Articolo metodologico

Estrazione degli istoni da campioni clinici per profilazione epigenetica tramite spettrometria di massa

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 novembre 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente un'estrazione efficiente degli istoni da vari campioni clinici per una successiva analisi di modifiche post-traduzionali tramite LC-MS/MS. Facilitando una rilevazione robusta delle principali modifiche agli istoni, rappresenta uno strumento prezioso per un profiling epigenetico completo in grandi coorti cliniche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numerose evidenze sperimentali supportano il ruolo dei meccanismi epigenetici nell'esordio, nella progressione e nella recidiva del cancro. Tra queste, le varianti degli istoni e le loro modifiche post-traduzionali (PTM) regolano l'organizzazione e la dinamica della cromatina, nonché l'accessibilità genomica, influenzando così processi chiave basati sul DNA, come la trascrizione, la replicazione e la riparazione del danno al DNA tramite il cosiddetto codice degli istoni. Schemi PTM degli istoni disregolati sono frequentemente osservati nei tumori, con alcuni marcatori che si sono dimostrati funzionare come biomarcatori diagnostici e prognostici. Pertanto, nuove metodologie che permettono una profilazione PTM degli istoni imparziale e completa nei campioni clinici sono di grande valore per caratterizzare i paesaggi epigenetici dei tumori. Qui presentiamo un protocollo per l'estrazione efficiente degli istone da campioni clinici, inclusi i congelati a scatto, i congelati a temperatura ottimale di taglio (OCT) e le biopsie con parafina fissata nel formol (FFPE). Questo approccio produce proteine istoneche di quantità e qualità sufficienti per la successiva analisi bottom-up tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Questo flusso di lavoro consente la rilevazione e la quantificazione robuste delle principali modifiche degli istoni, in particolare acetilazioni e metilazioni della lisina, attraverso i campioni tumorali primari, fornendo uno strato molecolare aggiuntivo per la caratterizzazione del cancro.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel nucleo delle cellule eucariotiche, le istones si assemblano con il DNA per formare i nucleosomi, le unità strutturali fondamentali della cromatina. Ogni nucleosoma è composto da circa 146 bp di DNA avvolto attorno a un ottamero composto da due copie delle istone nucleose H2A e H2B, insieme a due dimeri di istones H3 e H4. Inoltre, è presente anche un istone linker H1 che facilita l'organizzazione di ordine superiore della cromatina legando sia lo stretching del nucleosoma che quello del DNA linker tra inucleosomi 1. Gli histoni sono decorati da una vasta gamma di modifiche post-traduzionali (PTM) presenti principalmente alle loro code N-terminali. Queste modifiche includono la metilazione, vari tipi di acilazione (acetilazione, propionilazione, butirilazione, ecc.), fosforilazione, SUMOilazione, ubiquitilazione, ADP-ribosilazione e crotonilazione, tra cui la metilazione e l'acetilazione della lisina e arginina sono le piùcaratterizzate 2. I tipi, le posizioni e le combinazioni specifiche delle modifiche agli istoni creano ciò che è noto come il codice degli istoni. Questo codice consiste in varie modifiche post-traduzionali (PTM) sulle code N-terminali degli istoni, che vengono aggiunte e rimosse da specifici enzimi modificatori delle istone. Queste modifiche vengono poi riconosciute dalle proteine effettrici, portando a cambiamenti nella struttura della cromatina, come compattazione o decondensazione, influenzando infine diversi processi biologici, tra cui la riparazione dei danni al DNA, la replicazione e in particolare la trascrizionegenica 3,4.

La metilazione del DNA e le PTM degli istoni sono tra le caratteristiche epigenetiche più studiate nelcancro 3. Evidenze sperimentali recenti hanno mostrato alterazioni nei livelli di vari PTM di istones in diversi tipi di tumore. In particolare, la perdita di H4K20me3 e H4K16ac è stata segnalata come segni distintivi del cancro, poiché il loro livello è stato riscontrato diminuito praticamente in tutti i tumori rispetto ai tessutinormali 4. Il nostro gruppo ha identificato la perdita di H3K14ac come possibile segno distintivo del cancro quantificandone la riduzione in diversi tumori rispetto ai normali tramite approcci basati sulla spettrometria di massa(MS) 5. Inoltre, numerosi studi hanno evidenziato il valore prognostico delle PTM degli istoni, mostrando che le alterazioni nei loro livelli globali, valutate principalmente tramite immunoistochimica nelle biopsie dei pazienti, sono correlate con la progressione del cancro, la gradazione istologica e la rispostaterapeutica 6,7,8. Pertanto, l'analisi PTM degli istoni nei campioni di cancro è importante per l'identificazione di nuovi biomarcatori diagnostici e prognostici, nonché potenziali bersagli dei cosiddettiepi-farmaci 8.

