Articolo metodologico

Analisi dell'arricchimento di vitamina A in 13C in campioni biologici mediante gascromatografia-combustione-spettrometria di massa del rapporto isotopico

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DOI:

10.3791/68571

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14 novembre 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive l'analisi di campioni di siero, latte materno e fegato per l'arricchimento di 13C di retinolo ed esteri di retinile per applicazioni traccianti. La cromatografia liquida ad alte prestazioni viene utilizzata per purificare e quantificare le concentrazioni di retinolo e la gascromatografia-combustione-rapporto isotopico viene utilizzata per analizzare gli estratti purificati.

Abstract

La vitamina A è fondamentale per la salute, ma la valutazione dello stato della vitamina A è impegnativa. La vitamina A che circola nel sangue è controllata omeostaticamente e spesso non riflette la carenza o l'eccesso di vitamina A. L'uso di 13C-vitamina A consente di tracciare e quantificare le riserve di vitamina A di tutto il corpo e di fornire ulteriori informazioni sulla farmacocinetica e sul metabolismo. Questo protocollo descrive l'estrazione, la purificazione e la determinazione dell'arricchimento isotopico 13C della vitamina A in campioni di siero, latte materno e tessuto mediante gascromatografia-combustione-spettrometria di massa isotopica (GC-C-IRMS). L'analisi con GC-C-IRMS fornisce valori di arricchimento sensibili e precisi, in particolare per campioni con arricchimenti di 13C vicini ai livelli di abbondanza naturale. Ciò consente la flessibilità nei disegni di studio per utilizzare dosi di traccianti più piccole e campionamenti farmacocinetici a lungo termine. In breve, a 0,4-1 ml di siero, l'etanolo viene aggiunto per precipitare le proteine, il C-23 β-apo-carotenolo viene aggiunto come standard interno e l'esano viene utilizzato per estrarre i retinoidi. L'estratto viene successivamente risospeso in metanolo e purificato mediante HPLC. La frazione di retinolo viene quindi risospesa in esano e iniettata nel sistema GC-C-IRMS. L'atomo % (At%) viene calcolato direttamente in riferimento all'anidride carbonica, che viene calibrata rispetto a uno standard di saccarosio utilizzando un analizzatore elementare. Altri tipi di tessuto che sono stati analizzati da GC-C-IRMS includono il latte materno e il fegato dopo la saponificazione. Le tecniche di estrazione in fase solida possono essere utilizzate per facilitare la purificazione di queste o altre matrici complesse. Inoltre, un analizzatore elementare può essere collegato all'IRMS per analizzare campioni di alimenti per un contenuto totale di 13C.

Introduzione

La vitamina A (VA) è un micronutriente essenziale necessario per la vista, la funzione immunitaria, la differenziazione cellulare e la regolazione metabolica. L'ottimizzazione dello stato di VA rimane una sfida per la salute globale, poiché la carenza o l'eccesso possono compromettere i risultati di salute. Una valutazione accurata dello stato di VA è fondamentale per gli studi clinici o di popolazione che guidano gli interventi appropriati. Tuttavia, la concentrazione sierica di retinolo da sola è un biomarcatore e uno strumento diagnostico scarso perché è regolata omeostaticamente in un'ampia gamma di riserve corporee totali (TBS) ed è influenzata dall'infiammazione e da altre carenze nutrizionali 1,2.

I traccianti marcati isotopicamente hanno trasformato radicalmente la ricerca sui VA consentendo la valutazione quantitativa dei TBS utilizzando il test di diluizione isotopica del retinolo (RID) 3,4,5. Per la RID, viene somministrato un tracciante VA arricchito in 13C o 2H, che si equilibra con le riserve corporee e il rapporto tracciante/traccia (TTR) del retinolo sierico (o plasma) viene misurato utilizzando la MS. Per calcolare i TBS 5,6 viene applicata un'equazione di diluizione isotopica con ipotesi specifiche relative al metabolismo del VA.

Numerose combinazioni di cromatografia e MS possono essere utilizzate per determinare il TTR del retinolo sierico (ad es. GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). La precisione analitica è fondamentale per stime accurate del RID perché i TBS sono inversamente proporzionali al TTR. LC-MS/MS è particolarmente adatto per applicazioni ad alta produttività quando si utilizzano traccianti fortemente marcati e dosi di traccianti relativamente elevate. I tipici metodi LC-MS/MS riportano deviazioni standard relative (RSD) del retinolo del 3-6% per l'intra-saggio e del <8% per l'inter-saggio7, ma ci sono dati limitati sull'accuratezza e la precisione dei TTR. Al contrario, la spettrometria di massa con rapporto gascromatografia-combustione-isotopi (GCCIRMS) offre una precisione eccezionale per l'arricchimento di 13C-retinolo, con un'abbondanza isotopica tipica di 13C/12C RSD di ~0,02-0,05 8,9. Ciò consente di determinare con precisione le concentrazioni di traccianti nei campioni in cui gli arricchimenti sono bassi. L'utilizzo di IRMS per le applicazioni RID consente di ottenere un segnale analitico adeguato utilizzando meno massa del tracciante e meno atomi marcati nel tracciante, risparmiando entrambi i costi associati alle dosi del tracciante.

