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Articolo metodologico

Sul posto Rilevamento di cellule metabolicamente attive nel tessuto del carcinoma epatocellulare mediante criosezione basata su MTT

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DOI:

10.3791/68575

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31 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un semplice protocollo per rilevare le cellule metabolicamente attive nel tessuto del carcinoma epatocellulare utilizzando l'imaging di criosezione basato su MTT. Questo metodo può essere utilizzato anche per rilevare cellule attive in situ in altri tessuti o organi.

Abstract

Prove emergenti, inclusi studi precedenti, evidenziano una sottopopolazione di cellule all'interno dei tessuti del carcinoma epatocellulare (HCC) che mostrano un'attività metabolica e una resistenza allo stress superiori. Queste cellule sono fattori chiave della progressione del tumore e della resistenza alla terapia. Tuttavia, i metodi esistenti per la rilevazione in situ di cellule vitali spesso compromettono l'integrità dei tessuti, alterano la vitalità cellulare o sono tecnicamente impegnativi. Questo studio presenta un approccio innovativo, semplice e non distruttivo per la rilevazione in situ di cellule metabolicamente attive nei tessuti HCC attraverso la riduzione mitocondriale-dipendente del 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) a cristalli di formazano insolubili. Ottimizzando le dimensioni dei frammenti di tessuto (1 × 1 × 0,2 cm3), le condizioni di coltura (20% FBS, 1 mg/mL MTT e 3 ore di incubazione con vortice intermittente) e i parametri di criosezione (spessore 20 μm, fissazione PFA al 4% e controcolorazione DAPI), la mappatura spaziale delle cellule HCC vitali è stata ottenuta entro 5 ore. Questo protocollo economico non richiede attrezzature specializzate e mantiene l'architettura tissutale, consentendo l'identificazione spaziale di cluster cellulari ad alta vitalità e resistenti allo stress nelle regioni superficiali. Le limitazioni includono la progressiva perdita di vitalità oltre le 6 ore e lo spostamento dei cristalli durante il sezionamento, che può essere mitigato attraverso l'integrazione di FBS e il congelamento controllato. Questo metodo fornisce una piattaforma pratica per l'isolamento di singole cellule di sottopopolazioni resistenti alla terapia, facendo progredire la ricerca sul microambiente dell'HCC.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC), la terza causa di decessi correlati al cancro a livello globale, è caratterizzato da un'elevata eterogeneità e tassi di recidiva1. Questa eterogeneità spaziale e temporale rende alcune popolazioni cellulari all'interno dei tessuti tumorali più attive di altre nel metabolismo, nella proliferazione, nella progressione, nella tolleranza allo stress e nella resistenza ai farmaci. La rilevazione in situ di cellule vitali all'interno dei tessuti HCC ha un profondo significato clinico e biologico, poiché queste cellule comprendono subcloni proliferanti, popolazioni resistenti alla terapia e cellule che iniziano metastasi. Tali cellule vitali potrebbero fungere da fattori critici della recidiva del tumore, dell'evasione immunitaria e del fallimento terapeutico2.

Tuttavia, le attuali tecnologie di profilazione spaziale (ad esempio, la trascrittomica spaziale) richiedono strumentazione specializzata e sono associate a costi elevati, mentre le tradizionali analisi di massa spesso trascurano l'eterogeneità spaziale delle cellule vitali e le loro interazioni dinamiche con le componenti stromali3. Ad esempio, le cellule HCC vitali residue post-resezione mostrano profili metabolici distinti che non possono essere ricapitolati fedelmente in sistemi cellulari dissociati4. Pertanto, l'avanzamento delle tecnologie di rilevamento spazialmente risolte è fondamentale per svelare il crosstalk funzionale tra le cellule tumorali vitali e il loro microambiente, informando in ultima analisi le strategie terapeutiche di precisione. Sebbene i metodi convenzionali come la citometria a flusso o l'immunoistochimica (IHC) siano stati utilizzati dal nostro gruppo per rilevare le cellule vitali nell'HCC, richiedono la dissociazione o la fissazione dei tessuti, perdendo così il contesto spaziale e ostacolando l'analisi delle interazioni cellula-cellula 5,6. Pertanto, lo sviluppo di tecnologie non distruttive e ad alta risoluzione per il rilevamento in situ di cellule vitali è fondamentale per chiarire i meccanismi di resistenza all'HCC e guidare le terapie di precisione.

