Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Sommario

Questo protocollo descrive come impostare ed eseguire in modo efficiente analisi automatizzate dei dati di imaging di cellule vive ottenuti dal monitoraggio del trasporto nucleocitoplasmatico tramite strumenti optogenetici.

Abstract

Il trasporto nucleocitoplasmatico (NCT) è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi cellulare e la sua interruzione è coinvolta in varie malattie, tra cui i disturbi neurodegenerativi e la sclerosi laterale amiotrofica. Ciò sottolinea la necessità di sviluppare strumenti per monitorare e quantificare l'NCT. Tra questi strumenti, le sonde optogenetiche veloci e reversibili, LEXY (light-inducible nuclear export system) e LINuS (light-inducible nuclear localization signal), consentono la misura della dinamica NCT in cellule vive.

Le pubblicazioni originali descrivono la segmentazione manuale e la quantificazione del segnale della sonda fluorescente nel nucleo e nel citosol dopo la trasfezione dei costrutti LEXY e LINuS nell'imaging di cellule vive. Tuttavia, sia la trasfezione che la segmentazione manuale limitano il numero di cellule che possono essere analizzate e sono soggette a imprecisioni a causa di potenziali errori dipendenti dall'utente. Mentre l'alta velocità e reversibilità fornite dall'optogenetica dovrebbero, in linea di principio, consentire un'elevata sensibilità nel rilevare i cambiamenti nella dinamica NCT, dipende dai parametri di acquisizione e dall'analisi di un numero sufficiente di cellule.

Abbiamo quindi stabilito vettori lentivirali che esprimono LEXY e LINuS per creare linee cellulari stabili, testato marcatori di imaging dal vivo e condizioni di controllo e implementato una pipeline di analisi delle immagini semi-automatizzata che consente l'analisi di centinaia di cellule. Questo metodo di analisi utilizza il software ad accesso aperto FIJI, è accessibile ai principianti in bioinformatica e non richiede configurazioni informatiche avanzate. Qui forniamo un protocollo passo-passo per impostare LEXY come esempio di questi strumenti optogenetici per monitorare l'esportazione nucleare, dalla preparazione dei campioni all'acquisizione dell'imaging di cellule vive e all'analisi automatizzata, dimostrando al contempo come adattare il protocollo per altre condizioni, controlli o modelli in qualsiasi laboratorio. Tutti i plasmidi e le linee cellulari utilizzate in questo protocollo saranno messi a disposizione della comunità scientifica, aumentando così ulteriormente l'accessibilità del metodo.

Introduzione

L'importanza del trasporto nucleocitoplasmatico (NCT) per regolare le principali vie cellulari e mantenere l'omeostasi cellulare è stata ben studiata negli ultimi anni¹. Di conseguenza, sono stati generati diversi strumenti per studiare la dinamica dell'NCT ^2,3,4. Tra questi strumenti, le sonde optogenetiche LINuS⁵ e LEXY⁶, pubblicate rispettivamente nel 2014 e nel 2016, forniscono un modo potente per monitorare l'NCT nelle cellule vive. Questi strumenti, progettati per seguire l'esportazione inducibile (LEXY) o l'importazione (LINuS) di un reporter fluorescente, sono inducibili dall'esposizione alla luce blu e reversibili.

In breve, queste due piccole sonde utilizzano le proprietà del dominio LOV2 della proteina fototropina-1 della pianta Avena sativa⁷. In assenza di luce blu, l'elica Jα del dominio LOV2 viene fotoingabbiata e incorporata nel nucleo proteico. Poiché l'elica Jα può rispondere agli stimoli luminosi, l'illuminazione da parte della luce blu induce un cambiamento conformazionale e il successivo sganciamento dell'elica Jα dal dominio LOV2. Gli autori di LEXY e LINuS hanno utilizzato questa sensibilità alla luce per fondere un segnale di localizzazione nucleare (NLS) o un segnale di esportazione nucleare (NES) all'elica Jα, rispettivamente per LINuS e LEXY (Figura 1). Lo strumento risultante è una sonda che trasloca nel nucleo (LINuS) o nel citosol (LEXY) dopo l'illuminazione a luce blu.

Per tracciare le sonde con l'imaging fluorescente, è stato aggiunto anche un reporter fluorescente mCherry ai costrutti. Infine, un debole NES (per LINuS) o NLS (per LEXY) è stato aggiunto al sistema per garantire che le sonde non fossero nella loro localizzazione finale prima dell'illuminazione della luce blu, il che avrebbe impedito l'osservazione della traslocazione di LEXY o LINuS tra il nucleo e il citosol.