Questo manoscritto delinea un'analisi per il 13C-retinolo da sangue, latte materno e tessuti utilizzando GC-C-IRMS. A seconda del campione biologico da testare, l'analisi del retinolo marcato con 13C utilizzando GC-C-IRMS inizia con uno dei diversi potenziali metodi di estrazione per isolare i composti non polari che includono il retinolo marcato. Per i campioni di siero, ciò comporta un'estrazione liquido-liquido mediante l'aggiunta di etanolo ed esano e la raccolta della frazione di esano. Se si analizza il latte materno, i campioni vengono prima saponificati con idrossido di potassio, seguiti da un'estrazione liquido-liquido simile a quella del siero. Questi campioni di latte materno vengono anche purificati utilizzando cartucce di estrazione in fase solida per ridurre la quantità di altri lipidi rimanenti. Se si estrae da un tessuto (ad esempio, fegato), il campione viene macinato con solfato di sodio anidro per rimuovere l'acqua, estratto con cloruro di metilene e filtrato in un pallone volumetrico o a fondo tondo per l'evaporazione rotante. Un'aliquota viene essiccata, risospesa in etanolo, saponificata ed estratta con lo stesso metodo del latte materno. Queste soluzioni non polari di ciascun campione vengono essiccate sotto azoto e ricostituite in metanolo per la purificazione e la quantificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

La sensibilità dell'IRMS consente la determinazione dell'arricchimento in campioni con basso arricchimento del campione, come i campioni farmacocinetici per applicazioni di modellazione matematica a lungo termine o i campioni di tessuto extraepatico per il tracciamento preciso del metabolismo del VA. Il test RID accoppiato a dose singola è stato proposto per valutare lo stato di VA prima e dopo l'intervento per determinare l'efficacia nei soggetti teorici10, che potrebbe essere un approccio promettente se convalidato nell'uomo. IRMS è in grado di rilevare traccianti VA vicini ai valori di arricchimento naturale, il che consentirebbe lunghe finestre di follow-up e flessibilità nei protocolli di campionamento.

Il latte materno ha dimostrato di essere un approccio di campionamento alternativo meno invasivo per la valutazione dello stato di VA1. Il retinolo del latte materno può essere utilizzato come fonte di campionamento per il test RID e ha mostrato una forte correlazione con i valori di RID derivati dal siero nelle donne in Zambia con basse riserve di VA11. Per i tessuti e i campioni di latte materno, le tecniche di estrazione in fase solida possono aiutare nella purificazione di questi campioni in matrici complesse. L'IRMS è stato utilizzato anche per discriminare le fonti alimentari di VA e determinare i relativi contributi dietetici utilizzando i cambiamenti nell'abbondanza naturale di 13C del retinolo sierico 9,12,13. Un analizzatore elementare può essere utilizzato anche con IRMS per analizzare campioni di alimenti per un contenuto totale di 13C e confrontarlo con l'arricchimento di VA.

Quando si utilizzano le etichette 13C, è fondamentale comprendere l'arricchimento di base del retinolo 13C, dovuto al 13C presente naturalmente (~1,1% del carbonio totale), che può variare con le fonti di VA consumate sia dagli individui che dalle popolazioni. Pertanto, per la migliore accuratezza a livello individuale, si raccomanda un campione di sangue di base. Per le valutazioni della popolazione, una stima basata sulla popolazione può essere generata utilizzando un sottogruppo selezionato in modo casuale o individui separati dello stesso gruppo di popolazione14.

Protocollo

1. Estrazione del retinolo da campioni biologici

NOTA: Tutte le procedure di manipolazione ed estrazione dei campioni vengono eseguite sotto luce gialla o filtrata dai raggi UV per ridurre al minimo la degradazione.

