultato viene memorizzato come: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Output 4).
    7. Calcola la correlazione incrociata della velocità per analizzare le relazioni tra le dinamiche di movimento di diversi oggetti tracciati, rivelando potenziali comportamenti coordinati. Il risultato viene memorizzato come: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Output 5).
    8. Calcola lo spostamento quadratico medio (MSD) per ogni traccia, una metrica chiave che quantifica la distanza quadrata media percorsa dai centromeri in determinati intervalli di tempo (ritardi temporali) per caratterizzare il tipo di movimento.
      NOTA: Esaminando come la MSD si evolve con l'aumentare del ritardo temporale, si può dedurre se il movimento è prevalentemente diffusivo o confinato, fornendo così informazioni sul comportamento dinamico sottostante. Il risultato viene memorizzato come: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Output 6).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato sviluppato un protocollo rapido per visualizzare i movimenti cromosomici durante la profase della meiosi in Arabidopsis thaliana, consentendo acquisizioni multiple in time-lapse e, quindi, l'analisi di un ampio set di dati. I meiociti che esprimono un marcatore GFP, che consente la visualizzazione dei centromeri, e un marcatore RFP, che consente la visualizzazione del nucleo, vengono visualizzati per una durata di 4 minuti seguendo il pro...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'attuale protocollo consente l'imaging e l'analisi in vivo del movimento del centromero durante la profase meiotica in Arabidopsis thaliana. Questo protocollo può essere implementato con un microscopio confocale verticale o invertito, rendendolo accessibile alla maggior parte dei laboratori dotati di tecnologia confocale. Sebbene i sistemi confocali varino in termini di velocità di scansione, sensibilità, rivelatori e capacità di separare le lunghezze d'onda, è possibi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro ha beneficiato del sostegno delle piattaforme tecnologiche dell'Osservatorio delle Piante dell'Institut Jean-Pierre Bourgin PO-Plants e PO-Cyto. Questa ricerca è stata finanziata dall'ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042 : M.G., P.A., L.C., S.L., e DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). L'Istituto Jean-Pierre Bourgin beneficia del sostegno di Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Area di riproduzioneTREF (Jiffy)101820/02227861
Microscopio confocaleLeicaTCS SP8 AOBS (Slitteratore a Fascio Acusto-Ottico)
Software confocaleLeicaSoftware LAS X 3.5.0.18371
CopertinePaul Marienfeld GmbH10705222x22 No1,5H
PinzaIdeal-Tek4.SA.0Pinzette ad alta precisione
GFP:CENH3Ravi et al. 2010Semi di Arabidopsis thaliana utilizzati qui
ggplot2  ggplot2: Grafica elegante per l'analisi dei dati   Reference13https://ggplot2.tidyverse.org
Manico per aghiHammacherManico per l'anello, lunghezza 170 mm
ImarisStrumenti di OxfordImaris 9.7.2Analisi delle immagini - modulo "Spot"
ObiettivoLeicaHC PL APO CS2 20 volte/0,75 IMM
FulmineLeicaDeconvoluzione adattativaEstrazione automatica di informazioni intelligenti da dati confocali
LuciVEGELEDApollo LL252-Gen2
AghiWatkins & DoncasterPin E3 .0124"(.31mm) x 25mm
NUP54:RFPCromer et al. 2024Semi di Arabidopsis thaliana utilizzati qui
VasiTEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6,5 cm
RSquadra RCoreR: Un linguaggio e un ambiente per la statistica    informatica. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.  Reference11https://www.R-project.org/  
RstudioPosit Team  RStudio: Ambiente di Sviluppo Integrato per R. Posit Software, PBC, Boston, MA. Reference12http://www.posit.co/
DiapositiveBICCHIERE A KNITTEL10000326x76x1,0mm
DistanziatoriThermo-fisherSafe-Seal Spacer, 8 pozzi, diametro 9 mm, profondità 0,12 mmTaglia ogni distanziatore singolarmente
StereomicroscopiNikonSMZ800

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: Integrating structure and function. Annu Rev Genet. 33 (1), 603-754 (1999).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances between homologs. Annu Rev Genet. 57 (1), 1-63 (2023).
  3. Kim, H. J., Liu, C., Dernburg, A. F. How and why chromosomes interact with the cytoskeleton during meiosis. Genes (Basel). 13 (5), 901(2022).
  4. Harline, K., Roeder, A. H. K. An optimized pipeline for live imaging whole Arabidopsis leaves at cellular resolution. Plant Methods. 19 (1), 10(2023).
  5. Prunet, N. Live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers. J Vis Exp. (122), e55156(2017).
  6. Peng, Z., Jiao, Y., Wang, Y. Live imaging of Arabidopsis shoot primordia via a confocal laser scanning microscope. STAR Protoc. 4 (2), 102217(2023).
  7. Prusicki, M. A., et al. Live cell imaging of meiosis in Arabidopsis thaliana. eLife. 8, e42834(2019).
  8. Valuchova, S., et al. Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy. ELife. 9, e52546(2020).
  9. Ravi, M., Chan, S. W. L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature. 464 (7288), 615-618 (2010).
  10. Cromer, L., et al. Rapid meiotic prophase chromosome movements in Arabidopsis thaliana are linked to essential reorganization at the nuclear envelope. Nat Commun. 15 (1), 5964(2024).
  11. R: A language and environment for statistical computing. , at https://www.R-project.org/ (2021).
  12. RStudio: Integrated development environment for R. , at http://www.posit.co/ (2025).
  13. Wickham, H. Data Analysis. ggplot2. , 189-201 (2016).
  14. Wortel, I. M. N., et al. CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data. Immunoinformatics. 1 - 2, 100003(2021).
  15. Lee, C. -Y., et al. Mechanism and regulation of rapid telomere prophase movements in mouse meiotic chromosomes. Cell Rep. 11 (4), 551-563 (2015).
  16. Nozaki, T., Weiner, B., Kleckner, N. Rapid homologue juxtaposition during meiotic chromosome pairing. Nature. 634 (8036), 1221-1228 (2024).
  17. Fang, Y., Spector, D. L. Centromere positioning and dynamics in living Arabidopsis plants. Mol Biol Cell. 16 (12), 5710-5718 (2005).
  18. Arpòn, J., Gaudin, V., Andrey, P. A method for testing random spatial models on nuclear object distributions. Plant Chromatin Dynamics: Methods and Protocols. 1675, 493-507 (2018).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Movimento cromosomicomicroscopia confocaledissezione dell anteramarcatura fluorescenteimaging time lapsetraiettorie cromosomiche

Articoli correlati