Figura 1: Rappresentazione delle sonde LEXY e LINuS. Entrambe le sonde sono costituite da una proteina mCherry fusa al dominio LOV2 sensibile alla luce. La differenza tra i due strumenti risiede nella sequenza di segnalazione nascosta dall'elica Jα: un NES per LEXY e un NLS per LINuS. Entrambe le sonde possiedono anche una sequenza di segnale debole per controllare la loro localizzazione iniziale: un NLS debole per LEXY e un NES debole per LINuS. L'attivazione dei sistemi mediante illuminazione a luce blu induce quindi la loro esportazione per LEXY o la loro importazione per LINuS, consentendo agli utenti di monitorare l'esportazione o l'importazione nucleare. Abbreviazioni: LEXY = sistema di esportazione nucleare inducibile dalla luce; LINuS = segnale di localizzazione nucleare inducibile dalla luce; NLS = segnale di localizzazione nucleare; NES = segnale di esportazione nucleare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La localizzazione della fluorescenza mCherry riporta la navetta delle sonde LEXY e LINuS tra nuclei e citosol, e può quindi essere seguita nell'imaging di cellule vive, consentendo agli utenti di monitorare l'NCT. Oltre ad essere utilizzati come semplici sonde, LEXY e LINuS possono anche essere ingegnerizzati per controllare la localizzazione e studiare le proteine di interesse, in vitro 5,6,8,9 o in vivo ^10,11.

Il metodo di quantificazione proposto nelle pubblicazioni LEXY e LINuS mostra l'intensità nucleare relativa delle sonde. L'analisi suggerita viene eseguita manualmente e si basa sulla misurazione di una regione di interesse (ROI) nel nucleo e nel citosol. Sebbene questo metodo fornisca una buona rappresentazione del segnale della sonda nel tempo, è molto lungo e noioso, soprattutto quando gli esperimenti e le condizioni vengono ripetuti. È importante sottolineare che questo metodo manca anche di precisione poiché è rappresentata solo una piccola parte del compartimento progettato.

Qui proponiamo un nuovo protocollo per la quantificazione dei segnali fluorescenti LEXY e LINuS. Abbiamo implementato tecniche automatizzate, che facilitano le analisi e garantiscono una maggiore precisione. Ciò faciliterà il processo per i nuovi utenti di questi strumenti e contribuirà ad aumentare la produttività. Il nostro protocollo di quantificazione utilizza una sola interfaccia, il plug-in open-source TrackMate¹² di FIJI. In particolare, per migliorare l'affidabilità delle quantificazioni, abbiamo utilizzato un marcatore di DNA rosso lontano compatibile con l'imaging dal vivo per eseguire la segmentazione dell'intero nucleo con StarDist¹³, una rete neurale convoluzionale addestrata, combinata con il tracciamento e la misurazione del segnale fluorescente della sonda con TrackMate¹².

I dati ottenuti possono quindi essere facilmente esportati nel foglio di calcolo fornito e pronto all'uso (Tabella supplementare S1) per ottenere l'intensità nucleare relativa di ciascun nucleo identificato. Questo protocollo spiega anche come raggruppare i valori ottenuti in un grafico adattando la curva dell'andamento temporale ottenuta a un modello monoesponenziale, come in Yoo e Mitchison¹⁴ e come calcolare la velocità di trasporto per le diverse condizioni testate. Con questo protocollo e il foglio di calcolo fornito per l'analisi, gli utenti saranno in grado di quantificare facilmente i dati di imaging di cellule vive, anche con competenze bioinformatiche limitate.

Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo è descritto per il monitoraggio dell'esportazione nucleare con la sonda di LEXY. I dettagli relativi alle impostazioni da regolare per LINuS sono presentati nella sezione 5.

1. Coltura cellulare

NOTA: La procedura descritta in questa sezione deve essere eseguita in una cappa per coltura tissutale. Le fasi descritte di seguito sono state ottimizzate per la linea cellulare di fibroblasti¹⁵ di topo NIH/3T3, utilizzando DMEM (o DMEM privo di rosso fenolo quando indicato), integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina come terreno (vedere la Tabella dei materiali). Tuttavia, gli utenti possono adattare la procedura ad altri tipi di cellule. Il protocollo è adatto per cellule trasfettate o linee cellulari stabili. Tuttavia, si consiglia di creare linee cellulari stabili, come menzionato nella sezione di discussione.

1. Preparare la soluzione di rivestimento con 23 μg/mL di collagene e 2 μg/mL di fibronectina in 1x PBS sterile. Aggiungere 800 μl della soluzione di rivestimento a ciascuna capsula per immagini dal vivo (vedere la Tabella dei materiali) e conservare nell'incubatore per 90 minuti.
2. Lavare la miscela di rivestimento con 1x PBS sterile e seminare 60.000 cellule sulle piastre di imaging dal vivo in terreni, per un'acquisizione il giorno successivo.
3. Se necessario, trasfettare le cellule con il plasmide LEXY secondo il metodo di trasfezione che meglio si adatta al tipo di cellula utilizzata. Per seguire questo protocollo, eseguire una co-trasfezione della sonda con un vettore vuoto per aumentare l'efficienza, in un rapporto di 1:5 per LEXY:vettore vuoto. Proteggi le cellule dalla luce in una scatola scura o con un foglio di alluminio e lasciale crescere per un giorno.
4. Prima dell'acquisizione, colorare le cellule con un marcatore di DNA rosso lontano compatibile con l'imaging di cellule vive, in un terreno privo di rosso fenolo, e assicurarsi che siano completamente protette dalla luce fino all'acquisizione.
   NOTA: Nel nostro caso, utilizziamo SiR-DNA¹⁶ a 1 μM, incubato per almeno 1 ora prima delle acquisizioni.
5. Per controllare l'esportazione, utilizzare l'inibitore nucleare dell'esportazione Leptomicina B¹⁷ a 0,5 nM (lieve inibizione dell'esportazione) e 1 nM (forte inibizione dell'esportazione), applicato alle cellule 1 ora prima dell'acquisizione.

