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Articolo metodologico

Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli

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DOI:

10.3791/68577

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29 agosto 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive una metodologia per sovraesprimere la Nsp15 ricombinante, una nucleasi tossica, in un sistema di espressione C41(DE3), seguita dalla purificazione della proteina marcata utilizzando la cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine tossiche impegnative.

Abstract

L'Escherichia coli è stato ampiamente impiegato come sistema di espressione per produrre proteine ricombinanti. Tuttavia, alcuni tipi di proteine ricombinanti, come le nucleasi, possono essere difficili da sovraesprimere in modo ricombinante in E. coli a causa della loro attività enzimatica sul DNA cellulare o sull'RNA. Tali effetti tossici possono portare a una crescita lenta e a una scarsa resa proteica. Uno di questi esempi è l'endoribonucleasi Nsp15 dei coronavirus: le rese di gamma-coronavirus wild-type (WT) Nsp15 sono molto più basse di quelle di Nsp15 cataliticamente inattive. Per affrontare questo problema, abbiamo impiegato l'uso di cellule C41 (DE3) e colture starter di singole colonie nello stesso giorno per aiutare a ridurre la tossicità. La Nsp15 ricombinante contenente un tag 6xHis-terminale N-terminale è stata sovraespressa e purificata mediante cromatografia di affinità a base di cobalto seguita da cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Le rese risultanti di proteine purificate sono sufficienti per saggi biochimici e studi strutturali di microscopia crioelettronica. Questo approccio si è dimostrato efficace nel mitigare gli effetti tossici e nel raggiungere rese proteiche soddisfacenti per ulteriori analisi di ricerca.

Introduzione

L'Escherichia coli (E. coli) è un batterio ampiamente utilizzato per produrre proteine ricombinanti. Numerosi ceppi mutanti, tra cui BL21(DE3) e i suoi derivati, sono stati sviluppati per esprimere la proteina bersaglio1. Il processo è tipicamente guidato da un batteriofago codificato T7 RNA polimerasi e indotto con isopropil ß-D1-tiopalactopiranoside (IPTG), un analogo del lattosio che attiverà l'operone lac rilasciando il repressore lac 1,2,3. Poiché non è idrolizzabile, c'è un'espressione continua di mRNA e una maggiore produzione di proteine3.

Sebbene questo tipo di sistema sia conveniente e coerente per molte proteine, alcuni tipi di proteine ricombinanti inducono tossicità in E. coli, portando a scarse rese proteiche. La tossicità dovuta alla presenza di proteine ricombinanti che influenzano negativamente i batteri può essere dovuta a un'espressione permeabile prima dell'induzione o allo stress dei batteri dopo l'induzione 3,4. Il risultato è una diminuzione del tasso di crescita e della vitalità dei batteri5. La soppressione dell'espressione permeabile può svolgere un ruolo importante nell'espressione di proteine tossiche. I ceppi di espressione di E. coli con plasmidi pLysS (ad esempio, BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS, ecc.) sopprimono l'espressione permeabile esprimendo un lisozima T7 che inibisce la polimerasi T7 prima dell'induzione 6,7. Altri ceppi, come i ceppi C41(DE3) e C43(DE3), contengono mutazioni che riducono l'attività della polimerasi T7 riducendo i suoi livelli di mRNA e rimuovono le proteasi lon e ompT 1,4,8,9,10. Sopprimere l'espressione permeabile o ridurre il tasso di produzione di proteine ricombinanti (attraverso la regolazione della polimerasi T7 o la diminuzione delle temperature) aiuta ad aumentare la resa di proteine tossiche 1,9.

