Lattiloma basato sulla spettrometria di massa e conferma delle proteine lattilate

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza come esempio le linee cellulari del carcinoma squamoso esofageo per analizzare la lattilazione proteica. Il processo prevede l'analisi della lattilazione proteica dalla coltura cellulare fino alla conferma dei candidati, inclusa l'analisi della spettrometria di massa basata sulla lattilazione e la conferma tramite immunoprecipitazione.

Abstract

Identificata per la prima volta nel 2019, la lattilazione, una nuova modifica post-traduzionale (PTM) sui residui di lisina, si è poi dimostrata di interesse in molteplici patologie e contesti fisiologici. Possiede due isomeri (L- e D-lattilazione) ed è nota per alterare la formazione di complessi, la localizzazione cellulare o la stabilità delle proteine bersaglio. Questo protocollo descrive un metodo per analizzare la lattilazione dalla coltura cellulare fino alla conferma di potenziali bersagli lattilati, utilizzando come esempio la linea cellulare TE11 del carcinoma squamoso esofageo. Il seguente protocollo fornirà dettagli sull'identificazione delle proteine lattilate tramite immunoprecipitazione (IP) specifica di L-lattilisina (_{K L-LA}) di peptidi per analisi di spettrometria di massa (MS): (1) estrazione proteica, (2) riduzione proteica, alchilazione e digestione, (3) purificazione proteica e concentrazione di peptidi, (4) IP utilizzando perle K_L-LA e (5) concentrazione di peptidi K_L-LA . Seguendo questi passaggi, verranno effettuate analisi dei dati grezzi della SM per identificare siti lattilati, e verrà descritta la conferma di queste presunte proteine lattilate tramite IP. Con questo metodo, si possono identificare da 100 a 500 peptidi e confermare proteine lattilate di interesse. In conclusione, lo studio delle proteine lattilate ha il potenziale di migliorare la nostra comprensione della segnalazione cellulare guidata da PTM sia in condizioni normali che patologiche.

Introduzione

La lattilazione è una modifica post-traduzionale (PTM) sui residui di lisina utilizzando metaboliti derivati dalla glicolisi. L-lattil-CoA e la lattilglutatione sono substrati della L-lattilazione (K_L-LA) e della D-lattilazione (K_D-LA), ^{rispettivamente 1,2}. La L-l-lattilazione è un processo enzimatico che coinvolge enzimi come l'acetiltransferasi ^3,4. Al contrario, la D-lattilazione è un processo non enzimatico tramite sostituzione nucleofila tra latturilglutatione e un residuo^{di lisina 5}. Come processo dinamico, le deacetilasi come HDAC1-3 sono state implicate come cancellatori della^{lattilazione 6}. Dalla sua scoperta nel²⁰¹⁹³, si è dimostrata di interesse in molteplici patologie e contesti^{fisiologici 2}. Questa PTM è stata identificata per la prima volta sulle istone osservando uno spostamento di massa di 72,021 Da tramite analisi di cromatografia liquida ad alta performance (HPLC)-spettrometria di massa tandem (MS/^{MS) 3}. Da allora, la lattilazione è stata rilevata su altre proteine diverse dalle istones ed è stato dimostrato che influisce sulla diversità funzionale, la localizzazione o la stabilità delle proteine modificate a seconda del^contesto 7,8,9,10.

Considerando che i PTM sono spesso in bassa abbondanza¹¹ e fanno parte di un processo dinamico e^{transitorio 12}, è necessario l'arricchimento del PTM studiato tramite immunoprecipitazione (IP). Successivamente, la SM viene frequentemente utilizzata per descrivere il proteoma legato al PTM sui peptidi digeriti, come il fosfoproteoma o il profiling di^{ubiquitinazione 11}. Come accade per quegli altri PTM, lattiloma o peptidi lattilatili arricchiti, la proteomica basata sulla SM è il metodo standard per identificare nuovi siti di lattilazione.

Questo protocollo descrive l'identificazione di peptidi arricchiti con K_L-LA tramite proteomica basata sulla SM, seguita dalla conferma delle proteine lattilate tramite immunoprecipitazione. Utilizzando come esempio le linee cellulari del carcinoma squamoso esofageo (ESCC), descriviamo un protocollo per rimuovere le proteine lattilate per l'identificazione basata sulla SM di bersagli lattilate e la loro successiva conferma tramite IP.

Protocollo

Poiché i PTM sono un processo dinamico e transitorio, è importante prestabilire la confluenza in cui il livello totale di lattilazione è ottimale utilizzando la citometria di flusso o il Western blotting con un anticorpo anti-K_L-LA . Ad esempio, una confluenza del 70%-80% è preferibile nelle linee cellulari ESCC per esperimenti di lattiloma e IP, poiché il livello totale di lattilazione è al massimo. I reagenti e le apparecchiature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare

1. Coltivare cellule in piastre di Petri da 100 mm fino a raggiungere la confluenza richiesta, come già detto.
   NOTA: Fai crescere abbastanza cellule per ottenere tra 0,5 e 1 mg di proteine per i lattilomi o più di 2 mg per l'IP.
2. Risciacquare le cellule con 5 mL di soluzione salina pre-raffreddata 1x tamponata con fosfato (PBS).
3. Aggiungi 500 μL di PBS pre-raffreddato e raccogli le cellule usando un raschiatore per cellule. Trasferisci in un microtubo a basso legame da 1 mL.
4. Centrifugare le celle a 2.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e scartare il supernadante trasparente. I pellet cellulari possono essere conservati a -80 °C.