2. Imaging

NOTA: Le acquisizioni possono essere effettuate con un microscopio confocale compatibile con l'imaging dal vivo, che ha la capacità di creare un modello di acquisizioni scelte e un'illuminazione laser pulsatile a 458 nm. Il nostro imaging è stato eseguito al buio in una camera a 37 °C (con 5% di CO₂) di un microscopio confocale con scansione risonante. La configurazione è ottimizzata con l'obiettivo 20x, consentendo quindi l'imaging simultaneo di più cellule nello stesso campo visivo. La sequenza di imaging è composta da tre fasi, come nella Figura 2.

1. Fase stabile
   1. Eseguire un'acquisizione di segnali mCherry (LEXY, laser a 561 nm) e rosso lontano (SiR-DNA, laser a 633 nm) ogni 15 s e ripeterla 10 volte, per una durata totale di 150 s. Assicurarsi che a questo punto non si osservino né sbiancamento né traslocazione di LEXY nel citosol.
      ATTENZIONE: Un'illuminazione del sistema con luce blu in questa fase attiverebbe LEXY, che indurrebbe immediatamente la sua esportazione nel citosol.
2. Fase di illuminazione
   NOTA: Questa fase è composta da tre passaggi, ripetuti 15 volte.
   1. Effettuare l'illuminazione pulsatile con luce blu (laser a 458 nm), con impulsi di 36 ms ripetuti 150x, per una durata totale di ~5 s.
   2. Esegui un'acquisizione di segnali fluorescenti mCherry (LEXY, laser a 561 nm) e rosso lontano (SiR-DNA, laser a 633 nm).
   3. Pausa di 15 s.
3. Fase di recupero
   1. Esegui un'acquisizione di segnali mCherry (LEXY, laser a 561 nm) e rosso lontano (SiR-DNA, laser a 633 nm) ogni 15 s, ripeti 25x, per una durata totale di 375 s.
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo e può essere rimosso se gli utenti desiderano osservare solo l'esportazione della sonda e non il recupero.

Figura 2: Configurazione delle tre fasi di LEXY. Per monitorare l'esportazione nucleare con LEXY, è necessario impostare tre fasi sul software del microscopio. La parte superiore indica la configurazione da utilizzare per le acquisizioni di imaging di cellule vive di LEXY. Questa configurazione consiste in una fase stabile, per garantire che il segnale sia stabile nel nucleo, una fase di illuminazione, per indurre la traslocazione di LEXY dal nucleo al citosol, e una fase di recupero, per osservare LEXY che ritorna al nucleo. La parte inferiore della figura indica i risultati attesi con l'imaging di cellule vive. In rosso, il mCherry indica la localizzazione di LEXY. In grigio, il SiR-DNA colora il nucleo delle cellule. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Analisi per LEXY

NOTA: L'intera segmentazione e l'analisi del tracciamento vengono effettuate utilizzando FIJI, con TrackMate¹², un plug-in Fiji open source (versione richiesta dettagliata nella Tabella dei materiali).