Per rilevare e visualizzare rapidamente le cellule vitali nei tessuti HCC in situ senza trattamento distruttivo, è stato sviluppato un semplice metodo di coltura tissutale basato su 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). In breve, i tessuti sottili freschi di HCC (circa 1 × 1 × 0,2 cm3) sono stati prima coltivati in terreno DMEM per 3 ore contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS) e MTT (1 mg/mL). Quindi, dopo la fissazione con paraformaldeide (PFA) al 4% e il montaggio contenente DAPI, i vetrini di tessuto congelato inclusi in OCT (spessore 20 μm) sono stati sottoposti a osservazione microscopica sotto luce intensa o UV. Le celle vitali mostreranno una colorazione viola, viola-rosso o viola-nera. Utilizzando questo protocollo, abbiamo rilevato con successo le cellule vitali nei tessuti HCC entro 5 ore. Nel frattempo, questo metodo preserva la microarchitettura 3D, è compatibile con l'analisi multi-omica a valle ed è semplice, oltre che rispettoso dei tempi e dei costi. Tuttavia, questo metodo presenta alcune limitazioni. I processi in più fasi di lavaggio, sezionamento e coltura possono indurre deformazione strutturale e apoptosi nei tessuti, specialmente in campioni ad alto metabolismo metabolico, come il tessuto HCC in questo studio. Inoltre, l'aumento dello spessore delle fette di criosezione compromette la chiarezza e la planarità delle osservazioni microscopiche.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvati dal Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato di Quanzhou (n. FJMU IACUC2021257). I tessuti HCC sono stati rimossi chirurgicamente e raccolti presso il Quanzhou First Hospital, affiliato alla Fujian Medical University, con il consenso informato dei pazienti. Questo esperimento richiede misure protettive standard, tra cui l'uso di un camice da laboratorio, una maschera monouso e guanti.

1. Preparazione dei tessuti

  1. Mettere una capsula di Petri sterile di 9 cm sul ghiaccio. Aggiungere 30 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) ghiacciato.
  2. Trasferire immediatamente il tessuto HCC umano resecato chirurgicamente nel PBS.
  3. Agitare delicatamente il piatto per 5 secondi per rimuovere i contaminanti del sangue. Aspirare il PBS utilizzando una pipetta sterile.
    NOTA: Ripetere tre volte.
  4. Trasferire il fazzoletto sul coperchio della capsula di Petri.
    NOTA: I fazzoletti aderiscono facilmente al coperchio della piastra di Petri non bagnato per una migliore manipolazione successiva.
  5. Tagliare il tessuto in circa 1 × 1 ×0,2 cm 3 frammenti utilizzando una lama chirurgica sterile (n. 11).
    NOTA: La lunghezza e la larghezza dei frammenti possono essere modificate, ma la profondità deve essere inferiore a 0,2 cm.
  6. Rimetti i frammenti in un piatto fresco di 9 cm riempito con 30 ml di PBS ghiacciato.
  7. Agitare delicatamente il piatto per 5 secondi per rimuovere i contaminanti del sangue. Aspirare il PBS utilizzando una pipetta sterile.
    NOTA: Ripetere il passaggio 1.7 tre volte. Un frammento di tessuto bollito in PBS (95 °C, 10 min) è stato impostato come controllo negativo. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili.

2. Coltura tissutale

  1. Aggiungere 1,8 mL di terreno di coltura completo DMEM (preriscaldato a 37 °C) contenente glucosio (concentrazione finale = 4,5 g/L) e L-glutammina (concentrazione finale = 2 mM) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Quindi, aggiungere 0,6 mL di FBS (concentrazione finale = 20% v/v) e 0,6 mL di stock MTT (concentrazione finale = 1 mg/mL) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
  2. Trasferire i frammenti di tessuto in pozzetti utilizzando una pinza sterile.
  3. Posizionare la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore. Incubare per 3 ore a 37 °C con CO2 al 5%.
    NOTA: Agitare delicatamente la piastra per 3 s ogni 30 minuti. L'incubazione potrebbe essere terminata una volta che la superficie dei frammenti di tessuto diventa viola o viola-nera.

3. Terminazione e fissazione

  1. Aspirare il mezzo MTT. Lavare i frammenti di tessuto con soluzione salina ghiacciata.
    NOTA: Ripetere cinque volte.
  2. Aggiungere 2 mL di formalina tamponata neutra (NBF) al 4% in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
  3. Mettere il piatto in frigorifero a 4 °C per 1 h.