Metodi molto comuni per l'analisi delle PTM degli istoni in linee cellulari e campioni clinici si basano su tecniche basate su anticorpi, come immunoblotting, immunoistochimica e saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA)9. Tuttavia, i metodi basati su anticorpi presentano varie limitazioni, tra cui la reattività incrociata o, al contrario, il mascheramentodell'epitopo 10. La reattività incrociata si verifica quando gli anticorpi si legano a bersagli involontari con epitopi simili, portando a potenziali falsi positivi, mentre il mascheramento dell'epitopo si riferisce alla mancata rilevazione di un epitopo specifico (un PTM o variante di istone, in questo caso) a causa della presenza di altre modifiche sui residui vicini. Inoltre, la quantità di tessuto necessaria per l'analisi della modifica degli istoni tramite anticorpi è spesso elevata, poiché solo un numero limitato di PTM può essere rilevato simultaneamente, quindi per analisi multiplexate devono essere processate diverse fettedi tessuto 11. La spettrometria di massa (SM) è emersa come il metodo preferito per profilare le PTM e varianti degli istoni, superando i limiti degli approcci basati suanticorpi 5,8. La MS si basa sulla rilevazione di una differenza di massa (Δm, delta di massa) tra le masse teoriche e quelle misurate sperimentalmente di peptidi e proteine. È imparziale, completa e quantitativa, poiché consente l'identificazione e la quantificazione di PTM e varianti senza richiedere una conoscenza preliminare del loro sito. Questo rende la SM particolarmente preziosa per l'analisi sensibile e accurata delle alterazioni PTM degli istoni nel cancro e in altre condizionipatologiche 8.

Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per l'estrazione degli istoni da campioni clinici, abbinato al profiling basato sulla sclerosi multipla delle PTM degli itoni, successivamente chiamato flusso di lavoro epi-proteomico. Le biopsie dei pazienti sono principalmente conservate come campioni freschi congelati (FF), campioni congelati a temperatura ottimale di taglio (OCT) e campioni di paraffina fissata in formalina (FFPE) 12. Mentre le biopsie fresche vengono congelate rapidamente in azoto liquido o isopentano pre-raffreddato senza l'aggiunta di alcun mezzo diconservazione 13, le biopsie congelate con OCT contengono un mezzo crioprotettivo idrosolubile, composto principalmente da alcol polivinilico e poliglicole polietilenico, che facilita il taglio deitessuti 14. I campioni di FFPE, invece, fissati nella formalina e incorporati nella paraffina, rappresentano il metodo di conservazione più comune per i campioni clinici, poiché possono essere conservati a temperatura ambiente per diversi anni, evitando costose manutenzioni a basse o ultra-bassetemperature 15. Essendo prive di additivi per la conservazione, le biopsie a congelamento rapido possono essere processate direttamente per l'estrazione degli istoni, mentre le biopsie congelate con OCT e FFPE richiedono le fasi iniziali di rimozione del mezzo di immersione/fissativo. I campioni di FFPE richiedono anche un esteso decrosslinking proteico e un recupero di antigeni.

Questo protocollo delinea metodi dettagliati per estrarre gli istoni da campioni clinici freschi congelati, incorporati in OCT e FFPE, garantendo quantità e qualità sufficienti per l'analisi della sclerosi multipla a valle tenendo conto delle sfide specifiche associate a ciascun tipo di conservazione del campione (passo 1). Gli istoni purificati da campioni clinici vengono separati tramite elettroforesi proteica in gel in condizioni di denaturazione (SDS-PAGE), seguita da una fase di derivatizzazione, e digeriti enzimaticamente per generare peptidi di lunghezza adeguata (4-15 amminoacidi) per un'analisi bottom-up in spettrometriadi massa 16 (passo 2). Più specificamente, le istones vengono digerite con una strategia simile all'ArgC, secondo cui la tripsina, che di solito taglia al C-terminale delle lisine (K) e arginine (R) non modificate, viene indotta a tagliare solo al C-terminale delle arginine, a causa di una precedente acilazione chimica di lisine non modificate e monometilate con anidride propionica (PRO). Successivamente, peptidi istonici digeriti simili ad Arg-C vengono acilati alle loro code N-terminali tramite l'aggiunta di fenoiliciano (PIC). Questa ulteriore derivatizzazione aumenta l'idrofobia peptidica e permette una migliore separazione dei brevi peptidi istoneni tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC), migliorando l'identificazione e la quantificazione dei peptidoformi isobarici17,18 (passo 3). Nel complesso, i metodi qui descritti evidenziano il potere della profilazione degli istoni basata sulla SM negli studi sull'epigenetica del cancro.

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Protocollo

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Biopsie fresche di tessuto congelato e OCT-congelato sono state ottenute con consenso informato da pazienti sottoposti a interventi chirurgici presso l'Istituto Europeo di Oncologia (Milano), mentre biopsie FFPE sono state prelevate da pazienti sottoposti a interventi presso l'Istituto Neurologico Carlo Besta (Milano). Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto Europeo di Oncologia (Studio UID 2550) e dall'Istituto Neurologico Carlo Besta (Studio CET 39/24).