Le nucleasi sono spesso proteine tossiche e difficili da esprimere quando si utilizza un sistema di espressione di E. coli a causa della loro attività enzimatica nei confronti del DNA cellulare o dell'RNA1. Ad esempio, l'endoribonucleasi Nsp15 presente nei coronavirus e in altri nidovirus è tossica per i batteri, con conseguente rallentamento del tasso di crescita e basse rese 11,12,13,14,15,16,17. A causa del suo ruolo catalitico, scindendo 3' di uridine nell'RNA virale, si ritiene che Nsp15 agisca sia sul proprio mRNA che su quello cellulare quando espresso in modo ricombinante, il che si traduce in una disregolazione del metabolismo e nell'espressione proteica ricombinante11,14. Per Nsp15, l'oligomerizzazione è necessaria per l'attività enzimatica. Precedenti studi sul beta-coronavirus (come SARS e SARS-CoV-2) Nsp15 hanno dimostrato che l'enzima si oligomerizza principalmente in un omoesamero in soluzione, con la forma monomerica inattiva 16,18,19,20. Quando mutati per formare solo monomeri, sono stati osservati aumenti significativi della resa14. Inoltre, quando si muta uno dei residui catalitici all'interno della triade catalitica in alanina, è stata osservata una migliore espressione nelle stesse condizioni del WT, supportando ulteriormente che la tossicità di Nsp15 per E. coli è guidata dalla sua attività nucleasica 13,16,17. In questo protocollo, mostriamo la differenza di resa tra WT gamma-coronavirus (Infectious Bronchitis Virus) Nsp15 e una versione catalitica-morta ottenuta mutando uno dei residui catalitici di istidina (H223A).

Qui descriviamo una metodologia passo-passo per sovraesprimere Nsp15 ricombinante in un sistema di espressione C41(DE3), seguita dalla purificazione delle proteine attraverso la cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale. Per isolare la proteina viene utilizzato un His-tag N-terminale 6x con cromatografia di affinità con metalli immobilizzati a base di cobalto (IMAC). Un'ulteriore purificazione viene eseguita tramite SEC per separare Nsp15 in base allo stato oligomerico e isolare le specie esameriche attive. Questo approccio offre un metodo per sovraesprimere e purificare le nucleasi tossiche per studi biochimici e strutturali.

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Protocollo

1. Preparazione del tampone e dei reagenti

  1. Reagenti per sovraespressione
    1. Preparare 1 L di terreno 2xTY combinando 16 g di triptone, 10 g di estratto di lievito, 5 g di cloruro di sodio (NaCl) e 900 mL di acqua deionizzata in un pallone da 2 L. Autoclavare il pallone per almeno 30 minuti con ciclo liquido.
      NOTA: Per ogni purificazione sono necessari almeno 2 litri di terreno 2xTY.
    2. Preparare le scorte di antibiotici appropriate per il plasmide. Per Nsp15-pET-14b, produrre 15 mL di 100 mg/mL di ampicillina sciogliendo 1,5 g di ampicillina con acqua deionizzata in una provetta conica da 15 mL. Conservare le scorte di antibiotici a -20 °C fino al momento del bisogno.
    3. Preparare 250 ml di brodo di lisogenesi (LB) in un flacone di vetro da 500 ml. Sterilizzare la soluzione in autoclave per almeno 30 minuti con ciclo liquido e raffreddare fino a quando non è calda al tatto.
    4. Preparare le piastre di agar LB integrate con ampicillina trasferendo 25 mL di terreno di coltura caldo di agar LB in un pallone di Erlenmeyer sterilizzato da 250 mL (25 mL per piastra da preparare). Aggiungere 25 μL di 100 mg/mL di ampicillina per ogni 25 mL di terreno e agitare per combinare il contenuto. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 25 mL di miscela di terreno in una capsula di Petri di plastica sterile; Evitare di introdurre bolle.
      1. Previeni la contaminazione pulendo il banco del laboratorio con etanolo al 20% e accendendo un bruciatore Bunsen per mantenere la sterilità durante il versamento delle piastre.
      2. Lasciare raffreddare le piastre prima di riporle a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
    5. Preparare 15 mL di IPTG 1 M sciogliendo 3,574 g di IPTG con acqua deionizzata in una provetta conica da 15 mL. Conservare a -20 °C fino al momento del bisogno. Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento alizzando in tre aliquote da 5 mL.
  2. Reagenti per la purificazione
    NOTA: Tutti i reagenti devono essere preparati almeno un giorno prima della purificazione
    1. Preparare 250 mL di tampone di lisi (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 5 mM imidazolo) e conservare a 4 °C.
    2. Preparare 15 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 250 mM imidazolo) e conservare a 4 °C fino al momento del bisogno.
    3. Preparare 250 mL di tampone di scissione (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo) e conservare a 4 °C fino al momento del bisogno.
    4. Preparare 1 L di tampone SEC (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2) e filtrare attraverso un filtro PES da 0,22 μm utilizzando la filtrazione sottovuoto. Conservare a 4 °C con FPLC.
    5. Preparare 15 mL di 1 M di 4-(2-amminoetil)benzensulfonilfluoruro cloridrato (AEBSF) sciogliendo 3,595 g di AEBSF con acqua deionizzata in una provetta conica da 15 mL. Preparare aliquote da 1 mL in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -20 °C fino al momento del bisogno.
    6. Opzionale: Preparare la miscela madre di tampone caricante gel di sodio dodecil solfato (SDS) diluendo 200 μL di soluzione madre (250 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,1% blu di bromofenolo, 40% glicerolo, 100 mM DTT) in 400 μL di acqua deionizzata.
    7. Preparare le provette per campioni di gel per monitorare la purificazione. Trasferire 30 μl di tampone di caricamento 1x in ciascuna provetta.
    8. Preparare 1 litro di tampone da corsa 10x Tris-glicina sciogliendo 30 g di base Tris, 144 g di glicina e 20 g di SDS, in 1000 ml di acqua deionizzata. Per una soluzione 1x, diluire 100 mL della soluzione 10x in 900 mL di acqua deionizzata in un flacone da 1 L. Conservare entrambi i reagenti a temperatura ambiente fino a nuovo utilizzo.