2. Lattiloma

NOTA: Lavora sempre con guanti per prevenire la contaminazione del campione. Usa sempre punte filtrate, microtubi a basso legame e acqua di grado MS.
NOTA: Le repliche biologiche (3-5 secondo la nostra esperienza) devono sempre essere eseguite per garantire che le modifiche identificate siano riproducibili.

1. Estrazione proteica
   NOTA: Lavora sul ghiaccio.
   1. Prepara il tampone di lisi del lattiloma (Tabella 1) e conserva a 4 °C prima dell'uso. Aggiungi inibitori della proteasi subito prima dell'uso.
   2. Estrai le proteine utilizzando il volume appropriato di tampone per la lisi.
   3. Sonicare sul ghiaccio 12 cicli di impulsi di 5 s + 5 s di spegnimento a un'intensità del 20%-25%.
   4. Centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il sovrantatore trasparente contenente le proteine in un nuovo microtubo a basso legame.
   5. Quantificare le proteine utilizzando un kit di acido bicinconinico (BCA) secondo le raccomandazioni del produttore.
      NOTA: Il kit BCA è compatibile con un massimo di 3 M di urea. Pertanto, i campioni devono essere diluiti di conseguenza.
   6. Trasferire 500 μg a 1 mg di proteine in nuovi microtubi a basso legame. Utilizzare la stessa quantità di proteine per ogni campione. Completare il volume di tutti i campioni con il tampone di lisi lattilomica fino allo stesso volume finale.
2. Riduzione, alchilazione e digestione enzimatica
   1. Aggiungere ditiotreitolo a una concentrazione finale di 5 mM. Incubare a 95 °C per 2 minuti.
   2. Incubare per 30 minuti in tempo di ritiro.
   3. Aggiungi cloroacetamide a una concentrazione finale di 7,5 mM. Incuba in RT per 20 minuti al buio.
   4. Aggiungere 3 volte il volume di campione (dal passo 2.1.6) di 1 M (NH₄)₂CO₃ per ridurre l'urea da 8 M a 2 M.
      NOTA: Se il volume totale supera la capacità dei microtubi, dividilo in due microtubi.
   5. Aggiungere 1 μg di tripsina di grado MS ogni 100 μg di proteine. Incubare durante la notte a 30 °C. Procedere con la purificazione del campione.
3. Purificazione e concentrazione dei peptidi
   NOTA: Lavoro al RT.
   1. Acidificare il campione aggiungendo acido trifluoroacetico (TFA) a una concentrazione finale dello 0,2%.
   2. Prepara le seguenti soluzioni in acqua di grado MS frescamente: 0,1% TFA, 1% acido formico (FA) e 1% FA/50% acetonitrile.
   3. Usa colonne da C18 da 100 mg per procedere con la purificazione.
      NOTA: Per utilizzare questa colonna, usa due punte di pipetta: carica la colonna con una e taglia la punta dell'altra per espellere il liquido dalla colonna. Assicurati che la colonna rimanga costantemente umida. Usa una colonna per campione.
   4. Carica la colonna con 1 mL di acetonitrile al 100%, la soluzione bagnante, ed espelli. Ripeti due volte.
   5. Bilancia la colonna caricando 1 mL di TFA allo 0,1% ed espulsi. Ripeti due volte.
   6. Carica la colonna con 1 mL del campione acidificato. Procedi con 10 cicli di carica/espulsione del campione. Ripeti se rimane un po' di campione.
   7. Lava la colonna caricando 1 mL di TFA allo 0,1% e espulsi. Ripeti due volte.
   8. Per l'eluzione, procedere con 10 cicli carica/espulsione utilizzando 750 μL di 1% FA/50% acetonitrile. Raccogliere in un nuovo microtubo a basso legame. Ripetere con ulteriori 750 μL di acetonitrile 1%/50% per un totale di 1,5 mL di peptidi purificati.
      NOTA: Identifica il microtubo sul lato invece che sul tappo per evitare di contaminare campioni mentre si perforano i fori nel tappo.
   9. Forare da 1 a 3 fori nel tappo dei microtubi con un ago per l'evaporazione.
   10. Utilizzando un concentratore a vuoto, concentra i campioni a 60 °C per tutto il tempo necessario (per campioni in volume finale di 1,5 mL, questo può richiedere almeno 4 ore). Successivamente, procedi con l'immunoprecipitazione dei peptidi.
4. Immunoprecipitazione utilizzando perle K_L-LA
   1. Prepara il buffer di lavaggio e il buffer IP del lattiloma (Tabella 2).
   2. Sul ghiaccio, aggiungere 200 μL di tampone IP ai peptidi concentrati, mescolando accuratamente su e giù fino a disciolto. Alcuni precipitati sono ancora visibili.
   3. Centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali precipitati.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, il campione può essere somministrato come passaggio di controllo utilizzando, ad esempio, uno spettrofotometro per quantificare la concentrazione peptidica a 205 nm.