1. Estrazione di istone da tessuti derivati dal paziente (Figura 1A)

NOTA: Per analizzare le istone da popolazioni rappresentative di cellule tumorali e ridurre la variabilità tra campioni, è consigliabile utilizzare biopsie cliniche con una cellularità tumorale di almeno il 50% e prive di aree necrotiche e/o di estesa infiltrazione immunitaria.

  1. Arricchimento degli istoni da tessuti freschi congelati (durata stimata: 60 min)
    NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti sul ghiaccio.
    1. Scongelare il tessuto sul ghiaccio e tagliare un pezzo di circa 20-30 mg, solitamente corrispondente a circa 2mm3 di tessuto.
    2. Trasferire il campione in un tubo da 1,5 mL e triturare il tessuto in piccoli pezzi usando forbici (Tabella dei Materiali).
    3. Aggiungere 1 mL di Nuclei Isolation Buffer (Tabella 1) appena integrato con gli inibitori proteasi elencati nella Tabella dei Materiali. Mescola bene dopo.
    4. Trasferire il campione su un omogeneizzatore Dounce (Tabella dei Materiali).
      NOTA: In presenza di grandi pezzi di tessuto, usa una punta p1000 (tagliandola con forbici) per raccogliere meglio il campione.
    5. Omogeneizza il tessuto usando prima il pestello LOOSE e poi il pestello TIGHT (Table of Materials) finché i pezzi di tessuto non diventano invisibili a occhio nudo.
    6. Filtrare il campione omogeneizzato attraverso uno scolatore cellulare da 100 μm (Tabella dei Materiali) per rimuovere i detriti tissutori.
    7. Pipetta vigorosamente su e giù con un p200 per dissolvere la membrana plasmatica e trasferire il campione in un nuovo tubo da 1,5 mL.
    8. Granulare i nuclei cellulari tramite centrifugazione a 2.300 x g per 15 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga da banco (Tabella dei materiali).
    9. Scartare il sovrantantante e risospendere i pellet nucleari in 50-100 μL di Nuclei Isolation Buffer, integrato con SDS allo 0,1% per sciogliere la membrana nucleare (Tabella dei Materiali).
    10. Aggiungi 250 U di nucleasi Benzonasi per digerire gli acidi nucleici, mescola bene e incuba per 2 minuti a 37°C (Tabella dei materiali).
      NOTA: Se il campione è ancora viscoso, la sonicazione può essere eseguita anche in un bagno d'acqua (impostazione: 10 min 30s ON/30s SPENTE; potenza: alta; temperatura: 4 °C). Dopo questo passaggio, i campioni possono essere conservati a -20 °C.
  2. Arricchimento di istones da campioni OCT (durata stimata: 90 min)
    NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per quattro/cinque sezioni OCT spesse 10 μm corrispondenti a 20-60 mg di tessuto. Tuttavia, il numero di sezioni di tessuto dipende dal tipo di biopsia clinica e dall'area totale del tessuto. Considerando la scarsità di campioni clinici, è possibile effettuare un'estrazione da una quantità minore di tessuto iniziale, anche se ciò potrebbe comportare una minore rilevazione delle modifiche degli istoni.
    1. Inserire quattro o cinque sezioni di tessuto spesse 10 μm, corrispondenti a circa 20-60 mg di tessuto, in un tubo da 1,5 mL.
    2. Lava le sezioni con 1 mL di EtOH al 70% gelato (Tabella 1) per 2 minuti su una ruota rotante (Tabella dei Materiali) a 4 °C.
    3. Centrifuga a 16.000 x g per 2 minuti a 4 °C in una centrifuga da banco.
    4. Ripeti i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 per un totale di 3 volte.
    5. Reidratare i campioni in 1 mL di acqua doppiamente distillata (ddH2O) con rotazione (Tabella dei Materiali) per 2 minuti a 4 °C.
    6. Centrifugare a 16.000 x g per 2 minuti a 4 °C in una centrifuga da banco (Tabella dei materiali).
    7. Ripeti i passaggi 1.2.5 e 1.2.6 due volte con 1x PBS (Tabella dei Materiali).
    8. Procedi al passo 1.1.2 del protocollo di arricchimento da campioni freschi congelati.
  3. Estrazione di istonte da campioni FFPE (durata stimata: 8 h)