1. Installa FIJI e scarica i plug-in StarDist¹³ e TrackMate. Per installare i plugin, vai su Aiuto | Aggiornamento ... | Gestisci i siti di aggiornamento e seleziona CSBDeep, StarDist e Trackmate-StarDist, quindi fai clic su Applica modifiche. Riavvia le Figi.
2. Mentre alcuni microscopi possono eseguire ogni fase di acquisizione (Stable-Illumination-Recovery) insieme, altri (ad esempio, il microscopio confocale di riferimento) le salvano separatamente. Pertanto, un ulteriore passaggio, se si utilizza questa configurazione, è quello di concatenare le fasi tra loro: aprire le immagini delle tre sequenze, eseguire la funzione di concatenazione per compilare le tre fasi time-lapse in un unico file: cliccare su Immagine | Pile | Strumenti | Concatenare....
3. Selezionare la fase stabile come Immagine1, la fase di illuminazione come Immagine2 e la fase di recupero come Immagine3. L'immagine risultante è un'immagine singola per il time-lapse delle tre fasi, con i canali mCherry (canale 1) e SiR-DNA (canale 2) fusi.
4. Conserva l'immagine ottenuta per il successivo passaggio di segmentazione e salvala: vai su File | Salva con nome | Tiff....
5. Dividi il solo canale mCherry per le seguenti analisi: vai su Immagine | Colore | Dividi i canali e salvalo: vai su File | Salva con nome | Tiff....
6. Per verificare eventuali sbiancamenti durante l'acquisizione, eseguire il comando Stampa profilo asse Z sul canale mCherry: andare su Immagine | Pile | Traccia il profilo dell'asse Z. Nella tabella generata, fare clic su Dati | Copia 1 ^° set di dati e incollalo nel foglio di calcolo pronto all'uso fornito con questo protocollo (Tabella supplementare S1), sotto la cella del profilo dell'asse Z.
7. Disegna una regione circolare di interesse (ROI) della dimensione media di un nucleo e salvala: vai su Analizza | Strumenti | Responsabile del ROI.... Aggiungi il ROI e salvalo: vai su Altro | Salvare...
   NOTA: Lo stesso ROI dovrebbe essere utilizzato per misurare lo sfondo per tutte le condizioni analizzate.
8. Posiziona la ROI salvata in una regione senza celle durante l'intero time-lapse e misura l'intensità media all'interno di questa ROI con la funzione di interfaccia ROI. Innanzitutto, assicurati che il valore grigio medio sia spuntato facendo clic su Analizza | Imposta le misure. Quindi, fai clic su Altro | Multi misura. Spunta Misura tutte le 50 fette e una cruda per fetta e fai clic su ok.
9. Copia e incolla tutti i valori visualizzati nel foglio di calcolo fornito (Tabella supplementare S1), sotto la cella "Sfondo ROI".
10. Nelle Figi, chiudere l'immagine con il solo canale mCherry e selezionare l'immagine salvata in precedenza con i canali mCherry e SiR-DNA uniti.
11. Apri il plugin TrackMate: vai su Plugin | Tracciamento | TrackMate.
12. Verifica che il numero di punti temporali sia corretto (da 0 a 49 se sono state seguite le fasi proposte) e clicca su Avanti.
13. Selezionare il rilevatore StarDist e fare clic su Avanti.
14. Selezionare il canale 2 (SiR-DNA) per segmentare i nuclei e fare clic su Avanti. Attendi qualche secondo per il completamento del processo di segmentazione. Verificare visivamente che la segmentazione ottenuta corrisponda al bordo dei nuclei e fare clic su Avanti (Figura 3). In caso di segmentazione imprecisa, prendere nota dell'identificatore del nucleo corrispondente (SpotID) per escluderlo da ulteriori analisi nel passaggio 3.26.
15. Lasciare i parametri predefiniti e fare clic su Avanti nella finestra di impostazione iniziale della soglia . Questa finestra fornisce il numero di punti segmentati (nuclei) tra i 50 punti temporali.
16. Imposta filtri sui punti: crea e imposta filtri:
    1. Creare due filtri con Intensità media ch1 come parametro per rimuovere i nuclei con segnale troppo intenso o troppo debole, che potrebbero distorcere le analisi: un filtro per selezionare i valori superiori alla soglia definita e l'altro per selezionare i valori inferiori alla soglia. Definire il valore per rimuovere solo il segnale molto basso o saturo.
       NOTA: Questi filtri potrebbero non essere necessari se si utilizzano linee cellulari stabili. Prendere nota di questi valori in quanto devono essere riapplicati per tutte le condizioni.
    2. Crea due filtri Area per rimuovere gli oggetti indesiderati (detriti, cellule morenti o in divisione) dalle analisi: un filtro per selezionare i valori al di sopra della soglia definita e l'altro per selezionare i valori al di sotto della soglia. Fare clic su Avanti.
       NOTA: Riapplicare questi valori per tutte le condizioni.
17. Seleziona un tracker: scegli Simple LAP tracker e clicca su Avanti.
18. Selezionare i parametri per il tracciamento. Regola la distanza massima di collegamento (qui, 30 μm), la distanza massima che sarà consentita per collegare gli oggetti tra i fotogrammi. Utilizzare la distanza massima di chiusura dello spazio ( qui, 15 μm) e la distanza massima di frame di chiusura dello spazio (qui, 3) per definire quanti punti di una singola traccia possono essere omessi senza escludere la stessa traccia. Fare clic su Avanti (Figura 3).
    NOTA: Questi parametri proposti sono stati ottimizzati per la nostra configurazione e il modello cellulare utilizzando un approccio per tentativi ed errori e potrebbe essere necessario regolarli sperimentalmente.
    La distanza massima di collegamento deve essere regolata per evitare errori di tracciamento da un nucleo all'altro, soprattutto se le cellule si muovono molto.
19. Dopo i calcoli, fare clic su Avanti e impostare i filtri sulle tracce. Per selezionare solo i nuclei che sono stati tracciati durante l'intero corso temporale (50 punti temporali con la sequenza proposta), selezionare il numero più alto di punti nella traccia (posizionare il cursore su oltre 49 per la sequenza proposta). Fare clic su Avanti.
    NOTA: Questo faciliterà l'analisi, ma è possibile solo se sono stati tracciati abbastanza nuclei per l'intero corso del tempo, in caso contrario: vedi discussione.
20. Opzioni di visualizzazione: selezionare Visualizza i nomi dei punti per poter ripercorrere ogni nucleo in ulteriori analisi. Personalizza le funzionalità visualizzate in base alle preferenze dell'utente.
21. In fondo alla pagina, clicca su Tracce | Esporta in CSV per salvare la tabella con tutte le misure. Chiudi la tabella e fai clic su Avanti.
22. Facoltativamente, tracciare le caratteristiche della traccia con T (tempo) come asse X e l'intensità media di ch1 per l'asse Y. Fare clic su Funzioni del grafico. Chiudi il grafico e fai clic su Avanti.
    NOTA: Questo darà agli utenti un'idea della tendenza generale dell'esportazione. A questo punto, non è normalizzato allo sfondo e all'intensità iniziale.
23. Fare clic su Cattura sovrapposizione come azione ed Esegui | Va bene. L'immagine generata verrà utilizzata per identificare i nuclei quantificati. Salva: vai su File | Salva con nome | Tiff....
24. In un file di foglio di calcolo, importare il file CSV ottenuto con TrackMate: Nella scheda Dati , nel gruppo Ottieni e trasforma dati , fare clic su Da testo/CSV e Importa.
25. Seleziona tutte e quattro le colonne seguenti facendo clic sulla lettera corrispondente e copiale e incollale nella parte superiore del foglio di calcolo fornito (Tabella supplementare S1), colonne da A a D, con lo sfondo: ID spot (B), ID traccia (C), Fotogramma (I), Intensità media ch1 (M).
    NOTA: Assicurarsi che l'inizio delle misure incollate inizi dalla riga 6 della Tabella supplementare S1. In caso contrario, le misurazioni potrebbero essere spostate da una o più celle e quindi essere errate. Fare riferimento al foglio di calcolo della Tabella Supplementare S2 per avere un esempio della disposizione prevista.
26. Ordina i risultati in ordine alfabetico prima per TrackID (singolo nucleo) facendo clic sulla freccia nella cella B5 e Frame (punto temporale) facendo clic sulla freccia nella cella C5.
27. Per rimuovere il rumore di fondo, sottrarre i valori ottenuti al punto 3.8 da ciascun valore ottenuto in Intensità media ch1 (precalcolato nel foglio di calcolo fornito, vedere la Tabella supplementare S1).
28. Per normalizzare il segnale di LEXY, calcolare l'intensità media del segnale fluorescente mCherry nella fase stabile (fotogrammi da 0 a 9). Quindi, dividere tutti i risultati ottenuti in Intensità media ch1 per l'intensità media della fase stabile (precalcolata nel foglio di calcolo fornito, vedere la Tabella supplementare S1).
    NOTA: Il numero ottenuto è l'intensità media della fluorescenza nucleare di LEXY. Tutte le misure sono già visualizzate dai nuclei della colonna L e possono essere tracciate in un grafico.