2. Sovraespressione di Nsp15

NOTA: Tutti i reagenti e i materiali devono essere mantenuti il più sterili possibile per prevenire il rischio di contaminazione.

  1. Trasformazione
    1. Rimuovere le cellule di E. coli C41(DE3) da -80 °C per scongelarle per 10 minuti con ghiaccio. Pipettare 1 μL di DNA plasmidico in una provetta contenente le cellule C41. Lasciarlo incubare lasciandolo riposare sul ghiaccio per 30 minuti.
      NOTA: Sebbene le concentrazioni di plasmidi possano variare, per i dati qui descritti, sono stati aggiunti 10-20 ng di DNA per trasformazione. Il protocollo commerciale per le cellule C41(DE3) raccomanda 10-50 ng di DNA per trasformazione. Questo protocollo è applicabile a qualsiasi plasmide che utilizza il sistema promotore T7; tuttavia, qui un plasmide pET14b precedentemente pubblicato che codifica per il codone ottimizzato per Nsp15, con un sito TEV che segue il tag 6xHis-terminale N-terminale e il sito di scissione della trombina, è stato modificato sostituendo SARS-CoV-2 Nsp15 con la sequenza IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Posizionare la provetta in un blocco termico a 42 °C per 45 s per lo shock termico delle cellule per assorbire i plasmidi. Incubare la provetta con ghiaccio per 2 minuti.
    3. Pipettare 200 μl di terreno di recupero (SOC o altri terreni ricchi) nella provetta contenente le cellule C41(DE3) e i plasmidi. Agitare a 210 giri/min per 1 ora a 37 °C.
    4. Rimuovere le piastre di agar LB integrate con ampicillina a partire da 4 °C e metterle in un'incubatrice non agitante impostata a 37 °C.
    5. Pipettare i batteri sulla piastra di agar. Utilizzando uno spandiconcime sterile, stendere le cellule sulla piastra agar. Mettere la piastra in un'incubatrice non agitante impostata a 37 °C per far crescere per 14-16 ore.