    NOTA: Il protocollo descritto è stato sviluppato per quattro sezioni FFPE spesse 10 μm corrispondenti a circa 20-60 mg di tessuto. Per la maggior parte delle analisi MS sulle modifiche degli istoni, questa quantità è eccessiva e rappresenta un punto di partenza sicuro quando il materiale non è limitante. Tuttavia, si può anche utilizzare meno materiale di partenza, particolarmente rilevante considerando la quantità spesso ridotta di tessuto disponibile nell'analisi dei campioni clinici. L'uso di meno materiale di partenza, sebbene fattibile, riduce tipicamente la robustezza della quantificazione per modifiche a basso abbondante di istones (ad esempio, H3K27ac, o peptidi H3K27/K36 multimetilati), e questo effetto può variare a seconda del tipo di tessuto, così come da campione a campione. Tuttavia, il nostro laboratorio ha già dimostrato che la profilazione PTM degli istoni basata sulla SM può essere eseguita con successo da aree di tessuto microdissezionate con laser di campioni FFPE di cancro al seno, corrispondenti a solo 1.000 cellule18.
    1. Inserire quattro sezioni FFPE spesse 10 μm, corrispondenti a circa 20-60 mg di tessuto, in un tubo da 1,5 mL.
    2. Aggiungere 1 mL di agente dissolvente della paraffina al campione e al vortice (Tabella dei Materiali) alla velocità massima per 30 secondi, finché la paraffina non si dissolve completamente.
      ATTENZIONE: I reagenti dissolventi della paraffina sono mutagenici, cancerogeni e infiammabili, quindi devono essere usati sotto un cappuccio chimico.
      NOTA: La dissoluzione della paraffina si ottiene quando i pezzi di paraffina non sono più visibili a occhio nudo e l'agente dissolvente della paraffina ha un colore biancastra e omogeneo.
    3. Centrifugare 16.000 x g per 3 minuti a RT in una centrifuga da banco e scartare il soprantantante. Per evitare aspirazione indesiderata del campione durante la rimozione del soprandante, la pompa a vuoto/pipette può essere tappata con una punta più piccola (ad esempio, punte p200, p10).
    4. Ripeti i passaggi 1.3.2 e 1.3.3 altre tre volte (4 volte in totale) per garantire la completa rimozione della paraffina. In alternativa, si pesa il campione completamente deparaffinizzato per avere una lettura indicativa della quantità di tessuto lavorata.
    5. Aggiungere 1 mL di soluzione EtOH al 95% (Tabella 1) e un vortice alla massima velocità per 30 secondi, per garantire una risospensione completa dei tessuti.
    6. Centrifugare 16.000 x g per 3 minuti a RT in una centrifuga da banco e scartare il soprantantante. In alternativa, pesa il campione disidratato per avere una misura indicativa della quantità di tessuto secco lavorato.
    7. Ripeti i passaggi 1.3.5 e 1.3.6 con 70%, 50% e 20% di EtOH (Tabella 1) e ddH2O per reidratare il campione.
    8. Aggiungere 200 μL di buffer di estrazione (Tabella 1).
      NOTA: Se sono presenti pezzi di tessuto più grandi, tagliali in pezzi più piccoli con delle forbici. A seconda della quantità di tessuto, si possono aggiungere volumi più piccoli o maggiori di buffer di estrazione per garantire una corretta lisi del campione. Per pellet particolarmente piccoli risospesi in un volume di buffer di estrazione inferiore a 100 μL, la sonicazione può essere eseguita utilizzando un dispositivo di sonicazione (Tabella dei Materiali) (30 s ON/30 s OFF potenza: alta, 10 cicli).
    9. Omogeneizzare il tessuto in buffer di estrazione tramite sonicazione utilizzando un sonificatore digitale (Tabella dei Materiali) con una micropunta da 3 mm (>15 cicli, 5s ON/2 min SPENNE, potenza: 15-30%).
      NOTA: I campioni possono essere considerati correttamente omogeneizzati quando non sono visibili particelle tissutali visibili nella soluzione e il tampone di estrazione mostra un colore uniforme e non torbido. Tieni i campioni a RT durante i cicli di sonicazione. Il ghiaccio può causare precipitazione di SDS nel buffer di estrazione, compromettendo così l'omogeneizzazione dei tessuti. Una corretta sonicazione è fondamentale per ottenere la lisi tissutale completa e l'estrazione proteica. Posizionare il microtip all'altezza corretta nel tubo del campione (non deve toccare il fondo del tubo, rilasciando particelle di plastica, e non deve trovarsi all'interfaccia del buffer di estrazione aria, creando schiuma e bolle).
    10. Dopo l'omogeneizzazione, incubare i campioni a 95 °C per 45 minuti in un termomiscelatore. Ogni 15 minuti, apri il coperchio dei tubi per permettere all'evaporazione del formaldeide.
    11. Incubare i campioni a 65 °C per 4 ore in un termomiscelatore. Apri il coperchio ogni 20-60 minuti per permettere al formaldeide di evaporare.
    12. Centrifugare 16.000 x g per 1 minuto a RT in una centrifuga da banco e trasferire il sovrantantante in un nuovo tubo.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C a questo punto.

