Questo video mostra le tecniche per l'etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging ottico (OI) è uno strumento facile, veloce ed economico per il monitoraggio in vivo di nuove terapie basate sulle cellule staminali. La tecnica si basa sulla etichettatura ex vivo di cellule staminali con un colorante fluorescente, a seguito di iniezione endovenosa di cellule etichettate e la visualizzazione dei loro accumulo in organi bersaglio specifici o patologie. La tecnica è una dimostrazione il modo in cui l'etichetta cellule staminali mesenchimali (hMSC) semplice da incubazione con il colorante fluorescente lipofili DiD (C67H103CIN2O3S) e come etichetta cellule staminali embrionali umane (hESC) con la FDA ha approvato colorante fluorescente verde indocianina (ICG). Il meccanismo di assorbimento è attraverso l'aderenza e la diffusione del colorante lypophilic attraverso il doppio strato di fosfolipidi di membrana delle cellule. L'efficienza di etichettatura di solito è migliorata se le cellule sono incubate con il colorante nel siero privo di mezzi di comunicazione invece di incubazione nel siero contenenti media. Inoltre, l'aggiunta del solfato di protamina trasfezione agente migliora sensibilmente l'assorbimento agente di contrasto.
Protocollo
Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali con il colorante fluorescente DiD
- Per iniziare la procedura per l'etichettatura di cellule staminali mesenchimali, trypsinize e contare le cellule per ottenere una sospensione con un numero definito di cellule.
- Prendete le cellule fuori dell'incubatore ed aspirare i vecchi media dai recipienti contenenti le cellule da etichettare
- Lavare le cellule con 10 ml di Mg / Ca-free PBS. Aspirare il PBS. La Mg e Ca inibirebbe la tripsina, quindi usiamo PBS senza questi.
- Aggiungi preriscaldata tripsina 0,05%, per un pallone T75 si usa 5ml. Garantire che l'intera superficie del....
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Discussione
OI è una relativamente nuova tecnica di imaging, basato sul rilevamento di fluorescenza. OI è sensibile come radiofarmaco a base di tecniche di imaging, ma non associato ad alcuna esposizione irradiazione. OI fornisce un mezzo efficace di cellule monitoraggio non invasivo e ripetitivo, quindi permettono di approfondire la migrazione delle cellule al sito di destinazione. Una limitazione importante di questa tecnica è la penetrazione nei tessuti limitato di sonde fluorescenti in vivo. Così, un accumulo di tracciante nei tessuti profondi, più.......
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Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto da una borsa SEED J. Leon Thal del California Institute per la Medicina Rigenerativa. Tobias Henning è stato finanziato da una borsa di studio di ricerca dal tedesco Research Association (DFG, SE 4578/1-2). Vogliamo riconoscere con gratitudine Meneses Juanito per i suoi consigli sulla cultura di cellule staminali embrionali umane.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Indocianina verde (IR-125) | Reagente | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagente | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM ad alto contenuto di glucosio | Reagente | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatina | Reagente | Sigma-Aldrich | G1890 | Diluire alla concentrazione finale dello 0,1% in PBS |
| PBS, privo di Mg e Ca | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Reagente | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% | Reagente | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, caratterizzato | Reagente | Hyclone | SH30071.03 | |
| Setaccio per cellule (40 μm in nylon) | Reagente | BD Biosciences | 352340 | |
| DiD | Reagente | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Sostituto del siero Knockout | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–etanolo | Reagente | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| Aminoacidi non essenziali | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagente | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutammina 200 mM | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillina/Streptomicina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Solfato di protamina | Reagente | American Pharmaceutical Partners |
Riferimenti
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. ....
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Ristampe e permessi