3. Crescita

  1. Prelievo di una singola colonia
    NOTA: Per inoculare le cellule nella fase di crescita logaritmica, sono stati utilizzati starter a singola colonia nello stesso giorno anziché una coltura starter notturna. Per le colture notturne, le cellule sono tipicamente in fase stazionaria o di morte, soprattutto con proteine tossiche. Inoltre, dati tempi di coltura più lunghi, i contaminanti o i mutanti possono competere con la nucleasi tossica.
    1. Utilizzare un pallone di Erlenmeyer sterilizzato da 50 ml per ogni litro di coltura più 2-3 starter aggiuntivi. Etichettare uno dei palloni con una stella per i controlli della densità ottica (OD). Il diametro esterno raccolto da questo pallone rappresenterà l'intera crescita, a meno che non vi sia una differenza visiva tra i palloni.
      NOTA: È stato riscontrato che i flaconi di Erlenmeyer forniscono un'aerazione migliore rispetto alle provette di avviamento da 15 mL.
    2. Creare una miscela master di 2xTY più antibiotici appropriati utilizzando un volume di 10 ml x N numero di starter. Per una crescita di 4 L, fare 6 colture iniziali. La miscela master sarebbe composta da 60 μL di stock di ampicillina (scongelato da -20 °C) e 60 mL di 2xTY (diluizione 1:1000). Agitare per mescolare e aliquotare 10 mL in ciascun Erlenmeyer.
    3. Rimuovere la piastra trasformata dall'incubatrice. Estrarre una singola colonia isolata dalla piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile o la punta di una pipetta. Trasferire lo stuzzicadenti con la colonia in un pallone con il terreno. Ripetere l'operazione fino a quando ogni fiaschetta contiene uno stuzzicadenti.
    4. Introdurre i palloni di avviamento inoculati nell'incubatore di agitazione a 210 giri/min, 37 °C. Lasciare crescere i palloni di avviamento per ~5-7 ore.
  2. Inoculazione della coltura
    1. Dopo 5 ore, controllare il diametro esterno a 600 nm (OD600) del pallone contrassegnato da una stella utilizzando una microcuvetta e uno spettrometro. Prelevare e trasferire 1 mL di coltura dal matraccio in una microcuvetta. Ripetere periodicamente le misurazioni fino a quando l'OD600 raggiunge 0,8-1,0.
    2. Da 30 minuti a 1 ora prima dell'inoculazione (quando OD600 raggiunge 0,4), riscaldare i palloni da 2 L 2xTY a 37 °C. I terreni caldi riducono il tempo di ritardo dopo l'inoculazione con la coltura starter.
    3. Scongelare una dose di ampicillina da 100 mg/mL a partire da -20 °C. Una volta raggiunto l'OD target di600 , preparare quattro matracci da 2 L con 1 L di terreno 2xTY aggiungendo 1 mL di 100 mg/mL di ampicillina (diluizione 1:1000).
    4. Per l'inoculazione, versare il contenuto di un pallone iniziale in un pallone da 2 L. Ripetere fino a quando ogni pallone da 2 L è stato inoculato. Evita di versare lo stuzzicadenti nel pallone per facilitare la raccolta delle cellule.
    5. Introdurre i palloni da 2 L inoculati nell'incubatore di agitazione a 210 giri/min, 37 °C per 3 ore prima di controllare il primo OD600.
  3. Induzione con IPTG
    1. Controllare l'OD600 rimuovendo 1 mL di terreno da un pallone con una pipetta sierologica. Ripetere fino a quando l'OD600 raggiunge 0,8-1,0.
    2. Una volta raggiunto l'OD target di600 , aggiungere 1 mL di IPTG da 1 M per una concentrazione finale di 1 mM (scongelata da -20 °C) per indurre la sovraespressione.
    3. Trasferire i palloni da 2 L in un'incubatrice ad agitazione a 210 giri/min, 16 °C per l'induzione notturna (14-16 h).
      NOTA: La temperatura più fredda rallenterà la crescita delle cellule di E. coli , riducendo la tossicità rallentando la produzione di proteine e l'attività della nucleasi.
  4. Raccolto
    1. Estrarre i palloni indotti dall'incubatore di agitazione e versare il contenuto in flaconi da centrifuga separati da 1 L. Bilanciare le bottiglie con acqua deionizzata. Centrifugare le celle a 4500 x g per 10 minuti a 4 °C.
    2. Rimuovere il surnatante e trasferire il pellet in una provetta conica da 50 mL utilizzando una spatola. Unire i pellet in un unico tubo conico. Conservare a -80 °C fino a nuovo utilizzo.

