Articolo metodologico

Microscopia a espansione: Imaging fluorescente ad alta risoluzione con microscopio convenzionale

DOI:

10.3791/68595

⸱

19 dicembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo dettagliato che combina metodi di criofissazione e microscopia a espansione (Cryo-ExM), permettendo immagini ad alta risoluzione con preservazione strutturale adattata a vari campioni biologici. I campioni biologici vengono congelati, incorporati in un polimero gonfiabile, denaturati, espansi e immunomarcati, permettendo l'imaging a super-risoluzione con microscopi luci standard.

Abstract

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La microscopia a espansione (ExM) è una tecnica innovativa di microscopia a fluorescenza a super-risoluzione che ingrandisce fisicamente i campioni biologici, consentendo l'imaging oltre il limite di diffrazione utilizzando sistemi convenzionali come i microscopi confocali. Incorporando i campioni in una matrice idrogel gonfiabile, l'ExM consente l'espansione isotropa del campione, migliorando la risoluzione spaziale senza richiedere attrezzature specializzate di nanoscopia. Varianti avanzate, come la Microscopia di Espansione Ultrastrutturale (U-ExM), preservano dettagli cellulari fini, inclusi organelli e assemblaggi macromolecolari.

L'osservazione di strutture cellulari specifiche o organelli dipende in modo significativo dal metodo di fissazione applicato al campione, in particolare attraverso l'uso di reticolatori chimici a base di aldeide e la precipitazione proteica con metanolo freddo. Recentemente, l'integrazione della criofissazione — una tecnica di fissazione standard d'oro — con il metodo U-ExM ha permesso osservazioni su scala nanometrica di una vasta gamma di campioni biologici, da cellule di mammiferi coltivate a organismi interi, nel loro stato quasi nativo. La microscopia a espansione è uno strumento potente per studiare strutture biologiche su scala, dagli organelli isolati a tessuti interi. Quando combinato con la criofissazione, fornisce intuizioni senza precedenti sull'architettura cellulare e sui processi dinamici, minimizzando al contempo gli artefatti associati ai metodi tradizionali di fissazione. Questi sviluppi posizionano ExM come un framework versatile per l'imaging biologico ad alta risoluzione e quasi nativo.

Il presente studio delinea un protocollo dettagliato per la criofissazione abbinata alla microscopia di espansione di campioni provenienti da varie origini. Questo protocollo evidenzia passaggi fondamentali, tra cui la fissazione del campione, la formazione del polimero, l'espansione, l'immunocolorazione e l'imaging di immagini, fornendo le indicazioni necessarie per implementare questo metodo in qualsiasi laboratorio.

Introduzione

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La microscopia svolge un ruolo fondamentale nella ricerca biologica, permettendoci di visualizzare l'ultrastruttura e l'organizzazione tra i sistemi viventi su scale senza precedenti, da organismi interi a singole molecole. Il campo della microscopia comprende due sistemi distinti: la microscopia elettronica (EM), altamente risolutiva ma con capacità limitata per la marcatura specifica, e la microscopia luminosa, che consente una visualizzazione precisa e specifica della struttura subcellulare ma con risoluzione limitata a causa del limite di diffrazione della luce. Sebbene la microscopia a fluorescenza a super-risoluzione (SRM) si sia evoluta come un metodo potente per l'imaging a fluorescenza a risoluzione subdiffractionale delle cellule, visualizzare i dettagli ultrastrutturali degli assemblaggi macromolecolari, come organismi interi, rimaneuna sfida 1. Inoltre, le tecniche SRM, che raggiungono risoluzioni che vanno da 10 a 120 nm, dipendono da microscopi avanzati e algoritmi di ricostruzione delle immagini e richiedono competenze e microscopi specializzati, limitandone l'accessibilità a molti laboratori di biologia. Un metodo emergente di super-risoluzione, la microscopia di espansione (ExM), ha superato queste limitazioni. Sviluppata nel laboratorio di Edward S. Boyden dieci anni fa, l'ExM è una tecnica innovativa di microscopia fotonica ora considerata microscopia a super-risoluzione che consente l'imaging senza la necessità di microscopispecializzati 2. Piuttosto che affidarsi a sofisticate tecnologie di imaging, l'ExM prevede l'inserimento di campioni biologici in un polimero gonfio che si espande isotropamente. Questa espansione fisica aumenta la dimensione del campione di un fattore quattro o più, migliorando la risoluzione e permettendo l'osservazione con microscopi elettrici convenzionali. Originariamente sviluppati nelle fette cerebrali, i protocolli ExM si sono evoluti per migliorare la risoluzione e semplificare le procedure. Questa tecnica è stata adattata con successo per vari campioni biologici, inclusi cellule eucariotiche, organismi unicellulari, parassiti, tessuti e organismi interi, dimostrandone laversatilità 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

Attualmente esistono due principali classi di protocolli: pre-espansione 2,16 epost-espansione 17,18, che si riferiscono al momento della colorazione del campione biologico, prima o dopo la procedura di espansione. Questo articolo si concentrerà specificamente sul protocollo post-espansione, in cui l'immunomarcatura viene effettuata dopo la denaturazione e l'espansione del campione.

In questo protocollo, i campioni biologici vengono fissati crio- o chimicamente e incubati con agenti chimici, permettendo l'ancoraggio proteico al polimero futuro. I campioni vengono poi incorporati in un polimero gonfio composto da acrilammide/bis-acrilammide (comunemente usata nei gel per elettroforesi) e acrilato di sodio (che consente l'espansione). L'aggiunta di acqua innesca l'espansione del gel, aumentando la distanza tra le proteine in proporzione all'espansione del gel. Le proteine di interesse vengono poi marcate direttamente all'interno del gel utilizzando anticorpi specifici (Figura 1).