Figura 3: Analisi TrackMate con FIJI. In alto, la rappresentazione schematica delle analisi del TrackMate, in basso, le immagini ottenute dalle analisi delle FIJI. La prima rappresentazione a sinistra mostra la colorazione SiR-DNA non segmentata, un marcatore del nucleo, in grigio. Il secondo pannello rappresenta la segmentazione automatica eseguita con il canale SiR-DNA da Stardist. I nuclei vengono colorati in base all'intensità del canale mCherry, per facilitare la visualizzazione e lo step finale. Il terzo pannello mostra le tracce ottenute tracciando la colorazione SiR-DNA nei punti temporali dell'intera sequenza di imaging di cellule vive. L'ultimo pannello a destra mostra il segnale fluorescente di LEXY, in rosso, nell'area definita dalla segmentazione, che verrà misurata per ogni punto temporale. Barra di scala = 50 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Tasso di trasporto, statistiche e cifre

1. Traccia il grafico dell'intensità nucleare relativa.
   1. Apri GraphPadPrism e crea un foglio: fai clic su Inserisci o importa i dati in una nuova tabella e, nelle opzioni, seleziona i tempi trascorsi per X e il numero massimo di nuclei segmentati per i valori replicati in sottocolonne affiancate per Y. Fare clic su Crea e incollare i dati ottenuti nella tabella.
   2. Per i valori X (tempo), se i parametri delle acquisizioni sono stati mantenuti come suggerito, copiare e incollare la colonna sotto "tempo" nel foglio di calcolo fornito. In caso contrario, regolare i valori in base ai parametri utilizzati.
   3. Per creare il grafico dell'intensità nucleare relativa, vai alla sezione Grafici. Selezionare XY come famiglia di grafici e Punti e linea di connessione con barre di errore come tipo di grafico.
   4. Nella sezione Traccia, seleziona Media, Errore e SEM e fai clic su OK per visualizzare i grafici. Modifica le scale e le immagini in base ai parametri scelti.
2. Adattare l'intensità nucleare relativa a un modello monoesponenziale.
   1. Nella sezione Tabella dati , fare clic su Nuova tabella dati.
      1. Selezionare Enter X values as X e Enter e tracciare un singolo valore Y per ogni punto come Y, quindi fare clic su Crea.
      2. Nella colonna X , riportare i tempi in decimali solo per le fasi di stabile e di illuminazione; se i parametri suggeriti per le acquisizioni sono stati mantenuti, copiare e incollare la colonna sotto "tempo decimale" nel foglio di calcolo fornito, Tabella supplementare S1.
      3. Incollare nella tabella i valori ottenuti come intensità nucleare relativa , solo per le fasi di stabilità e di illuminazione.
      4. Nella sezione Risultati, selezionare la seguente analisi: Analisi XY | Esponenziale | Regressione non lineare (Curve Fit) e fare clic su OK.
      5. Nei parametri, selezionare Plateau seguito da un decadimento di fase come Modello, e nei parametri di vincolo, selezionare una costante pari a 2.25 come X0 (il tempo di inizio dell'illuminazione), una costante uguale a 1 come Y0 (intensità nucleare relativa all'inizio dell'illuminazione), una costante uguale a 0 per il plateau (i valori verso i quali dovrebbe basarsi l'intensità nucleare relativa), e indicare che K (il tasso di esportazione) deve essere maggiore di 0. Lasciare gli altri parametri predefiniti. Fare clic su OK.
      6. Nella sezione Risultati , la riga K indica tutti i tassi di esportazione per i nuclei della condizione testata.
      7. Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.1.5 per le altre condizioni, se necessario.
3. Crea il grafico del tasso di esportazione.
   1. Crea una nuova tabella: seleziona Inserisci i valori X come X e Invio e traccia un singolo valore Y per ogni punto come Y, quindi fai clic su Crea.
   2. Per ogni condizione (in colonne), incolla e trasponi i valori K ottenuti nel passaggio precedente.
   3. Per creare il grafico del tasso di esportazione, vai alla sezione Grafici , seleziona la colonna come famiglia di grafi e nella sezione Casella e violino , seleziona Grafico a violino come tipo di grafico, con Grafico a violino. Mostra tutti i punti come plot. Clicca su OK per vedere il grafico. Personalizza il modo di rappresentare i dati, se necessario.
   4. Per eseguire un test statistico per il tasso di esportazione, eseguire un test t di Welch su due lati, come descritto in Yoo e Mitchison¹⁴, seguendo i passaggi seguenti:
      1. Nella tabella contenente i tassi di esportazione di tutte le condizioni, cliccare su Analizza | Confronto di gruppi | T-Test (e test non parametrici), selezionare le condizioni da testare e fare clic su OK. Spunta Non accoppiato, Sì usa test parametrico e Test t non accoppiato con la correzione di Welch. Non dare per scontato che le SD siano uguali e fare clic su OK.
   5. Osservare i risultati dell'analisi nella tabella della sezione Risultati e, se necessario, riportare il grafico del tasso di esportazione.