4. Purificazione Nsp15

NOTA: Tutti i tamponi e le provette devono essere mantenuti in ghiaccio. Tutte le fasi di centrifugazione devono essere eseguite a 4 °C. Il seguente protocollo presuppone una proteina marcata con His.

OPZIONALE: Dopo ogni fase, è possibile prelevare campioni di gel per seguire l'avanzamento della purificazione.

  1. Lisi cellulare e chiarificazione del lisato
    1. Risospendere il pellet batterico aggiungendo 2 mL di tampone di lisi per ogni 1,2 g di pellet. Aggiungere 100 μL di AEBSF da 1 M per ogni 10 mL di tampone di lisi come inibitore della proteasi. Se si utilizza un pellet combinato da 4 L, aggiungere 100 μL di DNasi I per una concentrazione finale di 200 U.
      NOTA: Una compressa di cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA per L può essere sostituita come inibitore della proteasi.
    2. Agitare brevemente il contenuto del tubo per 30 s per consentire al pellet e al tampone di mescolarsi. Trasferire il pellet vortexed in un macina fazzoletti Dounce. Con un pestello sciolto, omogeneizzare il contenuto (~10 colpi).
    3. Trasferire il campione omogeneizzato in un becher di metallo per la sonicazione.
      1. Per ottenere il massimo campione, sciacquare la provetta contenente il pellet originale con 5 mL di tampone di lisi e agitare brevemente la provetta. Versare il contenuto nell'omogeneizzatore Dounce, applicare ~5 colpi e quindi trasferire nel becher di sonicazione.
    4. Al becher di metallo, aggiungere 75 μl di Triton X-100 per facilitare la lisi e la solubilizzazione della membrana. Posizionare il becher di metallo in un bagno di ghiaccio per garantire che il campione rimanga freddo durante la sonicazione.
    5. Posizionare la sonda di sonicazione nel becher metallico e sonicare il campione per 6 minuti e 30 secondi con impulsi ogni 2 secondi e amplificazione al 70%.
      ATTENZIONE: Utilizzare protezioni per l'udito se la sonda del sonicatore non è chiusa.
    6. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il lisato in una provetta da centrifuga. Nella stessa provetta, aggiungere 1 M di AEBSF a una diluizione 1:100 come nuovo inibitore della proteasi. Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 26,915 x g per 50 min.
  2. Cromatografia di affinità mediante filtrazione per gravità
    NOTA: La resina di cobalto riduce significativamente i leganti metallici non specifici rispetto alla resina di nichel21.
    1. Durante la sonicazione, prelevare 2 mL di impasto di resina di cobalto e risospendere con 25 mL di tampone di lisi in una nuova provetta conica. Centrifugare la resina risoluta per 5 minuti a 500 x g. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante, facendo attenzione a non perdere resina.
    2. Ripetere con due lavaggi separati di tampone di lisi da 25 mL seguiti da centrifugazione. Non versare il surnatante dell'ultimo lavaggio fino al momento della rilegatura in batch. Quando è pronto, versare il tampone di lisi dall'ultimo lavaggio della resina e risospendere la resina con 10 ml di tampone di lisi fresco (10 ml di tampone per 1 ml di resina).
    3. Aggiungere la frazione solubile alla provetta e lasciare che la proteina marcata con His-taged 6x si leghi in batch alla resina su un bilanciere per 45 minuti a 4 °C.
      NOTA: Se il volume di rilegatura del batch supera i 50 mL, eseguire questo passaggio in un becher da 250 mL con una barra di agitazione a una velocità molto bassa a 4 °C. Trasferire tutta la resina nel becher quando si esegue questo passaggio utilizzando il tampone di lisi.
    4. Dopo la legatura in batch, versare il contenuto in una colonna di filtrazione a gravità e raccogliere il flusso in un pallone di Erlenmeyer da 125 mL. Il contenuto all'interno del pallone deve essere qualsiasi proteina che non si sia legata alla resina; L'Nsp15 con etichetta His-tagged sarà legato alla resina. Utilizzando un pallone separato per la raccolta, lavare la resina con 8 x 25 mL di tampone per un totale di almeno 200 mL (~5 volte il volume originale) utilizzando una pipetta sierologica.
      NOTA: Aggiungere lentamente il tampone lungo il lato della colonna anziché direttamente al centro per evitare di disturbare il letto di resina, che può portare a un lavaggio inefficiente o irregolare.
  3. Eluizione proteica
    1. Eluire l'Nsp15 marcato con His-taged in tre eluizioni con tampone di eluizione. Le eluizioni 1 e 2 sono eluizioni da 2 mL e l'eluizione 3 è un'eluizione da 1 mL.
