Metodologia per lo studio dell'apprendimento e della memoria nei ratti giovani utilizzando l'anestesia con sevoflurano per valutare l'espressione di p-CREB e c-fos dell'ippocampo

Summary

Questo studio indaga su come il sevoflurano comprometta la ritenzione della memoria e riduca l'espressione di p-CREB e c-fos nei neuroni dell'ippocampo attraverso la via NMDAR/p-CREB/c-fos nei ratti giovani. I risultati mostrano che il sevoflurano causa deficit di memoria a breve termine e sottoregola i marcatori di plasticità sinaptica, con effetti reversibili dopo 3 giorni, indipendentemente dalla frequenza di dosaggio.

Abstract

Lo studio dei disturbi cognitivi durante lo sviluppo cerebrale affronta sfide dovute alla natura dinamica del neurosviluppo, ai vincoli metodologici e alle barriere contestuali. Questo studio ha studiato un approccio metodologico integrato per studiare i disturbi cognitivi nel cervello in via di sviluppo causati dal sevoflurano sulla base della memoria e dell'espressione di p-CREB e c-fos nei neuroni ippocampali attraverso la via di segnalazione NMDAR/p-CREB/c-fos nei ratti giovani. Sessantaquattro ratti maschi SD di 21 giorni (peso corporeo <80 g) sono stati divisi in cinque gruppi: normale (n=8), 60% O₂ (n=16), allenamento fittizio (n=8), sevoflurano a dose singola (n=16) e sevoflurano a dosi multiple (n=16). I due gruppi di sevoflurano sono stati suddivisi in sacrificio 1 giorno (gruppi sev1a e sev1b) e 30 giorni (gruppi sev30a e sev30b) dopo l'allenamento (n=8/sottogruppo); Tutti gli altri ratti sono stati sacrificati 1 ora dopo l'addestramento. Il test del labirinto a Y è stato utilizzato per valutare l'apprendimento e la conservazione della memoria. L'immunoistochimica è stata utilizzata per determinare il numero di neuroni p-CREB e c-fos-positivi nei campioni di ippocampo. Rispetto al gruppo 60% O₂ (ritenzione di memoria dell'86,33% ± 17,52%), la memoria dei ratti nei gruppi sev1a e sev1b ha mostrato una diminuzione significativa (sev1a: 44,29% ± 11,26%; sev1b: 62,42% ± 7,27%; tutti i gruppi P<0,05), mentre i gruppi sev1b e sev30b non hanno mostrato differenze significative (sev30a: 84,41% ± 14,15%; sev30b: 85,21% ± 11,61%; tutti P>0,05). Rispetto al gruppo 60% O₂ (c-fos: 92,83 ± 7,88; p-CREB: 72,22 ± 8,89), l'espressione di p-CREB e c-fos nei neuroni ippocampali è diminuita nel gruppo sev1a (c-fos: 23,13 ± 3,28; p-CREB: 22,88 ± 5,18) e nel gruppo sev30 (c-fos: 23,22 ± 3,13; p-CREB: 25,58 ± 2,26) (tutti P<0,05), mentre i gruppi sev30a e sev30b non hanno mostrato differenze significative (tutti P>0,05). Il sevoflurano ha un effetto stimolante negativo a breve termine sulla capacità di mantenimento della memoria dei ratti giovani senza un impatto basato sulla frequenza di dosaggio. Il sevoflurano riduce l'espressione di p-CREB e c-fos nei neuroni dell'ippocampo di ratti giovani.