5. Adattamenti per LINuS

NOTA: Il protocollo sopra descritto può essere facilmente adattato per monitorare l'importazione nucleare con LINuS applicando le seguenti modifiche.

1. Coltura cellulare
   1. Invece della leptomicina B al punto 1.5, utilizzare l'importazolo¹⁸ come inibitore nucleare, a una concentrazione di 10 μM per 1 ora prima dell'acquisizione.
2. Imaging
   1. Per avere un'importazione ottimale del sistema, sostituire le 150 ripetizioni di impulsi di illuminazione da 36 ms del laser a 458 nm nel passaggio 2.2.1 con 250 ripetizioni per una durata totale di ~9 s.
      NOTA: la temporizzazione della sequenza può dipendere dal tipo di cella e i parametri per entrambe le sonde potrebbero richiedere una regolazione ottimale, poiché i sistemi dipendono dal riconoscimento di NLS e NES, che sono specifici del tipo di cella ^19,20.
3. Tasso di trasporto, statistiche e cifre
   1. Invece di adattare una curva a un plateau seguito da un decadimento di fase nel passaggio 4.2.1.5, selezionare l'analisi di associazione di fase seguita da un plateau.
   2. Vincolare X0 a 2,25, Y0 come 1 e K (il tasso di importazione nel caso di LINuS) maggiore di 0.
      NOTA: Le analisi di LINuS con TrackMate sono identiche a quelle di LEXY. L'intensità nucleare relativa è ancora il valore misurato e analizzato, ma invece di osservare una diminuzione dovuta all'esportazione della sonda, si dovrebbe osservare un arricchimento del segnale fluorescente nel nucleo dopo l'illuminazione a luce blu.

Risultati

Il protocollo sopra menzionato dovrebbe consentire agli utenti di visualizzare la localizzazione e la traslocazione della sonda durante l'acquisizione nell'imaging di cellule vive. Un esempio delle immagini attese acquisite per visualizzare l'esportazione nucleare con LEXY è mostrato nella Figura 4. Una rapida diminuzione del segnale dal nucleo e un arricchimento nel citosol dovrebbero essere osservati dopo un paio di cicli di illuminazione a luce blu. Un recupero progressivo del segnale della sonda può essere visibile dopo l'arresto dei cicli di illuminazione. Per controllare il sistema, la leptomicina B, un inibitore delle esportazioni, attesta che un cambiamento nell'esportazione può essere visualizzato con le analisi, poiché impedisce l'esportazione di LEXY in seguito all'illuminazione a luce blu (Figura 4).

Figura 4: Visualizzazione del segnale di LEXY nel tempo. Acquisizione di punti temporali rappresentativi delle fasi di stabilità, illuminazione e recupero, acquisiti con imaging di cellule vive. La condizione di metanolo rappresenta la condizione di controllo. Dopo l'illuminazione pulsatile in luce blu, in rosso, il segnale fluorescente mCherry, reporter della posizione di LEXY, viene traslocato dal nucleo al citosol. Dopo aver interrotto l'illuminazione, il segnale viene recuperato nel nucleo. Il trattamento con l'inibitore dell'esportazione leptomicina B a 1 nM o 0,5 nM mostra l'assenza o la diminuzione dell'esportazione di LEXY quando l'esportazione è bloccata. Barra della scala = 30 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per quanto riguarda le analisi, mentre i valori della curva di intensità nucleare relativa durante la fase stabile dovrebbero essere intorno a 1, dopo l'attivazione della luce blu, dovrebbero mostrare una lenta diminuzione fino a raggiungere un plateau alla fine della fase di illuminazione (Figura 5A). Se la diminuzione è troppo veloce o troppo lenta, i parametri di acquisizione possono essere ottimizzati (vedi discussione). Il trattamento con leptomicina B a concentrazioni sufficienti può anche confermare che le analisi e la tecnica sono abbastanza sensibili da dimostrare che l'esportazione nucleare è completamente bloccata, con valori di intensità nucleare relativi stabili a circa 1 per l'intero esperimento. Concentrazioni intermedie di leptomicina B, tuttavia, dovrebbero mostrare una lieve esportazione nucleare (Figura 5A). Queste osservazioni visive dovrebbero essere confermate quantitativamente con l'aumento del tasso di esportazione (Figura 5B).