  1. Estrazione dal siero
    1. Pipettare 1 mL di siero (o la quantità disponibile) in una provetta di vetro da 13 x 100 mm (o dimensioni simili). Registrare il volume di siero utilizzato.
      NOTA: Si consiglia l'uso di una pipetta a spostamento positivo.
    2. Aggiungere 1,5 volte il volume di etanolo a 200 gradi.
    3. Aggiungere 25 μl dello standard interno, come C-23 β-apo-carotenolo (sintetizzato da retinici all-trans, abs = 0,9)9. Tappare il campione e mescolare a vortice per 15 s.
    4. Aggiungere 1 mL di esano, mescolare a vortice per 15 s e centrifugare per 2 min (~1.300 × g) a temperatura ambiente.
    5. Utilizzando una pipetta Pasteur, pipettare con cura lo strato superiore di esano in una nuova provetta di vetro (12 x 75 mm o 13 x 100 mm).
    6. Ripetere i passaggi 1.1.4 e 1.1.5 2x, raggruppando i tre estratti di esano nella seconda provetta. Metti l'estratto di esano accumulato sotto un leggero getto di azoto fino a quando non si asciuga.
    7. Aggiungere 100 μl di metanolo al campione essiccato e tapparlo immediatamente. Far roteare la soluzione su e giù per i lati del tubo e quindi mescolare il campione a vortice per 15 s.
    8. Porre i campioni in un congelatore a -80 °C per almeno 5 minuti.
      NOTA: I campioni possono rimanere conservati in questa fase a -80 °C fino al giorno successivo.
  2. Estrazione di campioni di latte materno
    1. Scongelare completamente i campioni di latte e capovolgerli delicatamente più volte per garantire che i campioni siano uniformi. In una provetta da centrifuga con tappo a vite in vetro da 10 mL, misurare un'aliquota di latte da 0,5-1,5 mL (standard 1,0 mL) e registrare il volume utilizzato.
    2. Aggiungere 1,5 volte il volume di etanolo 200 proof (contenente lo 0,1% di butilidrossitoluene (w:v)), mescolare con un vortice per 15 s.
    3. Aggiungere 25 μl dello standard interno, come C-23 β-apo-carotenolo (sintetizzato da retinici all-trans, abs = 0,9)15. Tappare il campione e mescolare a vortice.
    4. Aggiungere 0,8 volte il volume del campione di latte di idrossido di potassio 50:50 in acqua (preparato come w:v, ad es. 50 g di KOH sciolto in 50 mL di acqua), mescolare a vortice per 15 s.
      NOTA: KOH: l'acqua deve essere preparata in contenitori di plastica (ad es. HDPE).
    5. Saponificare i campioni per 1 ora in un bagno d'acqua a 45 °C e mescolare brevemente con un vortice ogni 15 minuti.
    6. Aggiungere acqua fredda deionizzata o ad osmosi inversa allo stesso volume del volume iniziale del latte.
    7. Aggiungere 1 mL di esano, mescolare a vortice per 15 s e centrifugare per 2 min (~1.300 × g) a temperatura ambiente.
    8. Utilizzando una pipetta Pasteur, pipettare con cura lo strato superiore di esano in una nuova provetta di vetro (12 x 75 mm o 13 x 100 mm).
    9. Ripetere i passaggi 1.2.7 e 1.2.8 altre due volte, accumulando l'esano nel secondo tubo.
    10. Prelevare ogni campione attraverso l'estrazione in fase solida (SPE); iniziare collegando le cartucce SPE necessarie (PE 500 mg/3 mL di -NH2) al collettore del vuoto.
    11. Condizionare ogni cartuccia facendo scorrere 3 x 2 mL di esano in ciascuna cartuccia, senza mai lasciare che il livello del solvente scenda al di sotto della parte superiore del materiale di imballaggio. Raccogliere l'esano in un tubo di vetro da 16 x 75 mm e smaltirlo in modo appropriato.
    12. Caricare i campioni nelle cartucce e farli passare con il vuoto fino a quando il solvente non supera appena il livello del materiale di imballaggio. Sciacquare ogni cartuccia con 3 x 2 mL di esano nello stesso modo del passaggio 1.2.11. Smaltire il solvente di scarto e sostituire le provette di raccolta in vetro con altre nuove della stessa dimensione, etichettate con l'ID del campione.
    13. Lavare il retinolo con 3 x 2 mL di cloruro di metilene, raccogliendo questa frazione.
    14. Essiccare l'eluato sotto azoto e ricostituirlo in 100 μl di metanolo (grado MS). Miscelare il campione a vortice e far roteare il solvente su tutti i lati della provetta. Centrifuga per 20-30 s.
    15. Porre i campioni in un congelatore a -80 °C per almeno 5 minuti.
      NOTA: I campioni possono rimanere conservati in questa fase a -80 °C fino al giorno successivo.
  3. Estrazione di campioni di fegato
    1. In un imbuto di vetro di 8 cm di diametro, piegare e posizionare una carta da filtro Whatman #1 da 15 cm a forma di cono. Posizionare un matraccio tarato da 50 ml sotto l'imbuto.
    2. Scongelare il tessuto e pesare 0,5 g, o la quantità di campione disponibile. Registrare il peso del tessuto utilizzato.
    3. Trasferire i campioni in un mortaio e pestello e macinarli con circa 5 g di solfato di sodio.
    4. Aggiungere 250 μl di uno standard interno come C-2315.
      NOTA: Le forme esterificate di vitamina A (ad esempio, acetato di retinile, butirrato di retinile) non devono essere utilizzate perché il campione alla fine sarà saponificato, rendendo lo standard indistinguibile dal retinolo endogeno.
    5. In una cappa aspirante, versare 10-15 ml di cloruro di metilene nel mortaio con il campione di fegato macinato e mescolare delicatamente con il pestello.
    6. Versare il cloruro di metilene attraverso la carta da filtro nel matraccio tarato.
    7. Ripetere i passaggi 1.3.5 e 1.3.6 altre due volte, assicurandosi che il solvente totale nel matraccio tarato rimanga al di sotto della linea.
    8. Utilizzare una pipetta Pasteur per sciacquare il contenuto rimanente della malta nell'imbuto con cloruro di metilene. Continuare ad aggiungere cloruro di metilene all'imbuto con la pipetta Pasteur fino a quando il solvente nel matraccio tarato raggiunge la linea. Tappare il matraccio tarato e, fissando il tappo, capovolgere più volte il pallone.
    9. Versare circa 10 ml di estratto di cloruro di metilene in un matraccio di Erlenmeyer da 25 ml. Trasferire 5 mL della soluzione in una provetta da centrifuga in vetro da 10 mL con tappo a vite. Asciugare il campione sotto un leggero getto di azoto gassoso.
    10. Ricostituire il campione in 2 mL di etanolo + 0,1% di butilidrossitoluene e vortice per miscelare il campione.
    11. Aggiungere 0,8 mL di idrossido di potassio 50:50 (p:v) in acqua e mescolare a vortice per 15 s.
    12. Saponificare i campioni per 1 ora in un bagno d'acqua a 45 °C e mescolare brevemente con un vortice ogni 15 minuti.
    13. Aggiungere 0,1 ml di acqua fredda deionizzata o ad osmosi inversa.
    14. Aggiungere 1 mL di esano, mescolare a vortice per 15 s e centrifugare per 2 min (~1.300 × g).
    15. Utilizzando una pipetta Pasteur, pipettare con cura lo strato superiore di esano in una nuova provetta di vetro (12 x 75 mm o 13 x 100 mm).
    16. Ripetere i passaggi 1.3.14 e 1.3.15 altre due volte, accumulando l'esano nel secondo tubo.
    17. Essiccare l'esano raggruppato sotto azoto e ricostituirlo in 100 μl di metanolo (grado MS). Mescolare il campione a vortice e far roteare il solvente su tutti i lati del tubo. Centrifugare per 20-30 s e porre i campioni in un congelatore a -80 °C per almeno 5 minuti.
      NOTA: I campioni possono rimanere conservati in questa fase a -80 °C fino al giorno successivo.