Introduction

Lo studio dei disturbi cognitivi durante lo sviluppo cerebrale affronta sfide significative a causa della natura dinamica del neurosviluppo, dei vincoli metodologici e delle barriere contestuali. Lo sviluppo cerebrale comporta cambiamenti rapidi e non lineari, complicando l'identificazione delle menomazioni durante le finestre critiche ^1,2. In contesti con scarse risorse, barriere come l'alfabetizzazione del caregiver, la diversità linguistica e l'accesso limitato a strumenti specializzati (ad esempio, la risonanza magnetica) ostacolano lo screening precoce¹. La variabilità individuale nella maturazione cerebrale rende difficile distinguere le deviazioni patologiche dallo sviluppo tipico ^2,3. Condizioni come la sindrome di Down mostrano uno sviluppo corticale alterato, ma le piccole dimensioni del campione e gli scarsi dati istologici limitano le intuizioni meccanicistiche⁴. I disturbi del neurosviluppo (ad esempio, ASD, ADHD) spesso coesistono con ansia o depressione, confondendo le valutazioni cognitive⁵. Gravi deficit di comunicazione in alcune popolazioni limitano l'uso di test standardizzati⁶. Queste caratteristiche portano a diversi problemi di progettazione della ricerca. In effetti, la maggior parte degli studi utilizza disegni trasversali, non riuscendo a modellare il cambiamento individuale nel tempo. C'è un'eccessiva dipendenza dalle popolazioni occidentali istruite (campioni "WEIRD")⁷. La ricerca sulla sindrome di Down soffre di piccoli campioni cerebrali post-mortem e di controlli inadeguati di pari età⁴. Gli strumenti di valutazione momentanea ecologica faticano a tenere conto delle variabili contestuali che influenzano le prestazioni cognitive quotidiane⁵.

Le funzioni più importanti nel cervello animale e umano includono l'apprendimento e la memoria, che sono fondamentali per lo sviluppo umano e la vita in generale⁸. Il cervello dei neonati è in fase di sviluppo ed è vulnerabile a fattori esterni come farmaci e anestesia ^9,10. Il danno causato dagli anestetici alla funzione della memoria dei neonati è un argomento cruciale della ricerca clinica e può persino ritardare i trattamenti ottimali per i pazienti pediatrici a causa dell'incapacità di eseguire l'anestesia¹¹. Le disfunzioni cognitive correlate all'anestesia (o disfunzione cognitiva postoperatoria, POCD) possono avere conseguenze a lungo termine per i neonati^{di 12} anni. L'inalazione di sevoflurano può influenzare le funzioni della memoria nei neonati^13,14, ma l'anestesiologia tradizionale ritiene che il danno cerebrale nei neonati sia causato principalmente dall'ipossia cerebrale durante l'anestesia, specialmente in anestesia generale¹⁰. Pertanto, finché non vi è ipossia a breve o lungo termine nel cervello, il rischio di lesioni al sistema nervoso centrale nei neonati dovrebbe essere ridotto¹¹. Tuttavia, la comprensione del POCD rimane non ottimale. I neonati che necessitano di un intervento chirurgico avranno bisogno di anestesia e una migliore conoscenza dei percorsi coinvolti potrebbe aiutare a progettare strategie di anestesia che riducano al minimo il rischio di POCD.

Uno studio che ha coinvolto pazienti adulti più anziani sottoposti a interventi chirurgici non cardiaci ha rivelato che quasi il 25% dei pazienti ha manifestato POCD entro 1 settimana dall'intervento chirurgico e la percentuale è scesa al di sotto del 10% dopo 3 mesi, mentre il gruppo di controllo ha mostrato tassi di POCD del 3,4% e del 2,8%¹⁵. Lo studio ha anche indicato che la maggior parte dei casi di POCD erano reversibili, con solo un piccolo numero di pazienti che manifestavano POCD¹⁵ prolungata o permanente. Nel sistema nervoso centrale, il glutammato è l'aminoacido eccitatorio più comune¹⁶. Il recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) è fondamentale per l'induzione e il mantenimento del potenziamento a lungo termine (LTP) e della depressione a lungo termine (LTD)¹⁷. La ricerca sui topi ha dimostrato che la plasticità sinaptica eccitatoria influisce direttamente sullo sviluppo della funzione cerebrale¹⁸, con l'attivazione di NMDAR e l'afflusso di calcio particolarmente importanti^19,20. L'aumento dell'attività di NMDAR ha implicazioni significative per l'induzione della crescita sinaptica e della plasticità^19,20. Pertanto, un grado più elevato di blocco NMDAR da parte degli antagonisti NMDAR (ad esempio, sevoflurano) dovrebbe comportare una minore capacità di apprendimento e memoria²¹. Mentre gli effetti del sevoflurano sull'apprendimento e sulla memoria nel cervello adulto non hanno raggiunto una conclusione chiara^22,23, il sevoflurano è comunemente usato per l'anestesia negli interventi chirurgici pediatrici¹⁴. Come antagonista non competitivo di NMDAR, il sevoflurano può influenzare significativamente le funzioni di apprendimento e memoria del cervello 11,13,14,23,24. Tuttavia, oltre all'NMDAR, altre vie e proteine sono coinvolte nell'apprendimento e nella memoria, e i meccanismi di regolazione della memoria che coinvolgono la proteina legante l'elemento di risposta al cAMP fosforilato (p-CREB) e il gene c-fos precoce immediato stanno diventando più chiari 25,26,27, ma richiedono ancora una migliore comprensione per la somministrazione ottimale dell'anestesia nei neonati e nei bambini.