   4. Lavare le perline coniugate con agarosio K_L-LA 3 volte con 200 μL di PBS 1x freddo centrifugando a 2.000 x g per 1 minuto a 4 °C e rimuovendo il sovrandante trasparente dopo ogni lavaggio.
      NOTA: Per 1 mg di proteina all'inizio di questo protocollo, utilizzare 20 μL di perle coniugate con agarosio K_L-LA , precedentemente allicitate in tubi a basso legame da 0,5 mL per un uso facile.
   5. Trasferire il sovrandanante trasparente contenente i peptidi risospesi nel microtubo da 0,5 mL contenente le sfere pre-lavate. Sigillare i tubi con pellicola di paraffina per evitare perdite.
   6. Incubare durante la notte con una rotazione dolce end-to-end a 4 °C.
      NOTA: I passaggi 2.4.7-2.4.12 vengono tutti eseguiti a 4 °C.
   7. Scarta le perle con centrifugazione a 2.000 x g per 1 minuto. Scarta il sovrantato trasparente.
   8. Aggiungi 200 μL di buffer IP di lattiloma e lava per 15 secondi invertendo il tubo. Centrifuga a 2.000 x g per 30 secondi e elimina il supernadante trasparente.
   9. Ripeti il passo 2.4.8 una volta.
   10. Aggiungi 200 μL di buffer di lavaggio e lava per 15 s invertendo il tubo. Centrifuga a 2.000 x g per 30 s e scarta il sovrandante trasparente.
   11. Ripeti il passo 2.4.10 due volte.
   12. Aggiungi 200 μL di acqua di grado MS e lava per 30 secondi invertendo il tubo. Centrifuga a 2.000 x g per 1 minuto e scartare il surnatante trasparente.
       NOTA: I passaggi rimanenti del protocollo lattiloma vengono eseguiti in RT.
   13. Eludi i peptidi legati con 100 μL di tampone di eluzione (0,1% TFA appena preparato) per 1 minuto con una rotazione dolce end-to-end a RT. Centrifuga a 2.000 x g per 2 minuti.
   14. Ripeti il passo 2.4.13 altre due volte e combina gli eluti. Procedi con la purificazione dei campioni.
5. Concentrazione e purificazione dei peptidi K_L-LA
   1. Prepara le seguenti soluzioni in acqua dolce di grado MS: 0,1% TFA, 1% FA e 1% FA/50% acetonitrile.
      NOTA: Subito prima di iniziare la purificazione, preparare la giusta quantità di soluzione in microtubi da 1,5 mL (passo 2.5.3: 300 μL di acetonitrile al 100%, passo 2.5.4: 300 μL di TFA allo 0,1%, passo 2.5.6: 300 μL di TFA allo 0,1% e passo 2.5.7: 300 μL di 1% di FA/50%).
   2. Usa punte da 100 μL di C18 per procedere con la purificazione.
      NOTA: Le punte C18 da 100 μL sono utilizzate allo stesso modo delle tradizionali punte a pipetta. Mantieni il pollice innesto e non rilascia mai lo sturalavandini tra una fase e l'altra per mantenere la colonna umida e impedire l'ingresso d'aria.
   3. Aspirare 100 μL di acetonitrile al 100%, la soluzione bagnante, e dispensare con attenzione senza espellere tutto il liquido. Ripeti due volte.
   4. Bilanciare la colonna aspirando 100 μL di 0,1% TFA e dispensare con attenzione. Ripeti due volte.
   5. Carica la colonna con 100 μL del campione di peptidi K_L-LA . Procedi con 10 cicli carica/espulsione in un nuovo microtubo a basso legame. Ripeti se rimane un po' di campione.
   6. Lava la colonna aspirando 100 μL di 0,1% TFA e dispensalo. Ripeti due volte.
   7. Procedere con 10 cicli carica/espulsione per l'eluzione utilizzando 100 μL di 1% FA/50% acetonitrile in un nuovo microtubo a basso legame. Ripeti due volte e combina gli eluati.
      NOTA: I peptidi che si legano alla punta C18 potrebbero impedire alla punta di aspirare 100 μL alla volta. Ripeti questo passaggio finché non ci sarà più liquido nel microtubo (300 μL) al passo 2.5.7.
   8. Forare da 1 a 3 fori nel tappo dei microtubi con un ago per l'evaporazione.
      NOTA: Identifica i microtubi sul lato del tubo invece che sul tappo per evitare di contaminare campioni durante la perforazione dei fori.
   9. Utilizzando un concentratore a vuoto, concentra i campioni a 60 °C per tutto il tempo necessario affinché il liquido evapori (per un volume totale di 300 μL, può richiedere almeno 2 ore).
   10. Risospendere i peptidi concentrati in 30 μL di 1% di FA.
   11. Seguendo le linee guida della tua piattaforma di spettrometria di massa, quantifica i peptidi con uno spettrofotometro a 205 nm per determinarne la concentrazione.
   12. Trasferisci in una fiala di vetro e manteni a 4 °C fino all'analisi della sclerosi multipla.