Tabella 1: Composizione del buffer. Clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Risoluzione degli istoni tramite digestione SDS-PAGE e in gel

  1. SDS-PAGE (Figura 1B; durata stimata: 2 h)
    1. Per valutare la purezza degli istoni e stimarne la quantità, si carica 1/10 degli estratti di istoni su un gel di poliacrilamide al 17% (SDS-PAGE; Tabella 1) insieme a quantità note di istoni ricombinanti, come illustrato nella Figura 1B.
      NOTA: Invece di caricare 1/10 di estratti di istoni, si possono caricare 15-50 μg di proteine, misurate da saggi che tollerano alte concentrazioni di detergenti, come il saggio proteico19 dell'acido bicinconinico (BCA). Tuttavia, si noti che l'arricchimento degli istoni sulle proteine totali può variare significativamente tra campioni freschi congelati, OCT congelati e FFPE, e la quantificazione della quantità di istoni può essere basata solo su SDS-PAGE. 1, 0,5 e 0,25 μg di istone ricombinante H3.1 (Table of Materials) possono essere caricati come riferimento per quantificare la quantità di istoni in modo più preciso.
    2. Mescolare i campioni con buffer di carico di litio dodecil solfato (LDS), oppure con buffer di carico equivalenti per SDS-PAGE (ad esempio, buffer di Laemmi) con l'aggiunta di ditiotreitolo (DTT; Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 10 mM.
    3. Denature campioni a 95°C per 5 minuti in un termomiscelatore.
    4. Dopo la separazione delle proteine sulla SDS-PAGE, colorare il gel con la colorazione Coomassie (Tabella dei materiali).
    5. Stimare il rendimento degli istoni tramite quantificazione visiva o assistita dalsoftware per 20 bande di istoniche nei campioni clinici rispetto all'istone ricombinante H3 caricato in quantità note.
  2. Digestione in gel degli istoni (Figura 2; durata stimata: 2 giorni)
    NOTA: La digestione simile all'ArgC viene impiegata per l'analisi in sclerosi multipla dei PTM degli istoni perché la digestione standard della tripsina genera peptidi eccessivamente corti, a causa dell'alta frequenza di amminoacidi di lisina e arginina nella loro sequenza, il che ostacola la rilevazione dei peptidi LC-MS e l'identificazione del PTM. Modificando chimicamente le lisina, la clivatura triptica in questi siti viene prevenuta, causando la clivatura solo al C-terminale delle arginine, che produce peptidi più lunghi (4-15 amminoacidi) che contengono lisine modificate all'interno della sequenza; nel complesso, questo protocollo facilita la rilevazione e la misurazione della SM di peptidi istonici modificati ed è stato descritto in modo approfondito in numerose pubblicazioni8,17,21.
    OPZIONALE: Uno standard interno (ad esempio, peptidi spik-in marcati con pesante etichettatura sintetica22) può essere miscelato con campioni di istoniche in un rapporto 1:1 per ottenere una quantificazione peptidica più precisa in MS (Figura 2B).
    1. Carica 3-5 μg di campione di istoni su un gel di poliacrilammide al 17%, basandosi sulla quantificazione stimata degli istoni effettuata nello Passo 2.1.5 (Figura 2B).
    2. Dopo SDS-PAGE, visualizza le proteine colorando il gel con la colorazione Coomassie.
      NOTA: Per prevenire contaminazioni che potrebbero interferire con l'analisi LC-MS/MS, è consigliabile eseguire i seguenti passaggi in un ambiente privo di cheratina, come un cappuccio dedicato, poiché la cheratina è un forte contaminante da SM.
    3. Bande di gel di accisa corrispondenti al peso molecolare delle proteine degli istoni centrali (banda gel tra 10 e 18 kDa, considerando il seguente peso molecolare per ciascuna istona centrale: H3 circa 17 kDa, H2A-H2B circa 14 kDa, H4 circa 11 kDa) usando un bisturi (Tabella dei Materiali) e bande tagliate in pezzi di circa 1mm 3 ciascuna.
    4. Con l'aiuto del bisturi, trasferisci i pezzi di gel su un tubo da 1,5 mL.
      NOTA: Per coprire completamente i pezzi di gel, i volumi indicati di seguito possono essere aumentati, mantenendo la stechiometria del reagente.
    5. Rimuovere i pezzi di gel aggiungendo una soluzione di acetonitrile al 50% (ACN) inddH 2O(Tabella 1). Metti in un termomiscelatore impostato a 1.400 giri/min per 10 minuti di RT e poi scarta il soprantantante.
    6. Ripeti il Passo 2.2.5 finché i pezzi di gel non sono completamente scoloriti.
    7. Disidrata i pezzi di gel aggiungendo 100% ACN (Tabella dei Materiali). Incuba con miscelazione a 1.400 giri/min per 10 minuti di RT e poi scarta il soprantantante.
    8. Ripeti il passo 2.2.7 finché i pezzi di gel non appaiono bianchi e duri, quindi completamente disidratati.
    9. Asciuga i pezzi di gel per 5 minuti a RT in una centrifuga a vuoto (Tabella dei materiali).
      NOTA: Gli istoni sono poveri nelle cisteine (solo due cisteine si trovano nell'istone H3 alle posizioni 96 e 110 (UniprotKB ID P68431), e solo una cisteïna è presente nell'istone H2B alla posizione 154 (UniprotKB ID B4DR52)). Inoltre, queste cisteine sono presenti all'interno di peptidi non rilevabili durante la digestione simile all'ArgC nella SM bottom-up, quindi gli addotti chimici dei gruppi tioli23 non sono un artefatto nell'analisi MS delle istoni, e non vengono eseguiti passaggi di riduzione o alchilazione della cisteina nel protocollo descritto.