    2. Eseguire un test Bradford "rapido e sporco" effettuando una diluizione 1:1 del reagente Bradford in acqua. Trasferire 10 μl di ciascuna eluizione in provette e capovolgere per mescolare. La soluzione dovrebbe diventare blu in presenza di proteine. Valutare il cambiamento di colore per determinare come combinare le eluizioni.
      NOTA: Se le eluizioni 1 e 2 sono forti e l'eluizione 3 è debole, combinare le eluizioni 1 e 2 e procedere. Se tutti sono deboli, combina tutti e tre i tubi.
  4. Concentrazione proteica e scissione dei tag
    1. Trasferire il campione di eluizione combinata in un concentratore MWCO da 30 kD (o di dimensioni appropriate per la proteina di interesse). Concentrare la proteina a ≤2 ml centrifugando a 3.000 x g per 10 minuti. Trasferire il campione concentrato in una provetta da microcentrifuga da 2 mL. Se necessario, portare il volume finale del campione a 2 mL con tampone di scissione.
    2. Preparare una colonna di desalinizzazione usa e getta (ad es. colonna PD-10) secondo le indicazioni del produttore. Aggiungere il campione da 2 mL alla colonna. Posizionare la colonna in una provetta conica pulita da 50 mL ed eluire mediante centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti.
      NOTA: Questo passaggio rimuove rapidamente l'imidazolo, che interferisce con la scissione della trombina evitando l'aggregazione indotta dalla concentrazione quando si utilizzano concentratori MWCO per lo scambio di tamponi.
    3. All'eluato, aggiungere β-Me e CaCl2, fino a una concentrazione finale di 2 mM ciascuno. Aggiungere 50 μl di un stock di trombina da 1 U/μl. Dopo aver aggiunto tutti i componenti, posizionare la provetta su uno shaker in posizione verticale e lasciare che la reazione incubi a temperatura ambiente per 4 ore agitando delicatamente.
      NOTA: La scissione notturna a 4 °C può funzionare per alcune proteine; sono state osservate rese migliorate di Nsp15 con una scissione di 4 ore a RT rispetto a una scissione notturna di 4 °C.
    4. Riequilibrare la colonna di filtrazione a gravità nel tampone di scissione (lavare 3 volte con 25 mL di tampone di scissione). Assicurarsi che il rubinetto di arresto sia chiuso e aggiungere 5 ml di tampone di scissione per evitare che la resina si secchi. Conservare la colonna a 4 °C durante il periodo di scissione.
  5. Separazione della proteina scissa dall'His-tag scisso e dalla proteina non scissa
    1. Utilizzando una pipetta sierologica, pipettare con cura la reazione di scissione direttamente sulla resina e raccogliere l'eluato in una provetta conica da 15 mL.
    2. Lavare la resina con 2 mL di tampone di scissione e raccoglierla nella stessa provetta da 15 mL. Ripetere per un totale di due lavaggi. Al termine, aggiungere AEBSF alla provetta per spegnere la trombina per ottenere una concentrazione finale di 10 mM.
    3. Trasferire il campione di ripass in un nuovo concentratore MWCO da 30 kD. Concentrare la proteina fino a ≤500 μl mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 minuti. Trasferire il campione concentrato in una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL.
  6. Cromatografia ad esclusione dimensionale
    1. Eseguire una colonna analitica di aumento S200 (o un'altra colonna di dimensionamento appropriata per la proteina di interesse) secondo le specifiche del produttore. Equilibrare nel tampone SEC e impostare la dimensione della frazione FPLC a 500 μL.
    2. Trasferire le provette delle frazioni selezionate dai picchi in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 2,5 μL di 1 M DTT (concentrazione finale 5 mM) a ciascuna frazione per mantenere ridotta la Nsp15 purificata.
    3. Misurare i valori A280 di ciascuna frazione utilizzando un nano-spettrofotometro. Svuotare lo strumento con il tampone SEC prima di raccogliere le misurazioni. Conservare i campioni di Nsp15 purificati a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
  7. Opzionale: Controllo della purificazione
    1. Riscaldare le provette per campioni di gel su un blocco termico a 95 °C per 10 minuti. Centrifugare brevemente le provette dopo il riscaldamento per eliminare la condensa. Caricare i campioni su gel/s Mini-Protean TGX al 4-20% antimacchia e farli funzionare a 300 V per 17 minuti. Immagine del/i gel/i per verificarne la purezza.