3. Analisi della SM e bioinformatica

NOTA: I campioni sono stati analizzati presso la Proteomics Core Facility dell'Università di Sherbrooke utilizzando uno spettrometro di massa (MS) (operato in modalità Data-Dependent Acquisition with Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (DDA-PASEF)).

1. Spettrometria di massa
   1. Per ogni campione, iniettare 375 ng di peptidi in un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
   2. Carica i peptidi su una colonna trappola a portata costante di 4 μL/min.
   3. Separare i peptidi su una colonna analitica C18 utilizzando un gradiente di 2 ore dal 5%-37% di acetonitrile con un FA dello 0,1% a una portata di 400 nL/min.
   4. Eseguire ionizzazione elettrospray con le seguenti impostazioni: Tensione capillare: 1500 V, Gas secco: 3,0 L/min, Temperatura secca: 180 °C, TIMS-in pressione: 2,6 mBar.
   5. Acquisire gli spettri di massa in un intervallo 100-1700 m/z usando la modalità DDA auto-MS/MS.
      NOTA: Lo strumento è impostato per rilevare stati di carica da 0 a 5+. Viene utilizzata una configurazione a doppia spettrometria di mobilità ionica intrappolata (TIMS) con un tempo di rampa di 100 ms e 10 scansioni di Accumulazione Parallela - Frammentazione Seriale (PASEF) per ciclo di acquisizione, risultando in un ciclo di lavoro di 1,17 s. L'esclusione dinamica è impostata a 0,4 min.
   6. Eseguire frammentazione utilizzando un'energia di dissociazione indotta da collisione (CID) linearmente aumentata da 20-59 eV su un intervallo di mobilità ionica di 0,6-1,6 Vs/cm².
      NOTA: L'intensità target è fissata a 20.000, con una soglia di intensità di 2.500. Viene applicato un poligono filtro standard per dare priorità ai precursori lungo la linea diagonale di scansione per peptidi carichi +2, +3 e +4 nel piano di mobilità m/z-ion.
2. Preprocessing dati: analisi MaxQuant
   NOTA: I passaggi successivi vengono eseguiti utilizzando il software MaxQuant v.2.6.7¹³ per identificare i peptidi lattilati.
   1. Nella sezione in alto a destra, clicca sulla scheda Configurazione e verifica che la lattilazione sia stata aggiunta come modifica.
   2. In caso contrario, usa il database Unimod.org¹⁴. Accedi come ospite e cerca lattilazione (accessione #2114).
   3. Clicca sul pulsante Aggiungi . In Nome, scrivi Lattilazione (K), inserisci la composizione come scritta in Unimod cliccando sul pulsante Cambia .
   4. Verifica la massa monoisotopica ottenuta. Clicca su OK.
   5. In alto a sinistra dello schermo, in blu, clicca sul pulsante Salva cambia .
   6. Nella sezione in alto a sinistra, clicca su Dati grezzi. Carica i file di dati grezzi e nominali automaticamente usando il pulsante Nessuna frazione .
   7. Imposta il numero di thread in basso a sinistra in base al numero di core accessibili sul computer.
   8. Nella scheda specifica per il gruppo , clicca su Modifiche in blu.
   9. Aggiungi Lattillazione alle modifiche delle Variabili cliccando sul pulsante freccia per aggiungere al quadrato a destra.
   10. Clicca su Quantificazione senza etichetta. Inserisci LFQ e cambia il tipo di normalizzazione in nessuno.
   11. Clicca su Digestione. Assicurati che la tripsina/P venga aggiunta al quadrato a destra.
   12. Aumentare il massimo delle scintature mancate a 4 poiché la lattilazione potrebbe influire sulla digestione della tripsina.
   13. Clicca su strumento. Cambia la tolleranza peptidica di ricerca principale a 20, considerando che la lattilazione non è una PTM comune.
   14. Nella sezione in alto a sinistra, clicca su Parametri globali. Aggiungi un file Fasta, precedentemente scaricato da Uniprot o Ensembl, per la specie corrispondente.
   15. Clicca su Regola Identificatore e Test per assicurarti che il file Fasta possa essere letto correttamente.
   16. Clicca su Quantificazione delle proteine in blu. Aggiungi la Lattilazione al quadrato a destra.
   17. Clicca su Identificazione in blu. Cambia FDR a 0.05. Assicurati che siano controllati i secondi peptidi e la corrispondenza tra le esecuzioni .
   18. Clicca su Quantificazione senza etichetta in blu. Seleziona le caselle iBAQ e Top3.
   19. Nella sezione in alto a destra, clicca su Performance.
   20. Nella sezione inferiore, clicca su Start in blu.
3. Identificazione delle proteine lattilate
   NOTA: Alla fine dell'esecuzione di MaxQuant, verranno ottenuti più file di output, come ad esempio:
   • Siti di lattilazione (K): file primario di interesse - contiene informazioni specifiche sul sito specifico sui residui di lisina lattilati in una sequenza peptidica precisa (proteina identificata, localizzazione della lattilazione in sequenza, intensità, livello di confidenza).
   • Parametri di lattilazione: contiene tutte le informazioni sulle impostazioni e soglie utilizzate durante l'analisi MaxQuant.
   • Peptidi di lattilazione: peptidi identificati modificati e non modificati.
   • Gruppi proteici di lattilazione: gruppi proteici identificati e il loro legame con la lattilazione rilevata.
   L'uso di questi file dipenderà dalla domanda di ricerca. Il passo successivo descrive come identificare un sito lattilado.
   1. Apri il file Lactylation (K)Sites in Excel.
   2. Duplicate la scheda in basso Siti di Lattilazione (K )per conservare i dati originali.
   3. Ordina da A a Z le colonne Reverse e Potenziale contaminante . Se c'è valore in alcune righe, elimina quelle righe.
   4. In questa nuova scheda, tieni solo le colonne necessarie, come: (1) Proteina:^{UniProt 14} Numero di accesso primario, (2) Posizioni all'interno delle proteine: Posizione prevista della lattilazione, importante da confermare come descritto più avanti, (3) Nomi delle proteine, (4) Nomi geni, (5) Numero di lattilazione (K rilevato sul peptide corrispondente), (6) Probabilità di lattilazione (K) (Probabilità di 1 sulla posizione della lattilazione), (7) Intensità (somma di tutte le intensità individuali appartenenti al peptide corrispondente).
   5. Completa eventuali valori mancanti, come nomi di proteine o nomi di geni.
   6. Tieni solo il primo numero di accessione nella colonna ''Proteine''. La tabella ottenuta rappresenta tutti i peptidi lattilati rilevati insieme alla proteina più probabile in cui questo peptide può essere trovato.
      NOTA: Poiché la lattilazione non è un PTM abbondante, si prevede che tra 100 e 500 peptidi vengano identificati come lattilati. Poiché i peptidi rilevati differiscono da una replica all'altra, è possibile stabilire una soglia di almeno rilevata in 2 repliche biologiche.
   7. Per confermare la posizione di un residuo modificato, utilizzare uno strumento web di allineamento come BLAST di NIH¹⁵ o Align di UniProt¹⁶ con la sequenza peptidica nella colonna ''Lattillation (K) Probabilities'' (cancellare qualsiasi probabilità) e la sequenza proteica dal database^{UniProt 17}.
      NOTA: Poiché più siti di lattilazione possono essere identificati in una singola sequenza proteica, è possibile allineare questi siti simultaneamente. Questo aiuterà anche a identificare siti duplicati che possono trovarsi su peptidi diversi ma nella stessa posizione nella sequenza proteica.
   8. L'analisi dei dati dipenderà dalla domanda di ricerca, ma è necessario considerare i passaggi di normalizzazione, centramento, scalabilità e trasformazione logaritmica prima di effettuare qualsiasi analisi statistica^{dei dati 18}.
   9. Per confermare le proteine lattilate identificate tramite analisi della SM, procedere con il protocollo di immunoprecipitazione.