4. Criosezione

  1. Tamponare delicatamente i frammenti su carta assorbente pulita.
  2. Posizionare il tessuto in un criomold riempito con composto OCT.
    NOTA: Assicurarsi che il tessuto sia completamente coperto con il composto OCT.
  3. Congelare il fazzoletto in frigorifero a bassa temperatura a -80 °C per 20 minuti.
  4. Montare il blocco congelato su un mandrino criostatico a -20 °C.
  5. Tagliare sezioni da 100 μm a -20 °C fino a quando la superficie del tessuto non è esposta.
    NOTA: La superficie del tessuto mostra una colorazione simile al viola.
  6. Raccogli fette da 20 μm utilizzando vetrini rivestiti di adesivo.
    NOTA: Le fette di tessuto devono presentarsi in una tonalità di viola, rosso porpora o viola-nero.
  7. Fissare le fette in paraformaldeide (PFA) al 4% a temperatura ambiente per 2 min.
  8. Sciacquare delicatamente i vetrini con PBS per 1 minuto.
    NOTA: Ripetere tre volte.

5. Montaggio

  1. Applicare 1 goccia di terreno di montaggio contenente DAPI (concentrazione finale: 1 μg/mL).
  2. Coprire con un vetrino coprioggetti.
  3. Sigillare i bordi con lo smalto.
    NOTA: I vetrini con bordi sigillati possono essere conservati a 4 °C al buio se la microscopia non viene eseguita immediatamente.

6. Microscopia

  1. Visualizzare depositi di formazan viola, rosso-porpora o viola-scuro (cellule vitali) con un ingrandimento del 20× in campo chiaro utilizzando la microscopia in campo chiaro.
  2. Rileva il blu DAPI (nuclei) sotto illuminazione UV utilizzando la microscopia a fluorescenza.
  3. Unisci i canali del campo chiaro e della fluorescenza per la correlazione spaziale.
    NOTA: Il software utilizzato qui è NIS Element F (versione 4.00.06).

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Risultati

Questo studio ha rilevato con successo cellule metabolicamente attive nel tessuto HCC senza interrompere l'architettura tissutale. In primo luogo, le immagini in campo chiaro (Figura 1A) hanno mostrato che la superficie del tessuto mostrava una densa copertura cellulare e un impilamento multistrato di cellule attraverso il vetrino, confermando l'integrità architettonica preservata del tessuto HCC durante la coltura e la lavorazione. In particolare, i gruppi di cellule all'interno delle regio...

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Discussione

Le attuali metodologie per il rilevamento in situ di cellule vitali devono ancora affrontare molteplici limitazioni. L'IHC e l'immunofluorescenza (IF), che sono ampiamente utilizzate per identificare marcatori di proliferazione o proteine correlate all'apoptosi, soffrono di interruzione dell'integrità della membrana indotta dalla fissazione della formaldeide7. Inoltre, la penetrazione degli anticorpi in sezioni di tessuto spesso è subottimale

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (n. 3502Z20227197), il Fondo per la ricerca scientifica della Fujian Medical University (2021QH1240). Ringraziamo Xianying Zhang, Jingjing Zhou e Shaocong Weng (Università di Huaqiao) per la loro assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
-80 ° Congelatore C (verticale)Thermo Fisher ScientificTSX60086V
Panca pulita (flusso laminare verticale)AIRTECHSW-CJ-1FD
Incubatore CO2 (165 L)Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i (ad esempio, 51030400 / 51033559)
Coverslip (24 e volte; 50 mm, #1.5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
Piastra di Petri di cultura (90 mm)NIDO752001 (esempio)
Mezzo di montaggio contenente DAPIBeyotimeP0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (glucosio alto, con piruvato)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (Qualificato, origine USA)Invitrogen (Gibco)A3160501
Microscopio fluorescenteNikonSerie ECLIPSE Ti2
Microtomo congelante (criostato)LeicaCM1950
Vetri per microscopio (semplici, 25 volte e più; 75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
Reagente MTT (polvere)BeyotimeST316
Smalto per unghie (trasparente)Beyotime—
NBF (Formalina Neutrale Bufferizzata)Beyotime—
Composto OCTSAKURA (Sakura Finetek)4583
Microscopio ottico (verticale)NikonSerie Ci ECLIPSE (ad esempio, Ci-L)
PBS (500 mL)BeyotimeC0221A
PFA, 4% nel PBS (fissativo)BeyotimeP0099
Punta della pipetta (1 mL, legatura bassa)KIRGENKG1313-L
Punta a pipetta (200 & micro; L)Assidio (Corning)T-200-Y (ingombro) / T-200-Y-R-S (racked, sterile)
Pipettor (canale singolo)Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2 (cat# specifico per gamma)
BisturiESISTANTEIl modello varia (ad esempio, riferimento fornitore 100022208326)
PinzettaESISTANTEIl modello varia

Riferimenti

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