    10. Aggiungere 15 μL di 7,7 M di soluzione di anidrido propionico (PRO) (Tabella dei Materiali) e 26 μL di bicarbonato di ammonio (AmBic) da 1 M (Tabella dei Materiali) a ciascun tubo e incubare i campioni in un termomiscelatore impostato a 350 giri/min per 10 minuti a 37 °C.
      NOTA: Poiché gli anidridi disciolti in un buffer reattivo tendono a evaporare, non preparare un mix master di PRO e AmBic, ma aggiungerli singolarmente a ogni campione, per mantenere costante la giusta concentrazione di PRO in ogni provetta.
    11. Copri completamente i pezzi di gel aggiungendo 1 M AmBic (volume raccomandato: 80 μL) e incuba i campioni miscelando a 1.400 giri/min per 4 ore a 37°C in un termomiscelatore. Rimuovi tutto il liquido dopo.
      NOTA: 1 M di AmBic viene aggiunto per mantenere un pH di base, ideale per catalizzare la propionilazione di lisine non modificate e monometilate tramite PRO.
    12. Lava tre volte con ddH2O, incubando i campioni tra una temperatura e l'altra a RT per 10 minuti mentre si mescola in un termomiscelatore a 1.400 giri/min. Scarta il liquido dopo ogni lavaggio.
    13. Aggiungi il 50% di ACN e incuba in un termomiscelatore a 1.400 giri/min per 15 minuti a RT. Poi butta il liquido dopo.
    14. Disidrata completamente i pezzi di gel aggiungendo ACN al 100% e incuba a 1.400 giri/min per 15 minuti a RT in un termomiscelatore. Scarta il liquido dopo.
    15. Ripeti il Passo 2.2.14 finché i pezzi di gel non appaiono bianchi e secchi.
    16. Pezzi di gel secco 5 minuti a RT in una centrifuga a vuoto.
    17. Aggiungi a ciascun campione 4 μL di soluzione di tripsina (Tabella 1) e 20 μL di tampone di digestione (Tabella 1) e incuba 10 minuti sul ghiaccio per permettere l'assorbimento della tripsina nei pezzi di gel.
      NOTA: Questa incubazione - effettuata con soluzione concentrata di tripsina e tampone digestionale (50 mM AmBic in ddH2O, creando un pH ideale per la clivatura della tripsina) - permette all'enzima di essere assorbito dai pezzi di gel prima della sua attivazione a 37 °C.
    18. Quando la tripsina concentrata è completamente assorbita, si coprono accuratamente i pezzi di gel con un ulteriore tampone di digestione (volume indicativo: 80 μL) e si incuba a 37 °C durante la notte in un termomiscelatore.
    19. Per estrarre peptidi digeriti dai pezzi di gel, aggiungere 100 μL di ACN al 100% e incubare a 1.400 giri/min per 20 minuti in RT in un termomiscelatore.
    20. Raccogli il soprandanante e trasferiscilo in un nuovo tubo da 1,5 mL.
    21. Aggiungi 80 μL di ACN al 100% ai pezzi di gel e incuba a 1.400 giri/min per 10 minuti di RT in un termomiscelatore.
    22. Raccogli il soprantantante e lo metti in pool con quello raccolto nello Passo 2.2.20, poi concentra i peptidi in una centrifuga a vuoto a un volume compreso tra 1 e 5 μL.
      NOTA: L'uso di una centrifuga a vuoto permette l'evaporazione del solvente organico (ACN). Tuttavia, si raccomanda di non asciugare completamente il campione in questa fase, poiché ciò potrebbe influire negativamente sulla successiva fase di derivatizzazione. Se il campione si secca, risospendilo in acqua ddH2Oe sonicalo in un bagno d'acqua per 5 minuti.
    23. Aggiungere ddH2O a ciascun campione, a un volume finale di 15 μL, poi aggiungere 2 μL di bicarbonato trietilammonio da 1 M (Tabella dei materiali) e 3 μL di soluzione di isocianato fenilico (PIC) (Tabella 1) e incubare a 350 giri/min per 90 minuti a 37 °C in un termomiscelatore.
      ATTENZIONE: Il PIC è mutageneo e cancerogeno, quindi si consiglia di gestirlo sotto un cappuccio chimico. Poiché il PIC è altamente reattivo e volatile, si consiglia di evitare di preparare una miscela principale di bicarbonato di trietilammonio e PIC, ma è consigliabile aggiungere ogni reagente individualmente per garantire la presenza esatta della concentrazione di PIC.
    24. Aggiungere a ogni tubo 8 μL di acido trifluoroacetico all'1% (TFA; Tabella dei materiali) per fermare la derivatizzazione con PIC.
    25. Diluire ogni campione con 100 μL di Buffer A (Tabella 1) e caricarli sulle punte dello stadio C18 (preparate come descritto nel24 o acquistate da diversi fornitori).
    26. Centrifugare i campioni a 2.100 x g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga a rotore oscillante per permettere ai peptidi degli istoni di legarsi alla resina C18.
      NOTA: I campioni possono essere conservati sulle punte del palco a 4 °C per diversi mesi.
    27. Aggiungi 30 μL di tampone di eluzione (Tabella 1) ai C18 Stage Tips e inserisci i puntini in un nuovo tubo da 1,5 mL. Campioni di centrifuga a 1.000 x g per 10 minuti in una centrifuga da banco a 4 °C per eluire peptidi di istone.
    28. Concentrare i campioni in un volume compreso tra 1 e 3 μL utilizzando una centrifuga a vuoto, poi aggiungere l'1% di TFA per raggiungere un volume finale di 6 μL.
    29. Carica 5 μL di soluzione peptidica in una micropiastra da 96 pozzi per l'analisi MS (Tabella dei Materiali) e sigillala con un tappetino sigillante (Tabella dei Materiali).