Tutte le tecniche di imaging sopra menzionate, inclusa microscopia elettronica, microscopia fotonica, microscopia a super-risoluzione ed ExM, richiedono la fissazione biologica del campione. La fissazione basata su aldeidi crea reticolazioni incrociate tra proteine, mantenendo l'organizzazione cellulare durante i trattamenti necessari per la microscopia fotonica o elettronica. Tuttavia, la fissazione può anche portare a artefatti e cambiamenti morfologici nella cellula, che possono essere sottili nella microscopia ottica classica ma sono diventati sempre più evidenti con l'avanzamento e lo sviluppo della SRM, portando gli scienziati a riconsiderare le conseguenze dei metodidi fissazione 19. Un modo per aggirare artefatti legati alla fissazione è utilizzare la microscopia dal vivo, che consente la visualizzazione dinamica delle strutture cellulari nel loro stato quasi nativo. Tuttavia, la microscopia dal vivo presenta diversi svantaggi, in particolare la necessità di espressione dei transgeni, che può potenzialmente influenzare la fisiologia cellulare e modificare il comportamento delle proteine rispetto alle controparti endogene. Inoltre, la microscopia dal vivo offre tipicamente una risoluzione inferiore rispetto alla microscopia fissa e ha opzioni di etichettatura limitate, poiché i tag fluorescenti devono essere non tossici e stabili in condizioni di vita, limitando i marcatori disponibili. Il campo della microscopia elettronica, grazie alla sua alta risoluzione, ha contribuito notevolmente allo sviluppo di metodi ottimali per fissare strutture subcellulari o macromolecolari preservandone il stato nativo. Decenni fa, la criofissazione fu sviluppata dai laboratori Dubochet, Frank e Henderson, che prevedeva la fissazione rapida della cellula in acqua in stato vitreo e dimostrava che era l'unico approccio per preservare l'ultrastrutturanativa 20,21. Mentre le molecole purificate possono essere osservate direttamente nel ghiaccio vitreo tramite criomicroscopia elettronica, le cellule devono essere incorporate nella resina e sezionate prima dell'osservazione. Per stabilizzare ulteriormente i campioni nello stato più nativo possibile, i campioni vengono sottoposti a sostituzione per congelamento. In questo processo, quando le molecole di ghiaccio tornano allo stato liquido, vengono immediatamente sostituite dall'acetone, che ha un coefficiente di diffusione superiore rispetto all'acqua. Durante la rimozione dell'acqua, le molecole di interesse possono aggregarsi e collassare, simile a quanto avviene nella fissazione chimica da reticolazione. Per limitare questa aggregazione, la sostituzione per congelamento viene effettuata a basse temperature, riducendo l'aggregazione aumentando la viscositàintracellulare 22. Questo approccio controllato limita la formazione di grandi aggregati e preserva l'ultrastruttura cellulare più vicina al suo stato nativo.

Nel 2022, le crescenti evidenze che la fissazione chimica introduce artefatti, unite ai progressi nella microscopia a espansione, hanno portato il laboratorio Guichard/Hamel a sviluppare un metodo che integra la criofissazione con la microscopia di espansione, noto come 'Cryo-ExM'23. Questo approccio sfrutta i punti di forza di entrambe le tecniche preservando le strutture biologiche con distorsioni minime. I campioni vengono criocongelati tramite congelamento ad alta pressione o immersione manuale, entrambi che richiedono apparecchiature specializzate comunemente presenti nei laboratori di microscopia elettronica o nelle strutture di caro.

Questo articolo delinea un protocollo passo dopo passo per eseguire la criofissazione seguita da microscopia di espansione e presenta risultati rappresentativi di due modelli sperimentali: cellule coltivate umane e il parassita unicellulare Trypanosoma brucei, l'agente causante della malattia del sonno. Enfatizzeremo i miglioramenti offerti dalla criofissazione rispetto ai metodi convenzionali e evidenzieremo le insidie e gli artefatti di fissazione più comuni associati alla tecnica.

Protocollo

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NOTA: I reagenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. Questo protocollo è adattato, con modifiche minori, per l'osservazione di vari processi cellulari in diversi campioni biologici (inclusi lieviti24,25, Toxoplasma gondii26, specie animale di parentestretto 27, alghe verdi28,29, eucariotimicrobici 30, così come campioni ditopo 23 eumani 23,31,32,33). Le modifiche per adattare il protocollo a questi diversi campioni non sono menzionate in questo articolo, poiché possono essere recuperate dalle pubblicazioni originali. Qui, cellule RPE1 e Trypanosoma brucei sono utilizzate come proxy per cellule e parassiti di mammiferi. Questo protocollo enfatizza le fasi di fissazione e espansione dei campioni biologici; Pertanto, le informazioni riguardanti la coltura campionaria non sono presentate in questo articolo.

1. Preparazione della soluzione di stock

  1. Soluzione di polilisina
    1. Risospendere il poli-L o il poli-D-lisina idrobromuro (Tabella dei materiali) in acqua per ottenere una soluzione stock di polilisina a 1 mg/mL. Conservare questa soluzione di base a -20 °C e diluirla ulteriormente in acqua a 0,2 mg/mL per rivestire le coperture (Tabella 1, Tabella dei Materiali).
  2. Soluzione di ancoraggio
    1. Preparare una soluzione fresca di acrilammide/formaldeide (sotto il cappuccio chimico) mescolando 38 μL di formaldeide (36,5%-38%; Tabella dei materiali) e 50 μL di acrilammide (40%, Tabella dei materiali) in 912 μL di PBS per ottenere 1 mL di soluzione.
  3. Soluzione gelificante senza APS (iniziatore)
    1. Prepara una soluzione miscelata aggiungendo 500 μL di acrilato di sodio al 38% (19% finale), 250 μL di acrilammide al 40% (10% finale), 50 μL di bis-acrilammide al 2% (0,1% finale), 50 μL di TEMED (0,5% finale) e 100 μL di 10x PBS (1x finale). Aliquota in volume adatta a 2 gel al massimo (80-90 μL) e conserva a -20 °C per almeno 12 ore prima dell'uso (vedi Tabella 1 per la conservazione a lungo termine).
      NOTA: Si noti che il volume indicato per preparare la miscela di soluzione gelificante è calcolato per ottenere un volume finale di 1 mL, ma il volume effettivo della soluzione è di 950 μL, poiché l'APS, che rappresenta 1/20 del volume totale ciascuno, viene aggiunto spontaneamente. Il tempo di conservazione originale della soluzionegelificante 17 è stato esteso dopo che abbiamo osservato che poteva essere conservata fino a 1 mese a -20 °C senza compromettere la solidità del gel o l'efficienza di espansione.
  4. TEMED e APS
    1. APS 10% w/v: Diluire la polvere di APS in acqua, aliquota e conservare a -20 °C.
    2. TEMED 10% v/v: Diluire TEMED in acqua, aliquota e conservare a -20 °C.
  5. Acrilato di sodio (SA) 38%
    1. Prepara il 38% di SA da SA purificato (AK scientific o Sigma; Tabella dei materiali)
      1. Risospendere 38 g di acrilato di sodio in 100 mL d'acqua sotto una mescolata costante (importante). Incorporare l'acido salicolico progressivamente per evitare aggregati e mescolare durante la notte a 4 °C per garantire una risospensione completa. Assicurati che la soluzione sia traslucida e incolore o leggermente gialla. Aloqui e conservare a 4 °C fino a 1 anno.
    2. Prepara il 38% di SA dall'acido acrilico (Sigma; Tabella dei materiali)
      1. Prepara 90 mL di acrilato di sodio al 38% neutralizzando l'acido acrilico con NaOH sotto un cappuccio chimico.
      2. Mescola 29 mL d'acqua con 25 mL di acido acrilico mentre mescola.
        NOTA: Da questo passaggio, la reazione deve essere eseguita sul ghiaccio con un controllo costante di pH e temperatura, poiché la reazione è esotermica.
      3. Aggiungi 10 N NaOH goccia dopo goccia usando una pipetta Pasteur.
        NOTA: Assicurati che la temperatura non superi i 25 °C (se sì, smetti di aggiungere NaOH e aspetta che la temperatura si raffreddi).
      4. Continuare la neutralizzazione finché il pH non raggiunge 7-8 e agitare per 1 ora sul ghiaccio.
        NOTA: Se il pH improvvisamente supera 10, aggiungi acido acrilico finché il pH non scende a 7-8.
      5. Conserva la soluzione in un contenitore chiuso per tutta la notte. Se la soluzione è precipitata, centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti. Raccogli il sovrantantante, l'aliquota, e conservali a -20 °C.
  6. Soluzione di denaturazione
    1. TrisBase 1 M: Diluire 121,14 g di TrisBase in 1 litro d'acqua, regolare il pH con HCl a 9 e conservare a RT.
    2. Buffer di denaturazione: Mescolare 200 mM di Dodecile Solfato di Sodio (SDS), 200 mM NaCl, 50 mM TrisBase in acqua. Per una soluzione da 200 mL, aggiungere 10 mL di Tris-BASE 1 M (pH 9) in 124,9 mL diddH 2O, aggiungere 57,1 mL di SDS (stock 20%/700 mM) e 8 mL di NaCl (stock 5 M) durante la mescolazione. Conserva presso RT (Tabella 1).