4. Immunoprecipitazione (IP)

1. Estrazione proteica
   NOTA: Lavora sul ghiaccio.
   1. Prepara il tampone di lisi/lavaggio IP (Tabella 3) e conservalo a 4 °C prima dell'uso. Aggiungi gli inibitori della proteasi subito prima dell'uso.
      NOTA: Per la preparazione del campione, si può utilizzare un pellet cellulare conservato a -80 °C. Se si lavora con celle fresche, si seguono i passaggi 4.1.2 e 4.1.3. Altrimenti, risospendere il pellet cellulare nello stesso volume di lisi/buffer di lavaggio IP indicato nel passo 4.1.2 e proseguire con il passaggio 4.1.4.
   2. Aggiungi 1 mL di lisi/tampone di lavaggio IP e incuba le cellule a 4 °C per 10 minuti.
   3. Prelevare le cellule utilizzando uno raschiettore cellulare e trasferire la lisi in un microtubo da 1,5 mL.
   4. Incubare con una rotazione dolce da un capo all'altro per 30 minuti a 4 °C.
   5. Centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   6. Trasferire il sovrandanante trasparente in un nuovo microtubo da 1,5 mL.
   7. Quantifica le proteine con un kit BCA secondo il protocollo del produttore.
2. Pre-pulizia delle sfere e incubazione degli anticorpi_K-L-LA
   NOTA: Lavorare sul ghiaccio. Per ogni condizione sperimentale, preparare un tubo IP di controllo (IgG della stessa specie dell'anticorpo K_L-LA ) e un tubo per K_L-LA IP.
   1. Trasferire 1 mg di proteine in un nuovo microtubo da 1,5 mL. Completare tutti i campioni allo stesso volume finale usando lisi/tampone di lavaggio IP.
      NOTA: Questo protocollo può essere eseguito utilizzando perle magnetiche o perle di agarosio. Per i passaggi successivi sono state utilizzate perle magnetiche.
   2. Trasferire il volume necessario di sfere su un nuovo microtubo da 1,5 mL.
   3. Per pre-lavare le sfere, magnetizzare le sfere per 30 secondi o finché la soluzione non è trasparente. Scartare il sovrantagente trasparente. Lavare le perne 3 volte con 500 μL di lisi/buffer di lavaggio IP. Scartare il sovrantantante trasparente dopo ogni lavaggio. Aggiungere lo stesso volume di buffer IP del volume di perne inizialmente prelevato.
   4. Incubare i campioni proteici con 10-15 μL delle perle prelavate con una rotazione dolce da capo a capo per 20 minuti a 4 °C.
      NOTA: Per 1 mg di proteine, utilizzare 10-15 μL di sfere magnetiche. Questo passaggio minimizza il legame proteico non specifico alle sfere durante il protocollo di immunoprecipitazione.
   5. Magnetizza le sfere per 30 secondi o finché la soluzione non è limpida. Trasferisci il sovrantato trasparente in un nuovo microtubo da 1,5 mL.
   6. Aggiungere 1,5 μL di anticorpo_{anti-K L-LA}in un tubo e la corrispondente quantità di IgG in un altro tubo.
      NOTA: Per 1 mg di proteine all'inizio di questo protocollo, si usano 1,5 μg di anticorpi.
   7. Incubare i campioni con una rotazione dolce da un capo all'altro durante la notte a 4 °C.
3. Immunoprecipitazione K_L-LA
   NOTA: Lavora sul ghiaccio.
   1. Prepara il tampone di lisi/lavaggio IP (Tabella 3) e conservalo a 4 °C prima dell'uso. Aggiungi gli inibitori della proteasi subito prima dell'uso.
   2. Prelava le perline come descritto nel passo 4.2.3.
      NOTA: Per 1 mg di proteine all'inizio di questo protocollo, usa 40 μL di sfere magnetiche.
   3. Incubare i campioni con 40 μL di perle magnetiche pre-lavate con una rotazione dolce end-to-end per 4 ore a 4 °C.
   4. Magnetizza le sfere per 30 secondi o finché la soluzione non è trasparente. Raccogli il primo sovrandanante trasparente. Lava le perline 3 volte con 500 μL di lisi/tampone di lavaggio IP. Rimuovi il sovrandanante trasparente dopo ogni lavaggio.
      NOTA: Il primo soprandanante può essere quantificato e utilizzato nel western blotting (WB). È utile valutare l'efficacia dell'immunoprecipitazione.
   5. Risospendere le sfere con 20 μL di 2x Laemmli e 5% di tampone β-mercaptoetanolo.
   6. Incubare a 95 °C per 5 minuti prima di caricarlo su un gel SDS-PAGE. In alternativa, i campioni denaturati possono essere conservati a -20 °C per diverse settimane.
4. Rilevamento WB
   1. Posizionare i tubi IP sul supporto magnetico per 30 secondi prima di raccogliere il campione e caricarlo su un gel SDS-PAGE.
   2. Eseguire la WB utilizzando un anticorpo contro la proteina di interesse e/o l'anticorpo_{anti-K L-La} per confermare il pull-down delle proteine lattilate nell'albumina sirica bovina al 5% (BSA). Gli anticorpi secondari sono stati diluiti a 1:5000 nel 5% di BSA.
   3. Rilevare le bande usando il rilevamento di chemiluminescenza basato su HRP.