2. Purificazione e quantificazione del campione mediante cromatografia liquida ad alta prestazione

  1. Preparare il sistema HPLC 1 con una colonna C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) e un rivelatore UV-Vis impostato su 325 nm.
  2. Preparare la fase mobile di acetonitrile:acqua 92:8 misurando separatamente i volumi di acetonitrile e acqua e quindi versando l'acqua nell'acetonitrile. Filtrare sottovuoto la soluzione miscelata per rimuovere il gas disciolto.
  3. Accendere il sistema HPLC 1, eseguire uno spurgo del solvente sull'HPLC se necessario, quindi impostare la portata su 1 mL/min per almeno 15 minuti per bilanciare completamente il sistema.
  4. Iniettare gli standard nel sistema HPLC.
    1. Per quantificare le concentrazioni di retinolo, iniettare 25 μl di soluzione standard interna di C-23 e registrare il risultato 3 volte per confrontarlo con i campioni.
    2. Iniettare uno standard di retinolo per determinare l'esatto tempo di ritenzione per il sistema utilizzato per guidare la raccolta delle frazioni e la quantificazione del retinolo.
  5. Preparare il sistema HPLC 2 (i componenti sono gli stessi del sistema 1). Se si utilizza un sistema HPLC per entrambe le fasi, sostituire la colonna utilizzata per la purificazione primaria con una seconda colonna identica per ridurre al minimo il potenziale carryover di composti dai campioni.
  6. Per il sistema 2, filtrare sotto vuoto il metanolo, spurgare la fase mobile HPLC, quindi far funzionare 0,7 mL/min per 20 minuti per equilibrare.
  7. Prelevare i campioni uno alla volta dal congelatore a -80 °C e centrifugare a 1.300 × g per 30 s a temperatura ambiente.
  8. Iniettare l'intero campione sull'HPLC, evitando qualsiasi materiale pellettato. Avviare la registrazione se si quantifica il retinolo.
  9. Raccogliere il picco del retinolo in un piccolo tubo di vetro (12 x 75 mm o 13 x 100 mm) mentre il solvente passa attraverso il rivelatore. Raccogliere la parte centrale del picco per massimizzare la purezza, in genere valori di assorbanza superiori a 0,1 unità di assorbanza (Figura 1), che possono essere regolati in base alla concentrazione di retinolo del campione. Attendere che il picco del C-23 eluisca e interrompere la registrazione.
  10. Asciugare il campione sotto un leggero flusso di azoto.
  11. Aggiungere 100 μl di metanolo (grado MS) al campione essiccato e tappare immediatamente. Far roteare la soluzione su e giù per i lati del tubo, quindi mescolare il campione a vortice per 15 s. Porre i campioni in un congelatore a -80 °C per almeno 5 minuti.
    NOTA: I campioni possono rimanere conservati in questa fase a -80 °C fino al giorno successivo.
  12. Rimuovere i campioni uno alla volta dal congelatore a -80 °C. Centrifugare a 1.300 × g per 30 s.
  13. Iniettare l'intero campione sul sistema HPLC 2, evitando qualsiasi materiale pellettato.
  14. Quando il picco del retinolo eluisce, raccogliere il solvente mentre passa attraverso il rivelatore in una piccola fiala di vetro (<1 ml) con fondo conico e far scorrere delicatamente la fiala del campione in una provetta da 12 x 75 mm.
  15. Accendere il concentratore sottovuoto e lasciare raffreddare il condensatore per 20 min.
  16. Posizionare i campioni in una formazione bilanciata nel carosello, impostare l'impostazione del calore su nessuno e il vuoto su 05.1, chiudere il coperchio e premere RUN.
    NOTA: I campioni richiedono in genere 10-20 minuti per asciugarsi. Per il gascromatografo è importante che tutto il metanolo sia stato rimosso dai campioni.
  17. Una volta asciutto, trasferire il flaconcino HPLC in un flaconcino ambrato da 4 mL con tappo a vite e ricostituire il campione con 4-7 μL di esano.
    NOTA: Si tratta in genere di 7 μl, ma si riduce quando si determina che il campione è a bassa concentrazione durante la purificazione. I campioni di fegato possono essere molto più concentrati, quindi ricostituirsi in un volume maggiore. Puntare a un valore compreso tra 75 ng/μL e 400 ng/μL.
  18. Iniettare 1-5 μl sul GC-C-IRMS per ottenere un segnale adeguato, in base alla concentrazione del campione necessaria per iniettare circa 75 ng di retinolo.