2. Procedura di criofissaggio ed espansione

  1. Preparazione del campione e criofissazione
    NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per campioni coltivati/caricati su coperture da 12 mm. Per favore, rivedi il volume della soluzione per altri supporti.
    1. Preparazione del campione
      1. Coltivare il campione in condizioni adattate al campione biologico, direttamente su coperture da 12 mm (cellule aderenti di mammiferi) o in sospensione (T. brucei).
      2. Carica il campione sulla copertura (T. brucei) pre-rivestito con polilisina come segue: incubare brevemente coperture da 12 mm in polilisina (0,2 mg/mL) per 1 ora a 37 °C, lavare rapidamente e asciugare all'aria.
      3. Centrifuga i parassiti a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Sospensione in PBS integrata con il 10% di mezzo di coltura e carica sulle coperture 5-10 minuti prima della criofissazione.
    2. Configurazione a immersione (Figura 2A-C)
      ATTENZIONE: Lavora sotto un cappuccio chimico con guanti e camice da laboratorio quando manipoli l'acetone. Usa camice da laboratorio e occhiali protettivi ogni volta che manipoli azoto liquido ed etano liquido.
      1. Sotto un cappuccio chimico, riempi 5 mL di tubi (1 copertura/tubo) con 1 mL di acetone extra-secco usando una siringa e un ago per evitare la contaminazione dell'aria.
        NOTA: Per una migliore conservazione biologica della membrana, è necessaria l'aggiunta di paraformaldeide (PFA)/glutaraldeide (GA) (0,1/0,02%). Adatta il tubo in base al diametro del copricapo (i coperchissi > 12 mm non entrano nei tubi da 5 mL).
      2. Congelare i tubi in azoto liquido usando una griglia di plastica o metallo resistente al freddo per mantenerli in posizione verticale.
      3. Riempi metà di una scatola in polistirorene (30 cm x 30 cm spessi pareti) con ghiaccio secco.
      4. Riempi il dewar tipo Vitrobot con azoto liquido finché non smette di evaporare, e attendi 10-15 minuti per stabilizzare la temperatura. L'uso del ragno è necessario per facilitare il raffreddamento del sistema (Figura 2B, asterisco). Ricarica se necessario.
      5. Rimuovi il ragno e riempi la camera metallica di immersione con etano liquido.
      6. Aspetta 10 minuti che l'etano si equilibri.
        NOTA: Riempi il sistema di immersione con etano liquido durante l'esperimento se necessario (non usare più il ragno a questo punto). La transizione dall'etano gassoso a quello liquido è difficile. L'uso di una pressione adeguata è fondamentale per la formazione di etano liquido. L'alta pressione impedisce la formazione di liquidi tramite il costante traboccamento di gas all'interno della camera metallica, mentre la bassa pressione forma l'etano solido all'interno della camera metallica e del tubo di riempimento. Evitare la formazione di ghiaccio è essenziale per l'esperimento. Mantenere la punta di riempimento all'interfaccia liquido/aria aiuta a prevenire la formazione di etano solido.
    3. Immersione (Figura 2A-C)
      ATTENZIONE: Usa camice da laboratorio e occhiali protettivi ogni volta che manipoli azoto liquido ed etano liquido.
      1. Prendi una copertura da 12 mm con pinzette sottili.
      2. Assorbi l'eccesso di substrato con carta velina.
      3. Tieni la copertura a metà con la pinzetta con un anello di serratura adattato al crio-sturalavandini.
      4. Metti la pinzetta che tiene il copertino nel portalavandini del crio-sturalavandini. Asciuga eventuali residui di mezzo con carta Whatman.
      5. Attiva il crio-sturalavandini per immergere il coperchio nella soluzione di etano nella camera metallica.
      6. Trasferisci rapidamente il coperto nel tubo contenente acetone congelato (1 copertura/tubo).
        NOTA: Non utilizzare le stesse pinzette per la raccolta dei campioni e per l'immersione, per evitare contaminazioni con il mezzo di coltura. Fai particolare attenzione se usi copricoli > 12 mm (i coperti di 15 o 18 mm di diametro si adattano al portabagni ma potrebbero essere più difficili da immergere). Durante questo passaggio, è possibile immergere il coperto nell'azoto liquido dopo l'immersione per facilitare il trasferimento nell'Eppendorf mantenendo il campione congelato. Poiché l'acetone congela a -96 °C, è necessario posizionare le coperture su acetone congelato per la sostituzione del congelamento.
    4. Sostituzione del congelamento e reidratazione
      ATTENZIONE: Lavora sotto il cofano quando manipoli i campioni durante la sostituzione per congelamento. L'aumento della temperatura crea pressione all'interno del tubo, che può innescare un'esplosione del tubo.
      1. Incubare i tubi nel ghiaccio secco con un angolo di inclinazione (circa 45°).
      2. Agita durante la notte su un agitatore orbitale. Posiziona la scatola chiusa su uno shaker a 4 °C o RT per far salire la temperatura da -180 °C a -80 °C.