Risultati

Ad esempio, la linea cellulare TE11 del carcinoma squamoso esofageo è stata coltivata fino a raggiungere l'80% di confluenza. Seguendo il flusso di lavoro illustrato nella Figura 1 e l'analisi MaxQuant descritta in questo protocollo, è stato determinato il lattiloma. In quelle cellule, 137 peptidi sono stati identificati come potenzialmente lattilati, rappresentando 82 proteine uniche, poiché sono stati identificati più siti sulla stessa proteina (Figura 2A). Si noti che questo non tiene conto dei peptidi unici. Si prevede un numero compreso tra 100 e 500 peptidi identificati in quegli esperimenti nelle linee cellulari cellulari del carcinoma squamoso esofageo.

Le proteine lattilate identificate sono correlate a diversi processi biologici, come il rimodellamento della cromatina o l'assemblaggio della cromatina, che erano già stati descritti in letteratura come arricchiti in proteine lattilate (Figura 2B). Alcune delle prime proteine lattilate identificate erano istone, che si possono trovare anche in questi dati, come Histone H1.2 (Tabella 4). La lattilazione poteva essere identificata su diversi residui di lisina dalla stessa proteina. Ad esempio, due siti di lattilazione sono stati identificati sull'Histone H1.2: le lisine (K) 168 (probabilmente) e 191. Sul primo peptide (Tabella 4, riga 2), è stato osservato che il residuo K168 ha una probabilità maggiore di essere quello lattilato con 0,733 su 1, mentre K169 ha una probabilità di soli 0,267. HNRNPA1 è un buon esempio di peptide che richiederà di essere allineato per determinare il residuo modificato corretto.

Per validare la lattilazione di HNRNPA1 basandosi sui risultati del lattiloma (Tabella 4), è stato eseguito un saggio IP mirato a questa modifica post-traduzionale. Per prima cosa, per determinare quale tipo di sfera mostra l'interazione ottimale con l'anticorpo anti-K_L-LA, sono state confrontate le sfere G e le sfere A/G. Dopo aver eseguito IP con un anticorpo K_L-LA e seguito da un WB contro K_L-LA, è stato osservato un arricchimento visibile delle proteine K_L-LA , rispetto all'input, come previsto, con entrambi i tipi di sfere (Figura 3). Questi risultati dimostrano l'efficienza e la robustezza del protocollo nell'arricchimento delle proteine lattilate. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i due tipi di sfere testati. Per validare i target identificati da SM, possono quindi essere confermate IP specifiche. Ad esempio, la lattilazione di HNRNPA1, identificata da MS (Tabella 4), è stata calibrata. Una banda specifica corrispondente a HNRNPA1 è stata rilevata dopo K_L-LA IP e HNRNPA1 WB, indicando che HNRNPA1 è modificata dalla lattilazione (Figura 4). Sebbene sia le sfere G che A/G abbiano immunoprecipitato con successo la proteina bersaglio, con le sfere A/G si osserva un segnale di HNRNPA1 più intenso, suggerendo affinità o recupero aumentato.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per l'analisi del lattiloma. Abbreviazioni: IP = Immunoprecipitazione; K_L-LA = L-lattilisina; LC-MS/MS = cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi per alcune proteine ottenute per il lattiloma delle cellule TE11. (A) Numero totale di proteine e peptidi identificati. Sulla stessa proteina si possono identificare siti di lattilazione multipli. (B) I 5 processi biologici principali arricchiti per proteine lattilate nelle cellule TE11 ottenuti utilizzando il database STRING. Il valore p è stato corretto per test multipli utilizzando Benjamini-Hochberg. Il numero in ogni barra rappresenta il numero di proteine nella rete identificate come lattilate rispetto al totale di proteine in questa Ontologia Genica (GO). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immunoprecipitazione di K_L-LA utilizzando sfere G o A/G e rilevamento in WB di_{Pan-K L-LA} nelle cellule TE11. La rilevazione di Pan-K_L-LA funge da controllo cruciale per confermare l'efficacia e la specificità dell'immunoprecipitazione di questo PTM. Questo esperimento garantisce che l'IP arricchisca con successo le proteine che ospitano la modifica K_L-LA . (*) indica le catene pesanti e leggere dell'anticorpo, come chiaramente osservato in IP: corsie IgG (controllo IP) (N = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immunoprecipitazione di K_L-LA usando sfere G o A/G e rilevamento di HNRNPA1 da WB. La rilevazione di HNRNPA1 da parte di WB nelle immunoprecipitazioni specifiche K_L-LA usando sfere G o A/G ne conferma la lattilazione nelle cellule TE11 (N = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione	Concentrazione finale
Urea	8 M
Bicarbonato di ammonio	1 M
HEPES	20 mM

Tabella 1: Buffer di lisi lattilomica. Preparazione in acqua di grado MS e regolazione del pH a 8.