Figura 5: Intensità nucleare relativa attesa di LEXY e velocità di trasporto. (A) Il grafico rappresenta l'intensità nucleare relativa del segnale fluorescente di LEXY nel tempo, normalizzata all'intensità media mCherry della fase stabile. L'intensità nucleare relativa della condizione di metanolo (controllo, rosso) diminuisce della metà dopo l'illuminazione, a differenza delle cellule trattate con l'inibitore dell'esportazione leptomicina B, a una concentrazione di 0,5 nM (blu chiaro) o 1 nM (blu scuro). Barre di errore: SEM. (B) Velocità di esportazione delle condizioni di controllo e di leptomicina B, ottenuta adattando la curva ad un modello monoesponenziale. I valori ottenuti quando l'esportazione è bloccata dalla leptomicina B sono significativamente inferiori alla condizione di controllo. N = 18 cellule per il metanolo (rosso), 19 cellule per la leptomicina B 0,5 nM (azzurro) e 15 cellule per la leptomicina B 1 nM (blu scuro). I valori di P sono stati calcolati mediante un test t di Welch a due lati. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare S1: foglio di calcolo con calcoli predefiniti. Questo foglio di calcolo viene fornito per facilitare l'analisi. I valori di intensità ottenuti con TrackMate possono essere copiati e incollati direttamente nel foglio di calcolo per ottenere i valori di intensità nucleare relativi normalizzati. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: Esempio dei risultati attesi per una condizione di controllo dell'analisi di LEXY. Il foglio di calcolo rappresenta un esempio dei valori ottenuti per una condizione di controllo della linea cellulare stabile di LEXY. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Come accennato nel protocollo, la creazione di linee cellulari stabili migliora notevolmente la qualità delle analisi. In primo luogo, avere il 100% delle cellule che esprimono le sonde aumenta il numero di nuclei tracciati e analizzati, il che rafforza la robustezza delle analisi. In secondo luogo, riduce la morte cellulare indotta dalla sovraespressione delle sonde e dalla tossicità dei reagenti di trasfezione utilizzati. Infine, riduce la forte eterogeneità dei segnali fluorescenti tra le cellule. Questo parametro è importante poiché un segnale saturo non consentirà il rilevamento corretto della variazione di intensità dopo l'illuminazione. La stessa conclusione vale per i segnali deboli, che possono sbiancare o non consentire la quantificazione delle differenze. Pertanto, si consiglia di testare prima le sonde mediante trasfezione per assicurarsi che funzionino correttamente, impostando i parametri di acquisizione e quindi creando rapidamente linee cellulari stabili. Abbiamo creato vettori di lentivirus sia per le sonde LEXY che per LINuS, che sono disponibili per la condivisione su richiesta, così come le linee stabili NIH/3T3 LEXY o LINuS create con questi lentivirus.

Se le sonde sono trasfettate o se le celle sono sparse, i parametri suggeriti probabilmente diminuiranno il numero di tracce rilevate e le analisi saranno meno robuste. In questo caso, gli utenti possono essere più permissivi con gli spot omessi nel tracciamento diminuendo il numero di spot del filtro nelle tracce (suggeriamo di mantenere almeno 45 spot su 50). Attenzione: se questo filtro viene diminuito, il file Excel fornito (Tabella Supplementare S1) deve essere regolato manualmente: infatti, i valori incollati dal CSV importato non terranno conto degli spazi vuoti. L'utente deve trovare dove si trovano i punti mancanti con il numero TrackID e correlarli con il numero del nucleo, che di solito richiede alcuni giri di copia-incolla.

Un parametro critico per garantire il successo dell'esperimento è quello di mantenere le celle al buio. Poiché le sonde reagiscono alla luce blu, gli utenti devono garantire il trasporto delle cellule al buio per almeno 30 minuti prima dell'acquisizione. E' sufficiente una piccola scatola chiusa o utilizzando dell'alluminio per coprire il piatto. Allo stesso modo, è necessario fare molta attenzione a utilizzare solo la luce mCherry per cercare le cellule al microscopio, poiché l'illuminazione con luce blu attiva le cellule. Se un'eventuale illuminazione avviene al microscopio, cercare un altro campo distante per l'acquisizione. Tracciare il profilo dell'asse Z nel passaggio 3.6 aiuterà a sapere se le celle sono state influenzate da un'illuminazione, se la curva sta diminuendo invece di essere un plateau.

La sequenza di imaging è impostata in modo da essere composta da tre fasi. In primo luogo, la fase di stabilità, per valutare il potenziale sbiancamento, ma anche per garantire che la localizzazione di LEXY sia costante senza attivazione (1). In secondo luogo, la fase di attivazione, che consiste in cicli di illuminazione pulsatile a luce blu, per indurre la traslocazione di LEXY dal nucleo al citosol (2). Infine, la fase di recupero opzionale, in cui il segnale torna progressivamente alla sua posizione iniziale nel nucleo (3).