      3. Rimuovi la maggior parte del ghiaccio secco dalla scatola (lasciane solo un po' in fondo alla scatola), rilascia la pressione nei tubi aprendoli e chiudendoli rapidamente, e continua a agitare per 45 minuti sullo shaker orbitale per continuare a far salire la temperatura da -80 °C a -20 °C.
      4. Trasferire i copriversi su una piastra a 12 pozzi (o qualsiasi contenitore comodo) contenente una soluzione di etanolo puro pre-raffreddato (100%). Incubare per 5 minuti e procedere con la reidratazione graduale come segue: EtOH 100% (5 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 70% (3 min) - EtOH 50% (3 min) - EtOH 25% (3 min) - H2O 100%.
      5. Trasferisci le coperte in PBS e orientale sotto un microscopio (graffiando la superficie con una punta) per averle tutte rivolte verso l'alto.
        NOTA: EtOH 100% e 95% sono conservati a -20 °C, EtOH 70% ed EtOH 50% a 4 °C e EtOH 25% e ddH2Oa RT per continuare ad aumentare la temperatura fino a RT. Per la marcatura a membrana, l'aggiunta di PFA/GA (0,1%/0,02%) è necessaria nelle soluzioni di acetone e reidratazione, eccetto perddH2O.
  2. Espansione
    1. Ancoraggio proteico
      1. Preparare una soluzione fresca di formaldeide al 1,4% / 2% di acrilammide (FA/AA) in PBS 1x.
      2. Posiziona i coperti in una piastra di pozzetto 4/12 riempita con 0,5/1 mL di AA/FA.
      3. Incubare per 3-5 ore a 37 °C senza agitazione.
        NOTA: Il formaldeide collega gruppi amminici liberi delle proteine all'acrilammide. L'eccesso di acrilammide aiuta a limitare la reticolazione proteica normalmente indotta dalla formaldeide e ancorano le proteine al polimero di espansione futuro. Potrebbe essere necessaria un'elongazione a passo di ancoraggio delle proteine fino a un giorno all'altro a seconda del campione biologico. In ogni caso, un'incubazione più lunga non influenzerà nessuno dei passaggi successivi. Riempi i pozzi liberi con acqua o mettili in una camera umida per evitare l'evaporazione.
    2. Gelificazione
      1. Scongelamento, APS (10%) e soluzione gelificante (acrilato di sodio 19%, acrilammide 10%, bis-acrilammide 0,1%, TEMED 0,5% diluito in 10x PBS) su ghiaccio 10 minuti prima della gelificazione.
      2. Prepara una camera umida con uno strato sottile di tessuto umido e parafilm, poi conservala a 4 °C per 10 minuti.
      3. Metti la camera umida sul ghiaccio.
      4. Togli le copertine dalla soluzione di ancoraggio proteico e rimuovi l'eccesso con una carta velina (2 di fila).
      5. Aggiungi APS (concentrazione finale 0,5%) nella soluzione gelificante, vortice per 2-3 secondi e carica 2 gocce di 35 μL sul parafilm della camera umida.
      6. Copri ogni goccia con il copertino, le cellule rivolte verso la soluzione gelificante.
      7. Incubare sul ghiaccio per 5 minuti per permettere la penetrazione del gel.
      8. Incubare a 37 °C per 30-60 minuti.
    3. Denaturazione
      1. Punzelo con uno strumento per biopsia (0,4 cm di diametro, Figura 2D) e agita per 10/15 minuti in una piastra a 6 pozzi riempita con 1 mL di tampone di denaturazione finché i gel non si staccano dalle coperture.
      2. Trasferire il gel in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL riempito con un tampone di denaturazione fresco.
      3. Incubare per 1 ora e 30 a 95 °C.
      4. Trasferisci il gel su ddH2O per 10 minuti, e ripeti 3 volte per lavare correttamente il tampone di denaturazione.
      5. Misura il gel con carta millimetrica o con un calibro per valutare il fattore di espansione del gel.
      6. Trasferisci il gel a PBS per l'immunocolorazione.
      7. In alternativa, conservare i gel in PBS-azide 0,02% a 4 °C per un breve periodo (Tabella 1) o a -20°C per una conservazione più lunga (Tabella 1). Per una conservazione prolungata, i gel devono essere incubati in diversi bagni d'acqua: soluzione di glicerolo al 50% per 2-3 ore sotto agitazione e posti a -20 °C in un volume sufficiente di soluzione, che deve essere adattato alla dimensione del gel.
        NOTA: Il gel può essere mantenuto intero se preferito (Figura 2D, E) (passo 2.2.3.1). Fino a 5 punzoni (equivalenti a un gel intero) possono essere raccolte in un solo tubo (passo 2.2.3.2). La temperatura e il tempo di denaturazione devono essere rispettati (passo 2.2.3.3). Un calore elevato può causare l'apertura del tubo, portando all'evaporazione del tampone di denaturazione e/o all'espulsione del gel. Assicurati di usare tubi con chiusura di sicurezza o di coprirli. Il lavaggio del gel dopo la denaturazione deve avvenire in acqua distillata, poiché il PBS innescherà la precipitazione SDS, influenzando l'efficienza dei lavaggi. Questo passaggio innescherà una leggera espansione del gel che non avrà conseguenze sui passaggi successivi del protocollo (passo 2.2.3.4). Il glicerolo può essere diluito in PBS per risparmiare spazio nel caso di gel grandi. Per il punch da 0,4 mm, i gel sono idealmente conservati in una piastra a 12 pozzi riempita con 3 mL di acqua: glicerolo.