Sulla base di questi quadri teorici, il presente studio ha studiato un approccio metodologico integrato che potrebbe essere utilizzato per studiare i disturbi cognitivi nel cervello in via di sviluppo causati dal sevoflurano sulla base della memoria e dell'espressione di p-CREB e c-fos nei neuroni ippocampali attraverso la via di segnalazione NMDAR/p-CREB/c-fos nei ratti giovani. I risultati potrebbero aiutare a migliorare la nostra comprensione della POCD e della compromissione della memoria dopo l'anestesia generale. Questo studio ha utilizzato ratti di 21 giorni perché erano appena stati svezzati e avevano un peso corporeo e uno stato fisiologico altamente uniformi, corrispondenti alla prima adolescenza negli esseri umani. A causa della loro elevata neuroplasticità e vulnerabilità durante questo periodo critico dello sviluppo, possono modellare in modo efficiente i disturbi cognitivi causati dalla chirurgia o dall'anestesia sul cervello immaturo^28,29. Questo li rende particolarmente adatti per studiare i rischi neurocognitivi associati alla chirurgia pediatrica ed esplorare potenziali strategie di intervento. Il labirinto a Y è un metodo comunemente usato per valutare l'apprendimento e la memoria³⁰. L'immunoistochimica è comunemente usata per studiare i neuroni e varie proteine neuronali.

Protocol

Tutti i protocolli di questo studio sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Xinhua, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (approvazione n. XHEC-C-2016-023-2).

1. Panoramica sperimentale degli animali e del raggruppamento

1. Procurati 64 ratti SD maschi di 21 giorni (peso corporeo inferiore a 80 g).
2. Dividi i ratti in cinque gruppi: Gruppo normale (n = 8), Gruppo 60% O₂ (n = 16), Gruppo di allenamento fittizio (n = 8), Gruppo sevoflurano a dose singola (n = 16) e Gruppo sevoflurano a dose multipla (n = 16) (Vedi Tabella 1).
3. Alloggiare i ratti in una struttura per animali a 20-24 °C con il 50%-60% di umidità e luce naturale.
4. Fornire cibo e acqua adeguati.
5. Assicurarsi che tutti i protocolli siano esaminati e approvati dal Comitato Etico.
6. Preparare la camera di inalazione (vedere la Figura supplementare S1, dettagliata nel paragrafo 2.1).
7. Gruppo normale
   1. Esporre i ratti al 60% di aria per 2 ore (dettagliato nella sezione 2.2).
   2. Eseguire il test del labirinto a Y 1 giorno dopo l'esposizione (descritto nel paragrafo 4).
   3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).
8. 60% Gruppo O₂
   1. Esporre i ratti al 60% di aria per 2 ore (dettagliato nella sezione 2.2).
   2. Eseguire il test del labirinto a Y 30 giorni dopo l'esposizione (descritto nel paragrafo 4).
   3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).
9. Gruppo di allenamento fittizio
   1. Esporre i ratti al 60% di aria per 2 ore (dettagliato nella sezione 2.2).
   2. Eseguire il test del labirinto a Y 1 giorno dopo l'esposizione senza un allenamento strutturato (le posizioni delle luci e delle zone di shock variavano in modo casuale), utilizzato per controllare gli effetti della luce e degli stimoli elettrici sull'apprendimento e sulla memoria (dettagliato nella sezione 4).
   3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).
10. Gruppo sevoflurano monodose (gruppo sev1a)
    1. Esporre i ratti al 60% di aria + 3% di sevoflurano per 2 ore (descritto nel paragrafo 2.2).
    2. Eseguire il test del labirinto a Y 1 giorno dopo l'esposizione (descritto nel paragrafo 4).
    3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).
11. Gruppo sevoflurano monodose (gruppo sev30a)
    1. Esporre i ratti al 60% di aria + 3% di sevoflurano per 2 ore (descritto nel paragrafo 2.2).
    2. Eseguire il test del labirinto a Y 30 giorni dopo l'esposizione (descritto nel paragrafo 4).
    3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).
12. Gruppo sevoflurano a dosi ripetute (gruppo sev1b)
    1. Esporre i ratti al 60% di aria + 3% di sevoflurano per 2 ore al giorno, per 7 giorni consecutivi (descritto nel paragrafo 2.2).
    2. Eseguire il test del labirinto a Y 1 giorno dopo l'esposizione (descritto nel paragrafo 4).
    3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).
13. Gruppo sevoflurano a dosi ripetute (gruppo sev30b)
    1. Esporre i ratti al 60% di aria + 3% di sevoflurano per 2 ore al giorno, per 7 giorni consecutivi (descritto nel paragrafo 2.2).
    2. Eseguire il test del labirinto a Y 30 giorni dopo l'esposizione (descritto nel paragrafo 4).
    3. Raccogliere il tessuto dopo il test comportamentale (descritto in dettaglio nella sezione 5).