3. Analisi dei campioni con GC-C-IRMS

  1. Preparare il GC con una colonna (100% dimetilpolisilossano, non polare, 15 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm di pellicola) e una velocità di flusso di elio di 1,2 mL/min.
  2. Eseguire controlli del sistema per assicurarsi che non vi siano perdite e che la sorgente IRMS sia correttamente focalizzata sulle masse 44, 45 e 46.
    Iniettare 2 μL di retinolo standard arricchito con 13C da 75 ng/μL ogni giorno come prima iniezione per determinare il tempo di ritenzione e verificare le prestazioni del sistema.
  3. Nel software di acquisizione, caricare il metodo dello strumento, digitare il nome del campione e premere il pulsante Esegui campione. Il sistema GC-C-IRMS eseguirà una routine di configurazione del sistema di pre-iniezione. Quando la spia verde Pronto per l'iniezione sulla parte anteriore del GC si accende, iniettare il volume predeterminato di campione nell'iniettore PTV a vaporizzazione a temperatura programmabile, rimuovere la siringa e premere il pulsante Start .
  4. Azionare l'iniettore PTV in modalità PTV Splitless, con la colonna di protezione posizionata nella parte superiore dell'inserto dell'iniettore per un'iniezione simulata su colonna. Impostare il programma dell'iniettore in modo che inizi con una temperatura iniziale di 50 °C, mantenerlo premuto per 1,05 minuti, aumentare a 200 °C a una velocità di 14,5 °C/s, tenere premuto a 200 °C per 1 minuto, passare a 300 °C a 14,5 °C/s, quindi tenere premuto per spurgare l'iniettore per 4 minuti con un flusso di elio di 50 ml/min prima di tornare a 50 °C per l'iniezione successiva.
  5. Programmare la temperatura del forno GC a una temperatura iniziale di 50 °C, tenerla per 1 minuto, rampa da 30 °C/min a 150 °C, quindi da 15 °C/min a 265 °C, quindi fino a 295 °C a 40 °C/min, quindi tenere premuto per 2,50 minuti prima di raffreddare a 50 °C per l'iniezione successiva.
  6. Assicurarsi che ogni cromatogramma inizi con tre impulsi di CO2 (purezza del 99,999%), calibrati contro il saccarosio (IAEA-CH-6). Accedi ai risultati nel software di acquisizione.
  7. Dopo ogni iniezione, ispezionare ogni cromatogramma per verificare che il picco del retinolo sia presente e che l'integrazione sia appropriata. Utilizza il software per integrare automaticamente il più possibile i picchi di retinolo per ridurre al minimo le potenziali distorsioni dovute alle integrazioni manuali. Utilizza le impostazioni standard di rilevamento della pendenza iniziale e finale di 20 mV/s.
    NOTA: Un'ampiezza di picco di 200 mV o inferiore è troppo piccola per fornire una misurazione accurata del rapporto di 13C.
  8. Esporta i dati del cromatogramma in un programma per fogli di calcolo. Includi le seguenti categorie di dati essenziali: nome del campione, tempo di ritenzione del picco, ampiezza del picco a massa 45 e AT%.
    NOTA: i dati esportati possono essere specificati utilizzando un metodo di esportazione definito. Il valore δ è utile per facilitare l'interpretazione, ma non è necessario per i calcoli.