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Risultati

A causa della tossicità di Nsp15 come nucleasi, di solito era necessario un totale di ~7 ore perché le colture starter raggiungessero un OD600 di 0,8-1,0. Una volta inoculato, era tipicamente necessario un totale di ~3-5 ore per lo stesso OD600 ottimale di 0,8-1,0 per l'induzione. In questo caso, il tempo di raddoppio sembrava essere ~1 h. Quando è stato espresso un mutante catalitico-morto di Nsp15, il raddoppio per le cellule di E. coli è apparso normale (~20 min), ulteriore prova che l'a...

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Discussione

Abbiamo presentato un protocollo dettagliato che porta alla sovraespressione di una nucleasi tossica in E. coli e alla purificazione mediante cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale. L'implementazione di colture starter a singola colonia da 10 mL nello stesso giorno invece di colture starter notturne ha aumentato la coerenza nei tempi di crescita e la resa proteica tra le crescite. Abbiamo scelto di utilizzare le cellule C41(DE3), che contengono mutazioni che ridu...

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Dichiarazioni

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal College of Charleston School of Natural and Environmental Sciences start-up funding, dal College of Charleston Undergraduate Research and Creative Activities Summer Undergraduate Research with Faculty grant e dal SC INBRE DRP Sub-Award di P20GM103499.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m PES, Sterilizzante, Basso legame proteico, Sistema di filtraggio, 1 LCorning431098
Inibitore della serina proteasi AEBSFGoldbio30827-99-7
Agar, batteriologicoAmrescoJ637
Ä Sistema di purificazione KTA goCitiva29383015
Concentratore MWCO Amicon Ultra 15 mL, 30 kDaMilliporeUFC903024
Ampicillina sodicaGoldbioA-301-25
Palloni a scuotimento deflettoriNalgene F0527
Centrifuga da bancoEppendorf 5920R
Biofotometro plusEppendorfE-BP6132
Trombina bovinaBioPharm91-030
reagente colorante BradfordBoston BioprodottiBPA-200
Blu di bromofenoloSigma-Aldrich114931
Cloruro di calcioSigma-AldrichVisualizzazione del materiale C4901
Bagno a secco digitaleRabbia bio1660562
Spandiconcime monouso, a forma di LPartner MedSupply62-1014-1
DitiotreitoloGoldbio27565-41-9
DNaseI da pancreas bovinoSigma-AldrichD4527
Macina tessuti Douce, 40 mLWheaton357546
Colonne per cromatografia econo-colonnaBio-Rad737-1532
Miscelatore nutatore Enduro minimixRete di laboratorioS0600
EtanoloSigma-Aldrich459844
Excella E25R Inc/Ref AgitatoreEppendorfNB-E25R
FastPette V2Rete di laboratorioP2000
Rotore ad angolo fisso Fiberlite F10-4x1000 LEXThermo Fisher Scientifico096-041075
Rotore ad angolo fisso Fiberlite F21-8x50yThermo Fisher Scientifico096-084275