Soluzione - Buffer di lavaggio del lattiloma	Concentrazione finale
NaCl	100 mM
EDTA	1 mM
Tris-HCl	20 mM
Aggiungi per il buffer IP del lattiloma	Concentrazione finale
NP-40	0.5%

Tabella 2: Tampone di lavaggio lattilomica e tampone IP. Preparazione in acqua di grado MS e regolazione del pH a 8 per entrambe le soluzioni.

Soluzione	Concentrazione finale
Cloruro di sodio	100 mM
Fluoruro di sodio	50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)	50 mM
β-glicerofosfato	40 mM
EDTA (pH 8)	5 mM
Glicerolo	5%
Triton X-100	1%
Aggiungi freschezza:
Cocktail di inibitori della proteasi 100X	1X
PMSF	1 mM
Orthovanadate	0,2 mM

Tabella 3: Lisi IP/tampone di lavaggio. Deve essere priva di denaturanti, poiché possono destabilizzare la presenza delle PTM sulle proteine.

Posizioni all'interno delle proteine		Proteine	Nomi delle proteine	Nomi genici	Numero di lattilazione (K)	Probabilità di lattilazione (K)		Intensità
168		P16403	Histone H1.2	HIST1H1C	1	KPAAATVTK(0,733)K(0,267)		1.98E+04
191		P16403	Histone H1.2	HIST1H1C	1	SAAK(1)AVKPK		6.91E+04
51		A8K2U0	Proteina simile alfa-2-macroglobulina 1	A2ML1	1	VCLDLSPGYSDVK(1)		3.18E+04
5; 5; 5		C9JMM0	Omologo della proteina Chromobox 3	CBX3	1	ASNK(1)TTLQK		1.21E+05
10; 10; 10		C9JMM0	Omologo della proteina Chromobox 3	CBX3	1	TTLQK(0.828)MGK(0.172)		2.49E+05
112; 141		O76095-2	Protein JTB	JTB	2	K(0,858)ALEK(0,18)VRK(0,962)		1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245; 253; 169; 48; 100; 95; 93; 79; 23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73; 51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651	Ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1	HNRNPA1	1	SSGPYGGGGQYFAK(1)PR		6.13E+04

Tabella 4: Risultati rappresentativi per peptidi lattilati ottenuti per la linea cellulare TE11 del carcinoma squamoso esofageo. Questa tabella è ottenuta a seguito dell'analisi MaxQuant.

Discussione

Questo protocollo descrive come l'immunoprecipitazione delle proteine modificate da K_L-LA possa essere utilizzata nella SM per scoprire nuove proteine lattilate e i loro siti di lattilazione. Questo protocollo di lattiloma viene eseguito utilizzando perle coniugate, ma potrebbe essere ottenuto utilizzando l'anticorpo K_L-LA o anche l'anticorpo K_D-LA secondo la domanda di ricerca. Se si utilizza un anticorpo invece di sfere coniugate, la scelta di un anticorpo policlonale facilita la formazione di complessi più stretti poiché può legarsi a più epitopi; tuttavia, questo approccio può introdurre variabilità. Un vantaggio dell'uso delle sfere coniugate è che impediscono all'anticorpo di rilasciarela dal supporto solido - che potrebbe contaminare i campioni di SM. È anche più efficiente in termini di tempo rispetto all'uso di un anticorpo non coniugato.

Inoltre, è importante notare che la quantità di peptidi identificati in questo tipo di analisi può essere influenzata da molteplici fattori^. Innanzitutto, la specificità degli anticorpi gioca un ruolo cruciale nell'assicurare che la proteina corretta venga catturata. Aggiungere un passaggio di pre-clearing con sfere di agarosio potrebbe essere un modo per rimuovere interazioni aspecifiche. D'altra parte, non si sa se la lattilazione possa influenzare la digestione della tripsina, poiché taglia i peptidi sul lato c-terminale del residuo di arginina, ma soprattutto quello di lisina. Se ciò accadesse, potrebbe potenzialmente portare a una riduzione della copertura peptidica. Pertanto, è possibile considerare altre opzioni per le proteasi. In questo protocollo, il parametro ''Max. scissioni mancate'' viene aumentato per tenere conto di questa limitazione. Infine, dovrebbero essere considerate anche la preparazione e la manipolazione dei campioni, come l'uso di guanti per prevenire la contaminazione dei campioni con cheratina dalla pelle, o la stabilità delle modifiche, poiché il turnover PTM è un processo dinamico e talvolta^{rapido 6}.