4. Calcolo delle riserve corporee totali di vitamina A e delle concentrazioni epatiche

  1. Equazioni di diluizione degli isotopi del retinolo.
    NOTA: L'equazione di bilancio isotopico preferita e la notazione corrispondente utilizzata da alcuni ricercatori si basano sulle raccomandazioni dell'Unione Internazionale di Chimica Pura e Applicata16. Notiamo che alcuni gruppi di ricerca utilizzano la notazione che tenta di mantenere l'uso storico dei fattori utilizzati nelle equazioni RID. Notiamo anche che i fattori e la letteratura di supporto possono differire nel fatto che si applichino più direttamente ai calcoli per TBS o concentrazioni di VA epatiche, a seconda del disegno dello studio, del modello sperimentale e dei risultati analitici.
    1. Determinare il TTR sierico del retinolo utilizzando l'abbondanza isotopica di 13C di CO2 dopo combustione secondo la seguente equazione:
       figure-protocol-1    
      Dove F è l'abbondanza isotopica (nota anche come frazione isotopica-quantità, abbreviata 'x') della dose tracciante (Fa), del retinolo sierico al basale (Fb) e del retinolo sierico dopo la somministrazione e la miscelazione con il pool corporeo (Fc). I periodi di miscelazione utilizzati sono in genere di circa 14-21 giorni per gli esseri umani, ma possono essere più brevi o più lunghi a seconda del disegno specifico dello studio.
    2. Utilizzare le equazioni RID per calcolare il TBS VA in base all'equazione di base seguente.
      figure-protocol-2
      Dove
      figure-protocol-3
      NOTA: I fattori utilizzati per l'assorbimento e la conservazione includono i) la conservazione della dose al momento dell'equilibrio (Assorbimento della dose) tipicamente stimata tra il 75% e il 90% per individui sani. La stima può essere ridotta se è presente un'infiammazione. ii) Ritenzione della dose; Costante: e-kt; k = LN(2)/emivita del retinolo; da 32 a 136 giorni per i bambini; 140 giorni per gli adulti); t = giorni dalla somministrazione (di solito 14-21 giorni); ripartizione del tracciante siero/fegato: TTRserum / TTRliver; 0,65-0,9 con assunzione di VA durante il periodo di miscelazione; 0,9-0,1 se si utilizza una dose bassa di tracciante, l'assunzione controllata di VA e il campionamento a digiuno.
      figure-protocol-4
    3. Calcolare le concentrazioni di VA nel fegato con ulteriori ipotesi per il peso del fegato e la frazione di TBS di VA nel fegato.
      figure-protocol-5
      Dove
      figure-protocol-6
      Il rapporto fegato/peso corporeo è comunemente stimato come una costante specifica per età: neonati: 4-4,2%; figli: 3%; adulti: 2,4%; La frazione TBS nel fegato varia con lo stato della vitamina A. Le stime utilizzate in precedenza sono marginali o con basso stato VA: 0,5; stato VA adeguato: 0,8-0,9.

Risultati

Un esempio di cromatogramma del campione di siero monitorato a 325 nm è fornito per la sezione 2 del protocollo (Figura 1). A seconda del sistema specifico e della colonna utilizzata, il tempo di ritenzione tipico per il retinolo è di 4-6 minuti e 6-8 minuti per lo standard interno. L'area ombreggiata in verde mostra l'intervallo di raccolta target per la frazione di retinolo per ridurre al minimo le impurità. L'efficienza di estrazione del retinolo dal siero è in genere ≥ 85%, mentre il latte materno saponificato e i campioni di tessuto tendono ad avere efficienze inferiori, in media ~ 70-80%. Piccole quantità di isomeri del retinolo cis possono essere osservate eluire poco prima o dopo il picco principale all-trans durante la purificazione HPLC. Non è stato osservato alcun isomero cis apprezzabile nel campione presentato nella Figura 1 , ma può essere visto nella Figura 1 supplementare del riferimento17. Spesso, un ulteriore isomero viene separato durante la seconda purificazione HPLC (non mostrata) o durante la separazione GC (Figura 2).

Esempi di cromatogrammi GC-C-IRMS per uno standard, un campione di siero e un bianco sono mostrati per la sezione 3 del protocollo (Figura 2)9. Ogni campione include picchi di CO2 di riferimento con arricchimento di 13C calibrati secondo uno standard di saccarosio AIEA (IAEA-CH-6).

La precisione sperimentale IRMS (CV%) per l'abbondanza isotopica di 13C/C totale per: 1) CO2 di riferimento era 0,012 per la stabilità e 0,031 per la linearità (n = 10 ciascuno); 2) lo standard del retinolo era 0,036 per la stabilità intergiornaliera e 0,022 per la linearità intragiornaliera (n = 4 ciascuno); e 3) sperimentale è stato di 0,073 ± 0,061 nel basale e in otto gruppi di trattamento dietetico nei gerbilli (n = 46 in 9 gruppi)9.

Di seguito è riportato un esempio di come i dati sierici di GC-C-IRMS risultanti vengono utilizzati per calcolare le concentrazioni di TBS e VA epatiche determinate 14 giorni dopo la somministrazione della dose utilizzando l'equazione RID per il Metodo 4:

Caratteristiche dei partecipanti allo studio:

Età:4 anni
Peso corporeo:16,0 kg
Fa (2 atomi di carbonio marcati più abbondanza naturale):0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Dose tracciante applicata:1,0 μmol
Tempo dal dosaggio:14 giorni
Emivita VA:32 giorni
Assorbimento:0.8
Rapporto TTR nel siero/fegato (dieta non controllata):0.9
Frazione TBS nel fegato:0.8