Gel Doc EZ ImagerBio-Rad1708270
GliceroloSigma-AlrichG5516
GlicinaBio-Rad161-0718
HEPESSigma-AldrichH3375
Agitatore con piastra riscaldanteVWR12365-346
Acido cloridricoVWRBDH3028
ImidazoloGoldbioI-902-25
Isopropil-szlig;-D-tiogalattoside (IPTG)GoldbioCodice 12481C25
Cellule di E. coli competenti Lemo21(DE3)Biolaboratori del New EnglandC2528J
Cloruro di manganese(II) tetraidratoSigma-AldrichCodice: M3634
Provette per microcentrifuga, 0,5 mLVWR87003-290
Provette per microcentrifuga, 1,7 mLPartner MedSupply15-1151
Provette per microcentrifuga, 2 mLAxygenMCT-200-C
Cella per elettroforesi verticale a tetra Mini-PROTEANBio-Rad10025025
Gel Mini-Proteiforme di Tris-glicina, 4-20%Bio-Rad4568094
MyFuge mini centrfugoPartner MedSupplyC1008-B
Flacone da centrifuga superveloce Nalgene da 1 LThermo Fisher Scientifico3141-1006
Provetta da centrifuga Nalgene oak ridgeThermo Fisher Scientifico31139-0050
NanofotometroImplen3769
Incubatrice non agitanteRete di laboratorioI 5110 
Celle Overexpress C41(DE3) chimicamente competentiTecnologie di bioricerca60442-1
Celle Overexpress C41(DE3) chimicamente competentiSigma-AldrichCMC0017Interrotto; Le cellule Biosearch C41(DE3) o le cellule NEB Lemo21 sono un'alternativa
Piastre di PetriPartner MedSupply62-1077-3
Plasmidi (spina dorsale pET-14b)GenscriptOrdine personalizzato
Micro-cuvette in plasticaFisher Scientifico14955127
PowerPacalimentazione universaleBio-Rad1645070
Ago di scorrimento di precisioneBecton Dixon305198
Standard di precisione e proteine non colorateBio-Rad1610363
Terreno di recupero per l'espressione Sigma-AldrichCMR0001K
Rotore a benna oscillante S-4x1000EppendorfEP-S4X1
Pipetta sierologica, 10 mLFaclon357551
Pipetta sierologica, 25 mLFaclon35725
Pipetta sierologica, 5 mLFaclon35743
Pipetta sierologica, 50 mLPr1maPR-SIERO-50
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888
Sodio dodecil solfatoSigma-AldrichL3771
Idrossido di sodioSigma-Aldrich567530
Dismembratore sonicoFisher ScientificoPannello FB505
Centrifuga Sorvall Lynx 4000Thermo Fisher Scientifico75006580
Colonna Spephadex G-25 M PD-10Citiva17085101
ß-MercaptoetanoloMillipore444203
Bicchiere Griffin in acciaio inoxCeramica polare13977-010-EA
Provette Falcon sterili, 15 mLFalcone352097
Provette Falcon sterili, 50 mLFalcone352098
Colonna Superdex 200 10/300 GLCitiva28990944
Siringhe, 1 mLAria-Tite A1
Siringhe, 3 mLBecton Dixon309657
Resina di affinità per metalli TALONTakara635503
StuzzicadentiVia della CreativitàPAC3690-01
Base trisGoldbioT-400-1
Triton X-100MP Biomedicali807423
TriptoneProdotti di ricerca internazionaleCodice: T60065
VornadoBenchmarkBV101-G
Estratto di lievitoProdotti di ricerca internazionaleY20025

Riferimenti

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