2. Inalazione di sevoflurano

1. Preparazione della camera (vedi figura supplementare S1)
   1. Collegare il foro a sinistra della scatola al 60% Ø₂/40% N₂.
   2. Collegare l'alimentazione di ossigeno al vaporizzatore di sevoflurano.
   3. Collegare il foro a destra della scatola all'analizzatore di gas di una macchina per anestesia.
   4. Collegare il foro sulla parte superiore della camera allo scarico del gas.
   5. Metti la calce sotto la rete sul fondo della camera e aggiungi un batuffolo di cotone.
   6. Posizionare l'installazione in una cappa aspirante.
   7. Posizionare un termoforo sotto la camera.
2. Inalazione
   1. Accendi l'alimentazione di ossigeno e il vaporizzatore di sevoflurano.
   2. Regolare il flusso di ossigeno a 2 L/min.
   3. Quando la concentrazione di sevoflurano raggiunge il 3,0%, mantenere il flusso per 30 minuti per stabilizzare l'atmosfera nella camera.
   4. Posiziona un topo sul lato di cotone della camera.
   5. Tenete lì il ratto in base al raggruppamento (vedi passaggio 1.2).
   6. Monitorare il colore della pelle, la frequenza respiratoria, la frequenza cardiaca e la pulsossimetria.
   7. Rimuovi il topo.
   8. Lascia che il topo si svegli naturalmente.
   9. Rimetti il topo nella sua gabbia.

3. Reagenti e strumenti sperimentali

1. Preparazione del reagente
   1. Preparare 250 ml di sevoflurano disponibile in commercio per la somministrazione dell'anestesia.
   2. Preparare la soluzione di lavoro dell'anticorpo p-CREB diluendo l'anticorpo standard 1:350.
   3. Preparare la soluzione di lavoro dell'anticorpo c-FOS diluendo l'anticorpo stock 1:200.
   4. Assemblare il kit per la colorazione immunoistochimica.
   5. Preparare il 4% di paraformaldeide.
      1. Sciogliere 40 g di paraformaldeide solubile (PFA) in un contenitore di vetro con 500 ml di acqua ad alta purezza, riscaldare continuamente e mescolare magneticamente a 60-65 °C fino a formare una sospensione lattiginosa.
      2. Aggiungere gocce di 1,0 mol/L di NaOH fino a quando la soluzione diventa limpida (pH = 7,0).
      3. Aggiungere circa 500 ml di PBS e mescolare accuratamente in un bagno di ghiaccio o in un bagno di acqua fredda.
      4. Controllare nuovamente il pH, filtrare e portare a un volume fino a 1000 ml.
      5. Conservare a 4 °C per un uso futuro.
2. Configurazione dell'attrezzatura
   1. Posizionare il labirinto a Y nell'area di test comportamentale (vedere la figura supplementare S2).
   2. Calibra il microscopio con un sistema di imaging integrato per l'analisi istologica.
3. Installare il microtomo con lame fresche per il sezionamento dei tessuti.
4. Programmare la macchina per la disidratazione con il protocollo standard di lavorazione dei tessuti.
5. Preparare la macchina di colorazione con i bagni di colorazione sequenziali secondo le istruzioni del produttore della macchina.
6. Installare l'apparato di perfusione.
   1. Utilizzare due flaconi di soluzione salina confezionati in plastica, scolare la soluzione salina dall'apertura inferiore e riempirli con PBS e fissativo paraformaldeide al 4%.
   2. Appendere le bottiglie, collegarle ai set di infusione e collegare un rubinetto a tre vie all'estremità spessa dell'ago del set di infusione.