La sequenza descritta per le acquisizioni può essere specifica per il tipo di cellula^19,20. Per il primo esperimento, l'utente deve testare e modificare la potenza e i tempi del laser per vedere il sistema traslocare progressivamente tra il nucleo e il citosol. Di importanza, una potenza laser troppo forte, come una pausa troppo breve, potrebbe impedire di vedere una traslocazione progressiva, ma invece un brutale calo/arricchimento (a seconda della sonda utilizzata) dell'intensità mCherry dopo l'illuminazione.

Se l'ottimizzazione della sequenza non risolve il problema, è probabile che il NES e/o l'NLS non siano adatti al tipo di cella utilizzato. Gli utenti possono fare riferimento all'articolo⁸ del metodo LINuS per progettare e modificare le sonde. Gli utenti possono anche consultare questo articolo per l'imaging di LINuS con un microscopio a epifluorescenza.

La segmentazione dei nuclei è una fase critica dell'analisi. Per l'imaging delle sonde su cellule vive dovrebbe essere utilizzato un marcatore nucleare robusto e affidabile. Poiché l'illuminazione con luce blu attiva la traslocazione della sonda e poiché le sonde sono monitorate con la proteina fluorescente mCherry, questo marcatore deve essere visibile nello spettro rosso lontano o vicino. Nel nostro caso, utilizziamo il SiR-DNA che colora le cellule durante 1-~24 ore di incubazione, ma anche l'uso di SPY-DNA 650 è un'opzione (vedi Tabella dei materiali per i riferimenti).

Infine, se la segmentazione con StarDist combinata con il tracciamento filtrato di TrackMate dimostra la sua efficienza, è importante notare che l'utente dovrebbe sempre controllare visivamente i risultati della segmentazione e della quantificazione. Una cellula che si divide o muore potrebbe essere inclusa nella quantificazione, mentre non dovrebbe. Per ridurre i rischi di analisi di tali eventi, il foglio Excel fornito attribuisce un codice colore all'intensità nucleare relativa (blu = valori bassi, rosso = valori alti). Ispezionando i colori prima di tracciare i valori in GraphPad Prism, l'utente dovrebbe essere in grado di notare eventuali valori insoliti. Ad esempio, le intensità nucleari relative di LEXY dovrebbero variare da alte (rosso, forti quantità della sonda nei nuclei) durante la fase stabile a basse (blu, quantità ridotte della sonda nei nuclei) alla fine della fase di illuminazione, prima di tornare a valori elevati (rosso), nella fase di recupero (come mostrato nella Tabella supplementare S2).

Questo protocollo presenta vari vantaggi rispetto ai metodi precedentemente proposti ^5,6. La pipeline semiautomatica facilita l'analisi del trasporto nucleocitoplasmatico di LEXY e LINuS e fornisce una maggiore precisione rispetto alla quantificazione manuale precedentemente proposta ^5,6. L'utilizzo del nostro protocollo consentirà ai principianti del settore di eseguire analisi efficienti, ma fornirà anche un nuovo strumento per gli utenti esperti, che avranno bisogno di una sola interfaccia ad accesso aperto per eseguire analisi semi-automatizzate del trasporto nucleocitoplasmatico.

Questo metodo può essere utilizzato per ulteriori applicazioni oltre allo studio della velocità di trasporto nucleocitoplasmatico globale nelle linee cellulari NIH3T3. Infatti, con alcuni passaggi di ottimizzazione, può essere adattato per studiare la velocità di trasporto della sonda in vari tipi di cellule o animali viventi⁸. Inoltre, fondendo una proteina di interesse con LEXY o LINuS, è anche possibile studiare la sua velocità di trasporto o gli effetti a valle della sua traslocazione indotta dalla luce all'interno o all'esterno del nucleo. Ad esempio, è possibile sequestrare una proteina nel citoplasma con LEXY, o forzare la sua localizzazione nel nucleo con LINuS 5,6,21,22,23. Infine, le analisi descritte possono essere estese anche a più applicazioni rispetto a LEXY e LINuS, per tracciare qualsiasi segnale che trasloca tra compartimenti subcellulari che possono essere segmentati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagene	Sigma-Aldrich	08-115
Microscopio confocale	LEICA	SP8
DMEM	Gibco	31966021
Eccellere	Valentina
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141
Software FIJI	FIGI		ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Piatti al fluoro	Dutscher	FD3510-100	Alternativa: Camera Attofluor (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prism 10.4.1	Software GraphPad, Inc.
Importazole	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomicina B	Sigma-Aldrich	L2913
Plasmide LEXY	Addgene	72655	pDN122
Plasmide LINuS	Addgene	61347	pDN77
Matita-Streptomicina	Gibco	15140-122
DMEM senza rosso fenolo	Gibco	21063-029
SiR-DNA	Spirocromo	SC007	Alternativa: SPY-DNA650 (Spirochrome #SC501)
Plugin 2D Stardist	Distribe stellare		StarDist_0.3.0
Plugin TrackMate	TrackMate		TrackMate-7.14.0