3. Immunocolorazione ed espansione finale

  1. Cambia il bagno PBS per altri 15 minuti di incubazione.
  2. Taglia l'intero gel in 4 pezzi uguali.
  3. Trasferire i pezzi/punzoni di gel in un portatore adattato (Figura 2D, E) e incubare con anticorpi primari diluiti in PBS-BSA al 2% per 3 ore fino a tutta la notte con agitazione (vedi Tabella 2 e Tabella 3 per condizioni dettagliate).
  4. Gel di lavaggio 3 volte con PBS+Tween 0,1% per 10 minuti di RT con agitazione.
  5. Incubare il gel in anticorpi secondari e Hoechst in PBS-BSA al 2% per 3 ore fino a tutta la notte con agitazione (vedi Tabella 2 e Tabella 3 per condizioni dettagliate).
  6. Gel per lavaggio 3 volte con PBS+Tween 0,1% per 10 minuti di RT con agitazione.
  7. Opzionale: eseguire la marcatura in pan-marca dell'intero proteoma incubando gel con NHS-ester (vedi Tabella 2 per dettagli) in PBS per 1h30 a RT sotto agitazione, poi lavare 3 volte in PBS+Tween 0,1% per 10 minuti.
  8. Trasferire il gel su un portatore adattato e procedere con l'espansione del gel per incubazione in acqua distillata (ddH2O).
    NOTA: La concentrazione e il tipo di detersivo (Tween, Triton-X100, Saponina) utilizzati per i lavaggi anticorpi possono essere adattati a campioni biologici. Sostituire l'acqua più volte è fondamentale per eliminare tracce di sali, che impediscono l'espansione completa.

4. Montaggio e imaging

  1. Il coatto copre con poli-lisina (vedi sezione 1.1) coprendo i copri-slip con circa 200 μL di polilisina, incubando 1 ora a RT e lavando 3 volte inddH 2Oper rimuovere l'eccesso di polilisina. Lascia asciugare le coperture e conservale a 4°C fino all'uso.
  2. Posizionare gel espansi su coperture non rivestite nella camera di imaging per verificare l'orientamento dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza.
  3. Una volta orientata, asciuga i gel su una carta senza pelucchi per rimuovere l'eccesso d'acqua e monta su coperture rivestite in polilisina (vedi passo 1.1 per il protocollo).
  4. Osserva i campioni con un microscopio rovesciato.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo evidenzia i risultati della combinazione della criofissazione con microscopia di espansione su due diversi tipi di campioni: cellule di mammiferi coltivate e parassiti di T. brucei . Entrambi i campioni erano o criofissi o chimicamente fissati al 4% di PFA prima dell'espansione e dell'immunocolorazione. Si noti che altre fissazioni chimiche potrebbero essere più adatte a specifici organelli (come metanolo o glutaraldeide) e che solo il PFA, una fissazione chimica comune, è stato scelto per confrontare la criofissazione per semplicità.

Le RPE1 umane (cellule epiteliali del pigmento retinico) sono state colorate per αβ-tubulina, ATP5a e Hoechst per visualizzare rispettivamente microtubuli, mitocondri e nuclei. Inoltre, i gel sono stati incubati con il fluorescente NHS-ester prima dell'espansione, un colorante che reagisce con i gruppi amminiche liberi e quindi colora l'intero proteoma cellulare. Abbiamo potuto osservare diversi vantaggi della criofissazione rispetto alla fissazione chimica, come giàdimostrato 23. La caratteristica più sorprendente era che la criofissazione preservava perfettamente la rete mitocondriale, sia visibile tramite NHS-ester sia con anticorpi specifici contro la subunità alfa della sintasi ATP (ATP5a) (Figura 3A,B). Inoltre, poiché ATP5a è localizzato nella membrana mitocondriale interna, potremmo risolvere le cristi mitocondriali tramite criofissazione (Figura 3B"). Al contrario, la fissazione del PFA non permetteva di preservare la rete mitocondriale e quindi le cristi mitocondriali non erano visibili in questa condizione (Figura 3C"). Abbiamo anche colorato i microtubuli in entrambe le condizioni e dimostrato che la criofissazione preservava meglio i microtubuli dinamici come i microtubuli citoplasmatici o astrali (Figura 3B-E). Tuttavia, microtubuli stabili come quelli nei centrioli e nelle cilli, organelli non membranosi composti da tripli/doppietti di microtubuli a 9 volte, erano conservati allo stesso modo, se non migliori, nelle cellule fissate al PFA rispetto alle cellule fissate in criofisso (Figura 3B',C'). È importante notare che la criofissazione, in quanto preservazione dell'integralità delle proteine cellulari, potrebbe essere meno applicabile a strutture molto dense come i centrioli/cilli. Questa osservazione è stata fatta anche su strutture rigide come i pori nucleari, dove la fissazione chimica innesca un lavaggio delle proteine citoplasmatiche, permettendo una migliore osservazione delle strutture dei porinucleari 23,32. Infine, abbiamo potuto dimostrare che la criofissazione aggira anche l'effetto di reticolazione della fissazione chimica, che influisce negativamente sulla capacità di espansione come mostrato sui fusi mitotici, che erano quasi 2 volte più espansi in condizioni di criofissaggio rispetto al PFA (Figura 3D,E).

Le cellule di Trypanosoma brucei sono state colorate per TDH34 (Figura 4A-D) per visualizzare il mitocondrio unico e perBiP 35 (Figura 4E,F) per evidenziare il reticolo endoplasmatico. Inoltre, i gel sono stati colorati con fluorescente NHS-ester. Come osservato nelle cellule umane, la criofissazione combinata con l'espansione preserva meglio l'architettura cellulare complessiva (Figura 4B, E), in particolare queste due strutture membranose, rispetto alla fissazione della PFA (Figura 4C, D, F). Il citoscheletro dei microtubuli di T. brucei è più rigido e stabile rispetto a quello delle cellule umane; di conseguenza, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra PFA e criofissazione. Inoltre, il limite di risoluzione della tecnica U-ExM ci impedisce di distinguere i singoli microtubuli (non mostrati).

In generale, la criofissazione affronta i limiti della fissazione chimica classica, come la conservazione degli organelli membranosi (mitocondri, reticolo endoplasmatico) e degli elementi dinamici del citoscheletro (microtubuli citoplasmatici o astrali). Inoltre, poiché la criofissazione non crea alcun collegamento incrociato tra proteine, preserva completamente la capacità di espansione, in particolare su strutture rigide e dense.

Il controllo della qualità della criofissazione e dell'espansione è essenziale per preservare l'ultrastruttura cellulare dei campioni biologici. Diversi errori possono portare a una fissazione scadente e creare artefatti all'interno dei campioni biologici. Qui evidenziiamo gli svantaggi più comuni della criofissazione e i risultati di una scarsa fissazione. L'artefatto più evidente creato dalla criofissazione è la comparsa di crepe all'interno del campione biologico (Figura 5A), comune anche nella criomicroscopia elettronica. Sebbene queste crepe non alterino l'ultra-struttura intrinseca degli organelli, come mostrato nella Figura 5A (incasto) per mitocondri e microtubuli, ciò potrebbe portare a un'errata interpretazione della rilevanza biologica di queste crepe e deve essere considerata con cautela. Non esiste una correlazione specifica tra problemi di manipolazione e l'aspetto/abbondanza di queste crepe.