4. Labirinto a Y e test di apprendimento/memoria

1. Assembla il labirinto a Y
   1. Allestisci il labirinto a Y con tre bracci rettangolari etichettati I, II e III, collegati da una giunzione triangolare (vedi Figura supplementare S2).
   2. Posiziona una griglia elettrica con una distanza di 1 cm sul fondo del labirinto.
   3. Attacca sottili strisce di rame di 2 cm sulle pareti del labirinto per simulare le aree pericolose e installa luci di segnalazione di stimolo.
2. Definisci aree pericolose e sicure
   1. Elettrificare le regioni I, II e III a 16.000 V/m per indicare le aree pericolose (la spia di segnalazione si accende quando è elettrificata).
   2. Contrassegna le regioni non elettrificate con una luce rossa per indicare le aree sicure.
   3. Definisci la giunzione tra i bracci come un'area non sicura in cui il ratto potrebbe ricevere una scossa elettrica.
3. Procedura di formazione
   1. All'inizio dell'esperimento, considera l'area in cui si trova il ratto come area sicura.
   2. Dopo 2-4 minuti, applicare l'elettricità all'area sicura, incoraggiando il ratto a spostarsi verso la zona sicura.
   3. Se il ratto si sposta dall'area sicura a un'area pericolosa, tornerà nella zona sicura sotto scossa elettrica, mostrando una risposta di evitamento passivo.
4. Sviluppare la risposta attiva all'evitamento
   1. Dopo diverse sessioni di allenamento, accendere la luce nell'area sicura senza applicare scosse elettriche.
   2. Osservare il movimento del ratto verso l'area sicura illuminata, formando un riflesso condizionato di discriminazione luce-buio (risposta attiva di evitamento).
5. Posiziona il labirinto a Y in un'area poco illuminata e tranquilla per ridurre al minimo le distrazioni esterne.
6. Conduci la formazione tutti i giorni dalle 9:00 alle 11:00 e dalle 14:00 alle 16:00.
7. Lascia che i ratti si muovano liberamente all'interno del labirinto per 5 minuti prima dell'esperimento per aiutarli ad adattarsi all'ambiente del labirinto.
8. Regola i parametri dello stimolo
   1. Regolare la tensione dello stimolo (16.000 V/m) durante il test per garantire che i ratti scappino entro 10 s dopo aver ricevuto una scossa elettrica.
   2. Tenere accesa la spia di segnalazione dell'area sicura per 15 secondi, quindi spegnerla.
   3. Inizia il prossimo ciclo di esperimenti d'urto dopo un intervallo di 45 s.
9. Sequenza luminosa di segnalazione e risposta corretta
   1. Impostare la sequenza di accensione delle luci di segnalazione come I → II → III → I, in un ciclo.
   2. Definire una risposta corretta come il ratto che fugge dall'area di partenza direttamente verso la zona sicura illuminata entro 10 s dopo aver ricevuto una scossa elettrica.
10. Si consideri che il ratto ha raggiunto lo standard di apprendimento se effettua la risposta di fuga corretta in 8 prove consecutive su 10.
11. Registra qualsiasi fuga verso un braccio senza luce come risposta errata.
12. Molteplici sessioni di formazione e test
    1. Esegui più sessioni di formazione e test per valutare l'apprendimento e la memoria.
    2. Registra il numero di risposte corrette e errate durante un numero fisso di prove.
    3. Modifica l'area di partenza per aumentare la complessità dell'attività.
13. Valutare la conservazione della memoria a intervalli (ad esempio, 24 o 48 ore dopo l'allenamento) per valutare la capacità di ritenzione della memoria dei ratti.