Calcolo:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Ritenzione della dose = e-kt con emivita di 32 giorni e tempo di campionamento di 14 giorni
k= ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
t = 14
e-kt = e-0,02166 x 14= 0,738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Per il calcolo delle concentrazioni di VA epatiche:
Peso del fegato (g) = 1.000 × peso corporeo (kg) × 3% (stima per i bambini)
Peso del fegato = 1.000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Concentrazione di VA nel fegato = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Figura 1: Cromatogramma HPLC di un campione di siero umano. Sistema HPLC 1 con fase mobile isocratica 90:10 MeOH:H2O e rivelazione a 325 nm. Il picco del retinolo viene raccolto per valori di assorbanza superiori a ~0,1 (area ombreggiata in verde). Lo standard interno C-23 β-apo carotenolo viene utilizzato per quantificare la concentrazione sierica di retinolo (se lo si desidera) durante questa fase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 2: Cromatogrammi GC-C-IRMS che dimostrano la determinazione del retinolo 13 C/12 C. Cromatogramma GC-C-IRMS di (A) retinolo standard, (B) retinolo purificato dal siero e (C) iniezione in bianco adattato da Gannon et al.9. Tre tracce sono per la massa 44 (corrispondente a 12C16O2), 45 (corrispondente a 13C16O2 o 12C16O17O) e 46 (corrispondente principalmente a 12C16O18O, che viene utilizzata per correggere la massa 45 per il contributo 17O). Tre ampi picchi prima di 200 s sono picchi di riferimento di CO2 calibrati su un materiale di riferimento di saccarosio 13C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I metodi descritti per misurare l'arricchimento di 13C di retinolo utilizzando GC-C-IRMS possono fornire dati preziosi per valutare gli interventi dietetici,18 la modellazione della cinetica della vitamina A,19,20,21 la ricerca clinica o gli studi di popolazione che incorporano RID per migliorare le stime dello stato VA 22.

In questo test, il retinolo purificato da un campione biologico viene trasportato attraverso la colonna GC mediante elio di ricerca (purezza >99,99999%) con un gradiente di temperatura, separandolo dalle impurità rimanenti nel campione. Il retinolo viene bruciato per formare CO2 e acqua e l'acqua viene rimossa. La CO2 viene trasportata all'IRMS, dove vengono misurate le masse 44, 45 e 46 e la δ e l'AT% vengono determinati rispetto a un gas di riferimento CO2 , che viene ulteriormente calibrato rispetto allo standard del saccarosio (IAEA-CH-6).

Nella preparazione del retinolo per l'iniezione, il retinolo estratto deve essere della massima purezza per ottenere rapporti isotopici riproducibili e per massimizzare la longevità della piattaforma analitica tra una pulizia accurata e l'altra. I solventi utilizzati per l'estrazione devono essere del più alto grado di purezza disponibile, che di solito è il grado MS. Tutti i vetreria, come le provette di estrazione, le pipette Pasteur e le fiale per iniezione HPLC, devono essere nuovi perché sono difficili da pulire adeguatamente per l'analisi MS. È importante utilizzare provette e pipette di vetro piuttosto che di plastica per ridurre al minimo i plastificanti negli estratti che si accumulano sul GC e sulle colonne di combustione.

Le modifiche a questo flusso di lavoro di analisi dei campioni potrebbero essere apportate a seconda del disegno specifico dello studio e della fonte di campionamento. Ad esempio, un sistema HPLC potrebbe probabilmente essere ottimizzato per la purificazione del retinolo. Nella nostra esperienza, ciò richiederebbe acqua nella fase mobile e richiederebbe un gradiente di fase mobile o un aumento del tempo di essiccazione del campione prima dell'iniezione sul GC-IRMS. Abbiamo scoperto che l'utilizzo di due sistemi HPLC con metodi isocratici corti bilancia i requisiti analitici ottenendo segnali chiari sul GC-C-IRMS (Figura 2). L'uso di LC-MS/MS potrebbe fornire un flusso di lavoro analitico più snello per i campioni RID7. Tuttavia, la sensibilità del GC-C-IRMS presenta vantaggi distinti in quanto è in grado di utilizzare quantità di marcatura di dosi e isotopi inferiori, quantificare i traccianti in punti temporali più lunghi e analizzare campioni con un basso arricchimento del campione.

I limiti di questo metodo includono la necessità di più strumenti, una gestione tecnica qualificata e vincoli di produttività dei campioni a causa dei tempi di preparazione dei campioni più lunghi. Il tempo di lavoro necessario per preparare ogni campione potrebbe essere migliorato implementando un HPLC con funzionalità di raccolta automatizzata delle frazioni, poiché le fasi di purificazione HPLC utilizzano metodi isocratici, con conseguenti tempi di ritenzione dell'analita coerenti. Il metodo potrebbe essere ottimizzato per utilizzare una sola purificazione HPLC. Utilizziamo due sistemi in parallelo per aumentare la produttività e facilitare l'essiccazione del campione prima della ricostituzione in esano e dell'iniezione sul GC-C-IRMS.