Contrariamente all'approccio più ampio della SM che ha portato a una bassa rilevazione di PTM a bassa abbondanza, come la lattilazione, l'identificazione dei peptidi_L-LA arricchiti da K tramite proteomica basata sulla SM consente un'analisi dettagliata dei siti PTM, come l'identificazione dei siti di lattilazione e delle proteine lattilate¹⁹ di nuova caratterizzazione. Western blot può fornire informazioni sul modello generale di lattilazione presente nelle cellule, ma non può informare sulla lattilazione specifica della proteina. Pertanto, l'IP è l'approccio comunemente utilizzato per confermare la PTM²⁰ rilevata da SM. Il saggio di legazione di prossimità (PLA) è un'altra tecnica che può essere utilizzata per confermare la lattilazione di potenziali bersagli identificati dalla^{proteomica 21}. Questa tecnica può anche indicare la localizzazione delle proteine modificate, ma ha una specificità inferiore. L'uso di un approccio IP specifico per la lattilazione è appropriato per uno screening PTM ampio, ma potrebbe essere interessante effettuare IP specifica per proteine a seconda della domanda di ricerca in esame.

Quando si quantifica la proporzione di una specifica proteina lattilata in un estratto proteico totale, eseguire una IP da sola non è sufficiente. Sebbene l'IP usando perle K_L-LA permetta la cattura di proteine lattilate, non quantifica accuratamente la proporzione di lattilazione, poiché è limitata a proteine bersaglio arricchente. Pertanto, è necessaria la spettrometria di massa, fornendo un'analisi più dettagliata che consente una misurazione quantitativa precisa della lattilazione. Pertanto, eseguire IP di una proteina potenzialmente lattilata utilizzando un anticorpo contro quella proteina, seguito da un'analisi di spettrometria di massa, potrebbe determinare la percentuale di proteine lattilate in un campione proteico totale, mentre eseguire IP è un approccio efficiente per confermare la lattilazione delle proteine identificate come lattilate dalla SM.

In un IP che utilizza anticorpi non coniugati, ottimizzare il rapporto perla-anticorpi è essenziale per garantire una cattura ottimale delle proteine lattilate. In effetti, l'equilibrio tra questi due componenti influisce direttamente sulla specificità e l'efficienza della IP. Un eccesso di anticorpi può portare a un legame aspecifico, che aumenta il rumore di fondo e riduce la precisione complessiva del rilevamento. Al contrario, il contrario può portare a un arricchimento inefficiente delle proteine bersaglio, con segnali più deboli e una sensibilità ridotta. Queste considerazioni tecniche sono fondamentali per ottenere risultati affidabili e precisi nello studio delle proteine lattilate.

Per concludere, questo protocollo può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nei profili di lattilazione dopo la deregolazione dell'omeostasi, come il^{cancro 8,10}, che potrebbero influenzare la risposta correlata ai farmaci. L'identificazione di biomarcatori potrebbe persino essere ottenuta utilizzando questo metodo. Applicabile a più linee cellulari, tipi di tessuto e persino biopsie di pazienti, questa tecnica ha il potenziale per approfondire la comprensione della segnalazione cellulare guidata da PTM in condizioni di malattia o normali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Punta Zip 100 uL C18	Pierce	87784
Acclamazione PepMap100 C18	Dionex Corporation	164946	0,3mm di identificazione x 5mm
Acetonitrile (grado MS)	Fisher	A955-4
Bicarbonato di ammonio	Sigma-Aldrich	A6141-500
Anticorpo monoclonale anti-HNRNPA1	Novus Biologicals	NB100-672
Anticorpo monoclonale anti-L-L-Lattisilisina (KL-La)	PTM-Bio	PTM1401RM
Anti-IgG del topo, anticorpo legato all'HRP	CST	7076S
Anti-coniglio IgG, anticorpo legato all'HRP	CST	7074S
Azure 280	Biosistemi	AZI280-01
Kit BCA	Thermo Fisher Scientific	P123227
Albumina Sirica di Bovin (BSA)	Wisent	800-095-EG
Sorgente nanoESI di Captive Spray	Bruker Daltonics
Cloroacetamide	Sigma-Aldrich	C0267
Substrato ECL occidentale Clarity Max	Bio-Rad	1705062
Ditiotreitolo (DTT)	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dynabeads Proteina G perline per immunoprecipitazione	Thermo Fisher Scientific	10004D
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Acido formico (FA; Grado MS)	Thermo Fisher Scientific	A117-50
Glicerolo	Fisher Scientific	BP229-1
HEPES (1M)	Wisent	330-050-EL
Colonna Hypersep C18 100mg	Fisher	60108-302
Perle coniugate di agarosio KL-LA	PTM-Bio	PTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromofenolo)	Wisent, J.T. Baker	800-100-CG, D293-01
Microtubo a basso legame 0,5 mL	Sarstedt	72.704.600
Microtubo a basso legame 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	P190410
Microtubo 1,7 mL	Assigeno	MCT-175-C
Sistema HPLC NanoElute	Bruker Daltonics		Dimensione particella di 1,9um, 75um di identità x 25cm
Anticorpo policlonale IgG di Rabbit Normal	Millipore Sigma	12-370
PepSep	Bruker Daltonics	1811112
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Wisent	311-425-CL
PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Cocktail di inibitori della proteasi (PIC)	Sigma-Aldrich	P8340-5
Particelle magnetiche Sera-Mag SpeedBeads Proteina A/G	Thermo Fisher Scientific	09-981-920
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S9888-500
Fluoruro di sodio	Sigma-Aldrich	S1504
Ortovanadato di sodio	Sigma-Aldrich	S6508
TimsTOF pro spettrometro di massa	Bruker Daltonics
Acido trifluoroacetico (TFA)	Thermo Fisher Scientific	A116-50
Tris-HCl	Wisent	600-125-IK
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Tripsina (grado MS)	Pierce	90058
Urea	Thermo Fisher Scientific	U15-500
Vaccufuge plus	Eppendorf	22820168
Acqua (grado MS)	VWR	10803-890A
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G5422
β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148