5. Immunoistochimica

1. Anestetizzare i ratti
   1. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di idrato di cloralio al 10% (0,4 ml/100 g) 1 ora dopo l'allenamento per anestetizzare i ratti. Smaltire la soluzione di idrato di cloralio secondo le normative locali.
   2. Eseguire la toracotomia per esporre completamente il cuore³¹.
2. Perfondere ratti anestetizzati con soluzione fisiologica
   1. Inserire un ago contenente PBS nel ventricolo sinistro in direzione dell'aorta, fissare l'ago con una pinza emostatica e aprire immediatamente il padiglione auricolare destro del topo per rilasciare il sangue venoso.
   2. Iniettare rapidamente PBS fino a quando l'effluente è limpido e il fegato e i polmoni appaiono bianchi.
   3. Seguire con un'infusione rapida e poi lenta di 500 ml di soluzione di formalina al 10% fino a quando il corpo dell'animale non si irrigidisce, raggiungendo la fissazione della formalina.
   4. Smaltire la soluzione di formalina secondo le normative locali.
3. Rimuovi il cervello
   1. Apri rapidamente il teschio³².
   2. Rimuovere l'intero cervello sollevandolo delicatamente dal cranio e tagliando i vasi sanguigni e il midollo spinale alla base, senza danneggiare gli emisferi (come mostrato nella Figura S3 supplementare).
4. Sezionare l'ippocampo
   1. Sezionare l'ippocampo bilaterale.
      1. Al forame occipitale del topo, recidere l'intero cervello con le forbici.
      2. Inserire con cautela le forbici in diagonale nel forame magno per tagliare l'osso parietale.
      3. Separare entrambi i lati dell'osso parietale con una pinza emostatica.
      4. Usa le forbici per tagliare il nervo ottico su un lato e sonda fino alla base del cranio.
   2. Mettere l'ippocampo in una soluzione di formalina al 10% per 12 ore.
   3. Immergere il campione in formalina contenente un gradiente di saccarosio (10%, 20%, 30%).
   4. Conservare per una notte a 4°C fino a quando il tessuto del campione non affonda sul fondo.
5. Incorporare e sezionare il campione
   1. Incorporare il campione nella paraffina. Smaltire la soluzione di formalina secondo le normative locali.
   2. Sezionare il campione incorporato a 4 μm.
6. Deparaffinare e reidratare le sezioni
   1. Immergere le sezioni in 50 ml di xilene tre volte per la deparaffinazione, ogni volta per 15 minuti.
   2. Immergere in sequenza in 50 ml di etanolo al 100%, 90%, 70% e 50% per 10 minuti ciascuno.
   3. Risciacquare tre volte con 50 mL di 0,01 mM PBS per 3 minuti ciascuna.
7. Recupero dell'antigene
   1. Posizionare le sezioni in 50 mL di tampone citrato (PBS, pH 6,0).
   2. Riscaldare le sezioni in una pentola a pressione in acciaio inox a 120 °C. Posizionare le sezioni su una griglia, completamente immerse nel buffer. Sigillare la pentola, scaldare e mantenere ad alta pressione per 3 minuti.
   3. Togliete il fornello dal fuoco e lasciatelo raffreddare naturalmente a temperatura ambiente prima di aprire il coperchio.