Sebbene la GC-C-IRMS sia estremamente sensibile per determinare i rapporti isotopici, richiede una maggiore massa totale di retinolo del campione per un segnale adeguato del retinolo. I requisiti del campione dipendono sia dalla quantità di campione che dalla concentrazione di VA del campione. In genere, 75 ng di retinolo sono mirati per un picco forte, consentendo variazioni nel trasferimento GC e nell'efficienza di combustione. In pratica, in condizioni operative ottimali, abbiamo ottenuto un segnale adeguato con campioni che hanno portato a iniezioni di GC-C-IRMS a partire da 25 ng. Ciò corrisponde a un campione di siero con volume inferiore (~0,4 mL), bassa concentrazione di retinolo (~0,5 μmol/L) e perdite minori nelle procedure di estrazione e purificazione. Nello sviluppo analitico del metodo RID, un importante miglioramento è stato il passaggio a un iniettore PTV. La bassa temperatura iniziale impedisce all'esano che trasporta il campione di espandersi troppo rapidamente, consentendo iniezioni simulate su colonna di campioni. L'iniezione diretta nella colonna massimizza il segnale del retinolo con l'inconveniente di una forma del picco leggermente peggiore e di una manutenzione più costante.

Il latte materno è stato proposto come sostituto dei campioni di siero nel test RID. Ciò è stato convalidato nelle donne dello Zambia che allattavano che avevano in gran parte basse riserve di VA11. Deve ancora essere convalidato nelle donne che hanno una maggiore assunzione di VA preformata, come si troverebbe nei paesi ad alto reddito o nelle popolazioni che consumano più fonti di VA, tra cui l'assunzione dietetica, la fortificazione del cibo e l'integrazione.

La valutazione VA del latte materno presenta diversi vantaggi rispetto ad altri indicatori biochimici dello stato VA. La raccolta del latte materno è spesso più facile del sangue perché i flebotomi non sono necessari e la raccolta del latte materno è solitamente considerata meno invasiva per i soggetti23. L'uso di campioni casuali di latte materno è conveniente e richiede solo 5 ml di latte. Inoltre, i campioni non devono essere elaborati immediatamente, il che riduce i tempi di gestione dei campioni, in particolare nelle impostazioni sul campo. Tuttavia, la standardizzazione della raccolta dei campioni per i campioni di latte materno completo è fondamentale perché le concentrazioni di grasso e retinolo sono più elevate nel latte posteriore rispetto al latte anteriore e le concentrazioni di grasso del latte e retinolo tendono a variare con l'ora del giorno e l'intervallo dall'ultima poppata 1,24. Per i campioni casuali, la concentrazione di retinolo è espressa al meglio per g di grasso del latte. Il grasso del latte deve essere determinato idealmente subito dopo la raccolta utilizzando il metodo del creamatocrit25. I campioni devono essere protetti dalla luce. Le aliquote (in genere da 1 a 5 ml) per l'analisi HPLC devono essere preparate al momento della raccolta perché il latte non è omogeneo dopo il congelamento e lo scongelamento.

Ci sono due circostanze principali in cui misurare l'arricchimento di 13C del VA nel fegato può essere possibile e di interesse. La situazione più comune è quando si utilizza il retinolo marcato con 13C negli studi sugli animali quando il fegato viene raccolto. I TBS calcolati di VA saranno confrontati con la concentrazione di VA nel fegato come determinato da HPLC/UPLC, ma l'arricchimento di 13C delle riserve epatiche è utile anche per determinare come il tracciante è distribuito in circolazione rispetto alle riserve a lungo termine. Inoltre, in alcune circostanze uniche, è possibile ottenere campioni di biopsia epatica da esseri umani che hanno dato il consenso e hanno anche assunto una dose etichettata di vitamina A26,27. Questi campioni sono utili anche per la convalida e il test della miscelazione di 13C-retinolo. L'elaborazione del campione di fegato inizia con la macinazione di un campione misurato con solfato di sodio anidro per intrappolare l'acqua e rompere il tessuto. Questo viene poi estratto con 50 ml di cloruro di metilene attraverso la carta da filtro. Una frazione viene essiccata sotto azoto e ricostituita in etanolo con l'aggiunta di idrossitoluene butilizzato allo 0,1% come conservante. Il campione viene saponificato ed estratto con la stessa procedura utilizzata per il latte materno.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH-R01 DC019357 e dal progetto di ricerca coordinato dell'AIEA E43035.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale di riferimento 13C tracciabile alla scala VPDB-LSVEC (Sucrosio)Agenzia Internazionale per l'Energia AtomicaAIEA-CH-6 Nome del National Institute of Standards and Technology: RM 8542
Acetonitrile (grado HPLC)Fischer ScientificUN1648
Etanolo (puro 200 proof, anidro e ge; 99.5%)Sigma459836
Pipette pasteur di vetroQualunque
Provette in vetroQualunque
Elio (grazia di ricerca, (>99,9995% di purezza)Qualunque
EsaniSigma178918
Metanolo (grado MS)VWRMSPP-A-456
Malta e pessetto, ceramicaQualunque
Pipetta a spostamento positivo 3-25 & micro; LGilsonFD10002
Pipetta a spostamento positivo 10-100 & micro; LGilsonFD10004
Pipetta a spostamento positivo 50-250 & micro; LGilsonFD10005
Pipette a spostamento positivo 100-1000 & micro; LGilsonFD10006
Idrossido di potassioFisher ScientificUN1813
Carta filtro qualitativa #1 150 mmWhatman1001-150
Fumaioli separatoriQualunque
Solfato di sodio, anidroFischer ScientificS415-212
Fiaschette volumetriche (50 mL)Qualunque

Riferimenti

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

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