3. HPLC-MS/MS e analisi dei dati (Figura 3)

NOTA: I parametri qui descritti sono adatti a un sistema di cromatografia liquida ESAY-nLC 1200 collegato tramite una colonna EASY Spray a uno spettrometro di massa Q Exactive Plus Orbitrap (Tabella dei Materiali), ma possono essere utilizzati anche strumenti simili/equivalenti, con parametri ad hoc.

  1. HPLC-MS/MS (durata stimata: 90 min per campione)
    1. Iniettare 3 μL dai peptidi di istoni da 5 μL del passo 2.2.29 (corrispondenti a circa 0,25-0,8 μg, basandosi sulla quantificazione degli istoni tramite SDS-PAGE) su una nanocolonna C18 (Tabella dei Materiali) a un flusso costante di 500 nl/min nel Buffer A.
    2. Applicare un gradiente lineare di 55 minuti del 10%-45% di Buffer B a una portata di 250 nL/min per separare i peptidi.
    3. Acquisire i dati MS/MS in modalità data-dependent (DDA) per passare automaticamente da MS1 a MS2 utilizzando i pacchetti software dedicati (Table of Materials).
      NOTA: Per l'acquisizione e le impostazioni generali, si rifera alla Tabella 2.
  2. Analisi dei dati RAW MS
    NOTA: In questo protocollo, la quantificazione delle PTM degli istoni viene effettuata utilizzando EpiProfile, uno script aperto (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), facile da usare e adatto ad analisi standard come quelle descritte per le metilazioni e acetilazioni della lisina H3 e H4. Tuttavia, EpiProfile può essere personalizzato per eseguire analisi di modifiche meno standard e su diversi protocolli di preparazione del campione da parte di utenti più esperti. Si prega di notare che EpiProfile richiede una licenza MATLAB per esseregestito a 25 anni.
    1. Analizza i dati RAW acquisiti con il software EpiProfile 2.0 (versione PRO-PIC)25 (Tabella dei Materiali) e quantifica i peptidi degli istoni selezionando le opzioni histone_normal, quando l'analisi viene eseguita senza marcatori, e histone_SILAC, quando si utilizza lo spike-in SUPER-SILAC. Impostare ndebug = 0.
    2. Per ogni peptide istonico (ad esempio, H3_3-8), calcola l'abbondanza relativa (%RA) di ogni peptidoforma modificato (ad esempio, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) dividendo il cromatogramma ionico estratto (XIC) calcolato da EpiProfile per la somma di tutti gli XIC calcolati per quel peptide.
      NOTA: Opzionalmente, gli XIC calcolati da EpiProfile possono essere validati tramite ispezione degli spettri MS e quantificazione manuale dei peptidi degli istoni utilizzando una disposizione dedicata degli spettri come descritto in18,26.
    3. Per ogni peptidoforma, calcolare il rapporto leggero-pesante (L/H) dividendo il %RA di ciascun peptide nativo leggero per il %RA del corrispondente peptide pesante derivato dalla miscela SUPER-SILAC, inserito in ciascun campione.
    4. Trasformare i rapporti L/H in una scala logaritmica. Per evidenziare differenze significative nell'abbondanza dei peptidoformi tra i campioni, è possibile effettuare un'analisi statistica e i rapporti L/H su tutti i campioni possono essere rappresentati visivamente tramite mappe di calore e diagrammi a scatter, come nella Figura 4.