   4. Risciacquare le sezioni in PBS (pH 7,2) per 2 minuti, ripetendo 3 volte.
   5. Applicare circa 100-200 μL di 3% H₂O₂ per coprire la sezione sul vetrino e incubare a temperatura ambiente per 5-10 minuti per eliminare l'attività endogena della perossidasi.
   6. Risciacquare con PBS per 2 minuti, 3 volte.
8. Incubazione degli anticorpi primari
   1. Aggiungere 200 μl di anticorpi primari (diluiti 1:150 in 0,01 mol/L di PBS) alle sezioni.
   2. Incubare per una notte a 4°C.
9. Incubazione di anticorpi secondari
   1. Risciacquare le sezioni in PBS per 3 minuti, 3 volte.
   2. Incubare le sezioni con circa 100-200 μL di Polymer Helper per coprire la sezione sul vetrino e incubare a 37 °C per 20 minuti.
   3. Sciacquare le sezioni in 0,1 mol/L PBS per 2 minuti, 3 volte.
   4. Aggiungere circa 100-200 μL di IgG poliperossidasi-anti-topo/coniglio e incubare a 37°C per 20 minuti.
   5. Risciacquare le sezioni in PBS per 3 minuti, 3 volte.
10. Sviluppo del colore
    1. Aggiungere circa 100-200 μl della soluzione di diaminobenzidina (DAB) (sufficiente a coprire la sezione sul vetrino) per lo sviluppo del colore.
    2. Lasciare agire per circa 3 minuti.
11. Controcolorazione e montaggio
    1. Eseguire la controcolorazione aggiungendo circa 100-200 μl di ematossilina goccia a goccia per coprire completamente la sezione su ciascun vetrino.
12. Disidratare e montare le sezioni
    1. Disidratare le sezioni in 50 ml di etanolo al 50%, 70%, 90% e 100% per 10 minuti ciascuna, seguiti da 50 ml di xilene per 10 minuti.
    2. Pulire e montare le sezioni utilizzando le procedure standard.
13. Esame microscopico
    1. Conta il numero di neuroni p-CREB- e c-fos-positivi nell'ippocampo di ciascun gruppo^33,34.
    2. Esaminare le sezioni al microscopio con un ingrandimento di 400x.
    3. Registra il numero medio di neuroni positivi in ogni fetta, in base ai conteggi di tre sezioni per animale senza sovrapposizioni.
       NOTA: Tutti i dati sono stati compilati in un foglio di calcolo informatico. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando un software statistico. I risultati sono stati presentati come medie ±errore standard della media (SEM) e analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con i test post hoc SNK-q e Dunnett T3³⁵. Il test SNK-q è comunemente usato per studi esplorativi ed è adatto per confronti a coppie tra più medie campionarie. Non si basa su ipotesi predefinite, il che lo rende ideale per confrontare tutte le medie di gruppo³⁶. Il test Dunnett T3 viene generalmente utilizzato per studi di conferma con ipotesi predefinite. È adatto per confrontare più gruppi di trattamento con un gruppo di controllo o per confrontare mezzi con particolare significato professionale ^35,37. Quando il valore P del test ANOVA era ≤ 0,05, sono stati eseguiti i test post hoc a coppie per determinare quali gruppi erano significativamente diversi dagli altri. I valori P a due facce < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Results