Una caratteristica specifica indicativa di scarsa fissazione è la comparsa di "strutture simili a bolle" all'interno del citoplasma cellulare, indicando la presenza di cristalli di ghiaccio. Queste strutture sono particolarmente visibili con la colorazione NHS-ester (Figura 5B). Di solito sono accompagnati da una conservazione limitata degli elementi del citoscheletro, come i microtubuli ondulati (Figura 5B), e da una conservazione molto scarsa degli organelli membranosi (mitocondri nella Figura 5B). Queste caratteristiche presentano importanti problemi di fissazione, che possono essere causati da (i) volume e/o temperatura di etano inappropriati (passaggi 2.2.4-2.2.6 dal protocollo), (ii) riscaldamento non graduale del campione biologico (passaggi 2.3 e 2.4 dal protocollo) e (iii) presenza di impurità nella soluzione di sostituzione del congelamento (passo 2.2.1 dal protocollo). Immagini rappresentative di soluzioni di acrilato di sodio che evidenziano l'aspetto atteso di un 38% di acrilato di sodio utilizzabile (incolore e traslucido [1]) o leggermente giallo e traslucido [2]), o non utilizzabile per l'espansione (Giallo/arancione e torbido [3]) sono mostrate nella Figura 5C.

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Figura 1 Flusso di lavoro Cryo-ExM. (A) Le cellule viventi (cellule umane o T. brucei) vengono criofisse immergendole in etano liquido a -180 °C e incubate in acetone congelata su ghiaccio secco. La sostituzione per congelamento viene eseguita tramite un costante e lento aumento della temperatura da -180 °C a -80 °C tramite incubazione su ghiaccio secco, che innesca la liquefazione dell'acetone (-96 °C), e poi da -80 °C a -20 °C tramite incubazione senza ghiaccio secco. La reidratazione avviene tramite successive immersioni di etanolo mescolate con una concentrazione a mezzaluna di acqua distillata, insieme a un costante aumento della temperatura da -20 °C a temperatura ambiente. (B) I campioni reidratati vengono poi proceduti per l'espansione come segue: i campioni vengono incubati in una miscela di acrilammide: formaldeide (AA/FA) a 37 °C, permettendo l'ancoraggio delle proteine al polimero rigonfiabile composto da acrilammide, bis-acrilammide e acrilato di sodio (AA/BIS/SA), quest'ultimo conferendo la proprietà di espansione al gel. I campioni vengono incubati in NaCl/SDS a 95 °C per eseguire destabilizzazione delle interazioni proteina-proteina e una denaturazione delicata. Questo passaggio è essenziale per l'espansione isotropica. I campioni vengono poi immunocolorati utilizzando anticorpi primari e secondari regolari e infine espansi in acqua distillata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Criogenia e configurazione di espansione. (A) Crio-sturalavandini in posizione armata (pannello superiore) e in posizione giù (pannello inferiore). La freccia indica il pulsante PUSH per attivare la tuffata. (B) Configurazione di crio-plunging pronta per l'immersione, che mostra il livello di azoto liquido (N2) adatto alla criofissazione, indicato dall'altezza della schiuma che circonda il dewar (punta di freccia rossa). Il ragno rimovibile è indicato da asterischi. (C) Illustrazione dei passaggi chiave della criogenia dal tenere il copertura (in alto a sinistra), la posizione delle coperture nel dewar di etano liquido (in basso a sinistra) e del tubo di raccolta per la sostituzione del congelamento (destra). (D) Illustrazione del metodo del 'gel punching' per l'immunocolorazione in campioni umani. Il gel polimerizzato sulle coperture (1) viene tagliato utilizzando una specifica perforatrice per biopsia (P), formando una perforatrice in gel di 0,4 cm di diametro (2), che può essere colorata su una piastra siliconata (pannelli destra) per ridurre la quantità di anticorpi. (E) Illustrazione del metodo del 'gel cutting' per l'immunocolorazione in campioni umani e di T. brucei . I gel polimerizzati e denaturati (1) vengono tagliati in 4 pezzi uguali (2), permettendo la loro incubazione in una piastra a 12 pozzi con anticorpi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Confronto tra criofissazione e fissazione PFA nelle cellule umane. (A) Immagine del disco rotante di cellule RPE1 criofisse ed espanse colorate per αβ-tubuline (ciano), subunità mitocondriale ATP sintasi 5a (ATP5a, giallo) e NHS-ester (rosso/grigio) che mostra l'eccellente conservazione sia degli organelli a membrana sia degli elementi del citoscheletro, inclusi centrioli e ciglia (punta di freccia). Barra di scala: 10 μm. (B, C) Immagine del disco rotante di cellule RPE1 criofisse (B) e PFA fissate (C) colorate per αβ-tubuline (ciano), ATP5a mitocondriale (giallo) e Hoechst (magenta) con enfasi sul cilio primario (frecce, B', C') e mitocondri (B", C"). Se la criofissazione e la fissazione PFA preservano ugualmente i centrioli e i cili primari, la criofissazione supera di gran lunga la PFA per quanto riguarda la conservazione della struttura mitocondriale (B", C"- le punte di freccia rosse indicano cristi mitocondriali visibili solo in condizioni criofisse). Barre di scala: rispettivamente 1, 1 e 2,5 μm. (D,E) Immagine del disco rotante di cellule RPE1 criofisse (D) e PFA fissate (E) colorate per αβ-tubuline giallo/grigia), ATP5a mitocondriale (magenta) e Hoechst (blu BOP) che mostrano che la criofissazione consente una migliore espansione del fuso mitotico (punte di freccia rosse) e preserva migliori microtubuli del fuso mitotico (frecce rosse). Misurazioni della lunghezza del fuso mitotico: rispettivamente 12 μm e 7 μm per criofissazione e PFA. Barre di scala: 10 μm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Confronto tra criofissazione e fissazione PFA in Trypanosoma brucei. (A, B) Immagini confocali di cellule procicliche criofisse ed espanse di T. brucei colorate per la treonina deidrogenasi mitocondriale (TDH, giallo) e NHS-ester (rosso/grigio), mostrando l'eccellente conservazione del mitocondrio unico e l'architettura generale della cellula. Barre di scala: 5 μm. (C, D) Immagine confocale di cellule procicliche di T . brucei fissate ed espanse con PFA colorate per TDH (giallo) e NHS-ester (rosso/grigio). Confrontando la conservazione della struttura mitocondriale e la rete, la criofissazione supera la fissazione PFA. Barre di scala: 5 μm. (E, F) Immagini confocali di cellule procicliche criofisse (E) e fissate con PFA (F) e T . brucei espanse, colorate per il marcatore del reticolo endoplasmatico BiP e NHS-ester (grigio), mostrando che la criofissazione consente una migliore espansione e conservazione del reticolo endoplasmatico. Barre di scala: 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. Problemi di criofissazione. (A,B) Immagini del disco rotante di RPE1 criofisso ed espanso colorato per αβ-tubuline (ciano), subunità 5a (ATP5a, giallo) e NHS-ester (rosso) che mostrano effetti classici della criofissazione: crepe (A, frecce) e bolle (B, freccia). Sebbene le crepe non influenzino le ultrastrutture degli organelli (A), la presenza di bolle nel citoplasma (B) indica una cattiva fissazione e modifica significativamente la conservazione degli organelli subcellulari (mitocondri e microtubuli, incasti). Barre di scala: 5 μm e 2 μm (incasstati). (C) Immagine che mostra diverse soluzioni di acrilato di sodio che evidenzia l'aspetto atteso di un 38% di acrilato di sodio utilizzabile (incolore e traslucido (1) o leggermente giallo e traslucido (2), o non utilizzabile per l'espansione (Giallo/arancione e torbido (3)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Condizioni di conservazione della soluzione Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Elenco degli anticorpi Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Condizioni di immunocolorazione Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