Tabella 2: Elenco delle impostazioni di acquisizione e dell'impostazione generale impiegate per LC-MS/MS con il sistema utilizzato in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Risultati

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Abbiamo effettuato estrazione di istoni da campioni freschi congelati e OCT congelati per tumori al seno e da campioni di meningioma FFPE seguendo il protocollo sopra menzionato. Come illustrato nella Figura 1A, per i campioni congelati, abbiamo rimosso l'OCT quando presente, e omogeneizzato i campioni in un tampone di isolamento Nuclei contenente un detersivo delicato (0,1% Triton step 1.1), permettendo l'isolamento dei nuclei. Successivamente, abbiamo estr...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo descritto qui fornisce un flusso di lavoro semplice e robusto per isolare in modo efficiente gli istoni da campioni clinici conservati come biopsie fresche congelate, congelate con OCT e FFPE per la profilazione dei loro paesaggi di modifica tramite analisi MS. Il successivo protocollo di preparazione del campione tramite separazione SDS-PAGE e digestione in gel PRO-PIC con tripsina garantisce una rimozione efficace di detergenti, sali e altri contaminanti MS3...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo chirurghi e clinici dell'European Institute of Oncology e dell'Istituto Neurologico Carlo Besta per aver fornito biopsie di tessuto congelato FF, OCT e FFPE. Ringraziamo Roberta Noberini per la discussione scientifica e metodologica durante la preparazione del manoscritto e per i nostri finanziamenti: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (grant numero IG-2023-28767) e Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sostanze chimiche
Histolemon RS per l'istologiaCarlo Erba4549122,5 L
Acetonitrile (ACN)Carlo Erba4123411L
Bicarbonato di ammonio (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Persolfato di ammonio (APS)WDR1.012.010.500500 g
Inibitore della proteasi dell'aprotininaSigma Aldrich & nbsp;A11535 mg
Nucleasi benzonasiMerkE101425 KU
Bisacrilammide 30% 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
Tampone A 0,1% di acido formico in ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Buffer B 0,1% acido formico /80% acetonitrile in ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
Resina C18Merck66883-UDiametro di 47 mm
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Dithiotreitol (DTT) WDR441496P25 g
EtanoloCarlo Erba4146082,5 L
Leucepitina  Inibitore della proteasiSigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N′,N′-Tetrametil etilendiamina (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
Buffer campione LDS NuPAGEInvitrogenNP00074x
PBS - soluzione salina tamponata con fosfato & nbsp;MicroGemTL1006500 mL
Fenoilianato (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Inibitore della proteasi del fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)Sigma Aldrich & nbsp;P76261 g
Anidride propionica (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Umano di Istona Ricombinante H3.1New England BiolabsM25031 & micro; G/& Micro; L
Tripsina di grado sequenziantePromegaV5113100 ug
Inibitore della deacetliasi di sodio butirato (NaBut)MerckB58875 g
Dodecilsolfato di sodio (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
Bicarbonato di trietilammonioSigma AldrichT7408100 mL
Acido trifluoroacetico (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Detersivo Triton X-100Sigma-Aldrich X100RS5 g
Kit/ Attrezzatura/Software
Micropiastra a 96 pozziCorningPCR-96-FS-CNon pirogenico, privo di Rnase/Dnase
BilanciaKern19024
Centrifuga da bancoLaboratorio Biofuge HareusPico, 23396
Dispositivo di Sonicazione a BiorupttoreDiagenode
Sonificatore Digitale Branson 250Emerson
Filtro cellulare 100 & micro; mFalcone352360
Concentrator plusEppendorf5305000509
Omogeneizzatore Dounce (es. & nbsp; Dounce, Wheaton...)Dounce, Wheaton1 mL Smagliatore di tessuti
Cromatografia liquida EASY-nLC 1200Thermo Fisher Scientific
Colonna HPLC C18 a spruzzo facileThermo Fisher ScientificES9022 & micro; m, 100  Å, 75 µ m x 25 cm
Script EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Software delle Figihttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
Motore di ricerca MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
Pestello A (sciolto)Dounce, Wheaton
Pestel B (stretto)Dounce, Wheaton
Sistema Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MSThermo Fisher Scientific
Ruota rotanteThermo Fisher Scientific11496548
BisturiKiato13010
ForbiciThermo Fisher Scientific15207266
Tappeto di sigillaturaCorningAM-96-PCR-RDCompatibile con l'automazione
Centrifuga a rotore oscillanteBeckman coulterAllegra X-15R
Termomixer compattoEppendorf5350
VorticePBIVibromix
Software XcaliburThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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