Utilizzando i dati di questo studio come esempi illustrativi, abbiamo mostrato i tipi di risultati che possono essere generati con questo quadro metodologico, comprese le immagini rappresentative dell'immunocolorazione e i dati comportamentali e molecolari di diversi gruppi. L'accento è posto sulla presentazione dei risultati tipici o attesi prodotti da questo approccio, piuttosto che fornire un'interpretazione del loro significato biologico.

Risultati dei test di apprendimento e memor...

Discussion

Questo studio ha studiato come il sevoflurano influenzi la memoria e moduli l'espressione di p-CREB e c-fos nei neuroni dell'ippocampo attraverso la via di segnalazione NMDAR/p-CREB/c-fos nei ratti giovani. I risultati suggeriscono che il sevoflurano ha avuto un effetto stimolante negativo a breve termine (1 ora dopo l'allenamento, non dopo 3 giorni) sulla capacità di mantenimento della memoria dei ratti giovani, senza alcun impatto in base alla frequenza di somministrazione (dose singol...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animali da esperimento
Ratti di Sprague-Dawley (SD)	Charles River Laboratories (Pechino, Cina)	N/A	21 giorni, maschio
Chow per ratti standard	Keao Xieli Feed (Pechino, Cina)	N/A	Dieta standard per animali da laboratorio
Sostanze chimiche e reagenti
Idrato di cloralio	Reagente chimico Sinopharm (Shanghai, Cina)	80113818	Anestetico per la perfusione terminale
Tampone citrato (10x)	ZSGB-BIO (Pechino, Cina)	ZLI-9064	Soluzione per il recupero dell'antigene, pH 6,0
Etanolo (100%)	Reagente chimico Sinopharm (Shanghai, Cina)	100092683	Agente disidratante per istologia
Soluzione di colorazione di ematossilina	Baso Diagnostics Inc. (Zhuhai, Cina)	BA-4041	Contromacchia per IHC
Perossido di idrogeno (H2O2)	Reagente chimico Sinopharm (Shanghai, Cina)	10011218	Soluzione al 3% per bloccare la perossidasi endogena
Balsamo Neutro	Solarbio (Pechino, Cina)	G8590	Supporto di montaggio per guide
Azoto (N2)	Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, Cina)	N/A	Elevata purezza, per miscele di gas
Ossigeno (O2)	Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, Cina)	N/A	Grado medicale, per miscela di gas
Paraffina	Leica Biosystems (Nussloch, Germania)	39601006	Terreno di inclusione tissutale
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Stati Uniti)	158127	Fissativo per la perfusione e la fissazione dei tessuti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco (Waltham, MA, Stati Uniti)	70011044	10x soluzione madre, pH 7,4
Sevoflurano	AbbVie Inc. (Chicago nord, IL, Stati Uniti)	N/A	Agente anestetico per inalazione
Soda Lime	WR Grace and Co. (Columbia, MD, Stati Uniti)	22-01-0010	Assorbente CO2 per camera di inalazione
Idrossido di sodio (NaOH)	Reagente chimico Sinopharm (Shanghai, Cina)	10019818	Utilizzato per la regolazione del pH della soluzione di PFA
Saccarosio	Sangon Biotech (Shanghai, Cina)	A502693	Utilizzato per la crioprotezione del tessuto cerebrale
Xilene	Reagente chimico Sinopharm (Shanghai, Cina)	10023418	Agente schiarente per istologia
Anticorpi e kit
Anticorpo c-Fos	Abcam (Cambridge, Regno Unito)	ab190289	Coniglio anti-topo, anticorpo primario
Kit cromogeno DAB	ZSGB-BIO (Pechino, Cina)	ZLI-9018	Substrato per lo sviluppo del colore HRP
p-CREB (Ser133) Anticorpo	Tecnologia di segnalazione cellulare (Danvers, MA, USA)	9198	Coniglio anti-topo, anticorpo primario
Kit di rilevamento HRP polimerico	ZSGB-BIO (Pechino, Cina)	PV-9000	Anticorpi secondari e sistema di rilevamento per IHC
Equipaggiamento
Macchina per anestesia	RWD Life Science (Shenzhen, Cina)	R500	Per l'erogazione controllata di miscele di gas
Processatore di tessuti automatizzato	Leica Biosystems (Nussloch, Germania)	ASP6025	Per la disidratazione e lo schiarimento automatizzati
Criostato/Microtomo	Leica Biosystems (Nussloch, Germania)	CM1950	Per il sezionamento di tessuto cerebrale congelato/incorporato
Sistema di microscopio	Olympus (Tokyo, Giappone)	BX53	Per l'imaging di vetrini IHC
Pompa di perfusione	Longer Precision Pump Co. (Baoding, Cina)	BT100-2J	Pompa peristaltica per perfusione transcardica
Vaporizzatore di sevoflurano	RWD Life Science (Shenzhen, Cina)	R510CV	Per un controllo preciso della concentrazione di sevoflurano
Apparato Y-Maze	Med Associates Inc. (St. Albans, VT, Stati Uniti)	MED-VFC-S-Y	Con rete elettrica e luci per evitare attivamente
Software
Prisma GraphPad	GraphPad Software (San Diego, CA, USA)	Versione 9	Analisi statistica e visualizzazione dei dati
ImmagineJ	Istituti Nazionali di Sanità (Bethesda, MD, USA)	Versione 1.53	Software di analisi delle immagini per il conteggio delle cellule
Microsoft Excel	Microsoft Corporation (Redmond, WA, Stati Uniti)	Ufficio 365	Software per fogli di calcolo per la compilazione dei dati