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In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato che integra la criofissazione con la microscopia di espansione (Cryo-ExM), offrendo un approccio robusto per visualizzare i compartimenti subcellulari evitando al contempo artefatti comunemente associati alla fissazione chimica, come la distorsione strutturale e la perdita di antigeni. Preservando l'architettura cellulare in uno stato quasi nativo, Cryo-ExM elimina la necessità di un'ottimizzazione estesa della fissazione, permettendo una localizzazione proteica più accurata.

Sebbene il protocollo sia generalmente semplice, diversi passaggi critici richiedono particolare attenzione per garantire risultati positivi. La fase di criogenia è particolarmente sensibile, poiché richiede sia materiali specifici (vedi Tabella dei materiali) sia un certo livello di destrezza, soprattutto durante la gestione del riempimento liquido di etano, che rappresenta un potenziale rischio. La conoscenza preventiva delle tecniche di criofissaggio è vantaggiosa; consigliamo di consultare uno specialista crio-elettronico o un responsabile di una struttura di microscopia elettronica all'inizio dell'adozione di questo metodo. Durante la fase di espansione, è essenziale rispettare rigorosamente le condizioni di denaturazione, poiché le deviazioni possono compromettere sia la conservazione del campione sia l'efficienza dell'espansione. Infine, mantenere condizioni di conservazione adeguate per tutti i reagenti (vedi Tabella 1) è fondamentale per garantire riproducibilità e una qualità di imaging costante nel tempo.

Questo articolo evidenzia diversi vantaggi chiave del protocollo Cryo-ExM. In particolare, la criofissazione minimizza la perdita di proteine solubili, una limitazione comune dei metodi convenzionali di fissazione, e preserva meglio l'integrità della membrana, migliorando così la fedeltà dell'imaging cellulare. Un grande punto di forza di questa tecnica risiede nella sua compatibilità con i microscopi standard a campo ampio e confocali. A differenza di molti altri metodi a super-risoluzione che richiedono attrezzature specializzate e spesso costose, l'ExM può essere implementato utilizzando microscopi a fluorescenza convenzionali. Un altro vantaggio significativo di ExM è la sua versatilità. La tecnica è stata applicata con successo a un'ampia gamma di campioni biologici – dalle singole cellule ai tessuti complessi – dimostrandone l'ampia applicabilità in diversi ambiti di ricerca. Questo articolo sottolinea specificamente la compatibilità di questo protocollo con due sistemi modello molto diversi: T. brucei e cellule umane, ma si noti che un campione più grande o più complesso richiederebbe la fissazione da congelamento ad alta pressione, poiché l'immersione manuale non è sufficiente a preservare l'interocampione 24,25,30 . La microscopia a espansione ha rivoluzionato la capacità di visualizzare strutture cellulari su scala nanometrica che prima erano difficili o impossibili da risolvere, permettendo scoperte in campi come la biologia cellulare, la biologia dello sviluppo e leneuroscienze 36. In particolare, il metodo è stato trasformativo nella parassitologia, un campo in cui la microscopia elettronica convenzionale spesso non funziona. Per molti parassiti, la microscopia a espansione ultrastrutturale (U-ExM) si è dimostrata rivoluzionaria, permettendo immagini ad alta risoluzione di intricati organelli come l'apicoplasto, il conoide e gli elementi del citoscheletro con una chiarezza senzaprecedenti 6,37,38. Questi progressi dimostrano il potere dell'U-ExM nel svelare dettagli strutturali precedentemente inaccessibili, aprendo nuove strade per la scoperta in biologia cellulare, neuroscienze e biologia dei parassiti e facilitando la ricerca di potenziali bersagli terapeutici. Inoltre, ExM rimane compatibile con gli anticorpi immunofluorescenze comunemente usati, facilitandone l'integrazione nei flussi di lavoro esistenti. Nella maggior parte dei casi, gli anticorpi usati di routine per la microscopia a fluorescenza o il western blotting funzionano efficacemente su campioni espansi, eliminando la necessità di reagenti specializzati. Questa accessibilità rende Cryo-ExM un'opzione attraente per molti laboratori di ricerca biologica, offrendo immagini ad alta risoluzione senza i costi o la complessità tipicamente associati ai sistemi di imaging avanzati.

Nonostante i suoi vantaggi, ExM presenta alcune limitazioni. Un grande svantaggio è il consumo consistente di anticorpi, che può essere costoso o problematico, specialmente per gli anticorpi fatti in casa disponibili in quantità limitate. Ecco perché proponiamo questa strategia di protocollo per ridurre il volume di anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione (Figura 2D,E). Il processo di espansione aumenta anche lo spessore del campione, il che può influire sulla capacità di visualizzare strutture più profonde a causa delle limitazioni della distanza di lavoro degli obiettivi standard del microscopio. Questa limitazione può essere particolarmente difficile nello studio di campioni più grandi e spessi, dove le regioni più profonde potrebbero non essere efficacemente fotografate con microscopi convenzionali. Inoltre, l'espansione tissutale può talvolta introdurre distorsioni meccaniche, richiedendo passaggi accurati di validazione e correzione per garantire rappresentazioni spaziali accurate. Infine, l'ExM classica dipende strettamente dalla fissazione del campione, che può variare da campione biologico o struttura subcellulare da osservare. Sebbene i centrioli e le ciglia siano abbastanza stabili da poter essere espansi senza prefissazione, gli organelli cellulari richiedono diversi tipi di fissazione chimica (PFA, metanolo, glutaraldeide), che possono creare artefatti e impedire l'osservazione di più strutture cellulari insieme. Infine, poiché ExM è compatibile con varie modalità di imaging a super-risoluzione come la Structured Illumination Microscopy (SIM)39, la Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED)40, la Direct Stocastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM)41 e, più recentemente, la light-sheetmicroscopiscopy 42, l'approccio descritto in questo studio fornisce uno strumento versatile per indagare le strutture cellulari con alta precisione. Uno studio recente ha combinato la criofissazione con la microscopia di espansioneiterativa 32, spingendo ulteriormente i limiti della risoluzione preservando il più possibile lo stato naturale della cellula grazie alla criofissazione.

Consentendo a queste tecniche avanzate di imaging di catturare le cellule nel loro stato nativo, Cryo-ExM apre la strada a futuri studi su processi cellulari intricati con una chiarezza senza precedenti. Questo approccio apre anche nuove possibilità per la microscopia correlativa a luce ed elettronica (CLEM), aumentando ulteriormente il suo potenziale per l'imaging multimodale.

In conclusione, ExM rappresenta uno strumento potente per l'imaging a super-risoluzione con ampia applicabilità su vari campioni biologici. La sua compatibilità con i microscopi standard, la versatilità nei tipi di campione e l'implementazione relativamente semplice lo rendono una scelta attraente per molti laboratori. Con i continui progressi nella tecnica, ci aspettiamo ulteriori miglioramenti nella risoluzione, nell'uso degli anticorpi e nella gestione del campione che ne miglioreranno le capacità e la renderanno ancora più accessibile per un'ampia gamma di applicazioni biologiche. Cryo-ExM, in particolare, rappresenta un progresso promettente, offrendo un mezzo per studiare le strutture cellulari con dettagli eccezionali preservandone l'integrità nativa, spingendo infine i confini della microscopia moderna.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano l'assenza di conflitti di interessi

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Jennifer Vieillard per i consigli critici e la lettura del manoscritto. Riconosciamo il contributo della struttura SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL): CIQLE (membro LyMIC) per l'acquisizione delle immagini delle cellule RPE1. Ringraziamo Mónica Fernández Monreal del BIC per averci dato accesso al sturalavandini e all'etano e al Bordeaux Imaging Centre, un'unità di servizio del CNRS-INSERM e dell'Università di Bordeaux, membro dell'infrastruttura nazionale France BioImaging, per l'acquisizione delle immagini di T. brucei . Questo lavoro è stato supportato dal CNRS (T. brucei) e dall'INSERM (cellule umane) e finanziato dalle seguenti istituzioni: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 a M.B), il LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) e la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H fu sostenuto da finanziamenti ANR-OIL (ANR24-CE15-2171-01 a L.R.), L.K fu sostenuto da ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 a B.D)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Portatubi metallici da 5 mlDominique DutscherQB-E5Fase di sostituzione del congelamento
Crio-pistone manuale 620RHOSThttps://rhost-em.com/Fase di criofissazione
Acetone 99,8% AcroSealAcros Organicsgatto. n. 67-64-1 Fase di sostituzione del congelamento
Acrilamida 40% (AA)Sigma-AldrichA4058Procedura di espansione   (ancora)
Acido acrilico  Sigma-Aldrich8.00181 Procedura di espansione (polimero)
Persolfato di ammonio (APS)Thermo Fisher17874Procedura di espansione (polimero)
Perforatore per biopsiaDominique DutscherPUK-40Necessario per tagliare il gel prima della denaturazione  
BSASigma-AldrichP1379Immunocolorazione 
Camera cellulare AttofluorInvitrogenA7816Camera di imaging adattata a coperture da 24mm per l'imaging
Camera delle celleServizio di Immagino di Vita10900Camera di imaging adattata a coperture da 18mm per l'imaging
Copertine 12 mm Dominique Dutscher100040Crescita delle cellule / attacco di T. brucei
Copertine 24 mm Dominique Dutscher900547Imaging & nbsp;
Copertine 18mmVWR631-0153Imaging & nbsp;
Gaz Linde Gaz88888DENecessario per la criofissazione
Formaldeide 36.5– 38% (FA)Sigma-Aldrich  F8775Procedura di espansione   (ancora)
Glutaraldeide 25% (GA)Sigma-Aldrich  G5882Fase di sostituzione del congelamento
Glicerolo Euromedex EU3550Conservazione a lungo termine del gel & nbsp;
Azoto liquido  Linde Gaz2200975Necessario per la criofissazione (raffreddamento del sistema)
Microtube clear-lock 5 ml Dominique Dutscher390932ANecessario per la sostituzione da congelamento
Ago 18GDominique Dutscher050123BNecessario per raccogliere l'acetone
N,N-metilbisacrilammide 2% (BIS)Sigma-AldrichM1533, SIGMAProcedura di espansione (polimero)
Paraformaldeide 16% (PFA)EMSgatto. n. 15710Fase di sostituzione del congelamento
Poli-D-LisinaSigma-AldrichP1024Coperture di rivestimento per campioni / immagini  
Poli-L-LisinaSigma-AldrichP1274Coperture di rivestimento per campioni / immagini  
Ripetitore di pressione  Linde GazCPLH0SJ-LIN224Ripetitore di pressione che permette la disspugnazione dell'etano (criofissazione)
Seringe Terumo 10 mlDominique Dutscher50132Necessario per raccogliere l'acetone
Kit in elastomero in siliconeDow4001834Kit per la preparazione di piastre a pozzo silionati (immunocolorazione) & nbsp;
Acrilato di Sodio 97-99% (SA)Sigma-Aldrich408220Procedura di espansione (polimero)
AK ScientificR624Procedura di espansione (polimero)
Dodecilsolfato di sodioEuromedexEU0660Procedura di espansione (denaturazione)
Tetrametiletilendiamine (TEMED)Thermo Fisher17919Procedura di espansione (polimero)
Tubi  Thermo Scientific8060-0060Tubi per la discostazione dell'etano (criofissazione)
Preadolescente-20Euromedex1005-7Immunocolorazione 
Pinzette Dumont n° 5 FineScienceTools11255-20Manipolazione delle copertine & nbsp;

Riferimenti

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