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Articolo metodologico

Istituzione di un sistema di allevamento per il controllo della virulenza dei funghi entomopatogeni (Scirtothrips dorsalis hood)

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⸱

DOI:

10.3791/68600

⸱

18 luglio 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

In questo articolo

Sommario

È stato stabilito un protocollo di biodosaggio a foglia staccata per l'allevamento di massa dei tripidi del peperoncino utilizzando un metodo modificato a foglia staccata in contenitori di vetro contenenti agar, garantendo un'elevata sopravvivenza e uno sviluppo sincronizzato. Questo sistema consente uno screening efficiente della virulenza dei funghi entomopatogeni contro le larve di 2° stadio e fornisce un'alimentazione affidabile di tripidi per valutazioni di laboratorio, in serra e sul campo.

Abstract

Il tripide del peperoncino (Scirtothrips dorsalis Hood) è un parassita economicamente significativo delle colture ornamentali e alimentari a Taiwan. I funghi entomopatogeni (EPF) funzionano come agenti di controllo biologico ecologico per la gestione dei tripidi. È fondamentale esaminare la virulenza degli isolati di EPF contro i tripidi del peperoncino in condizioni di laboratorio prima dell'applicazione sul campo. Tuttavia, i dati limitati sul metodo di allevamento dei tripidi del peperoncino pongono sfide per lo screening di laboratorio su larga scala. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato un metodo di allevamento in laboratorio modificato per la produzione di massa di S. dorsalis.

Il metodo utilizza un sistema di allevamento a foglia staccata utilizzando un contenitore di vetro contenente agar adatto per valutare l'EPF contro i tripidi del peperoncino. Questo sistema di biodosaggio ottimizzato a foglia staccata è adatto per valutare l'efficacia dell'EPF contro i tripidi del peperoncino. Il sistema ha la capacità di produrre un gran numero di tripidi allo stesso stadio di sviluppo per lo screening della virulenza. Secondo il test, il risultato ha mostrato che l'isolato di Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213) ha mostrato la più alta virulenza (53,6%) contro le larve di tripidi del peperoncino al secondo stadio a 7 giorni dall'inoculazione (d.p.i.). Inoltre, i dischi fogliari incorporati nell'agar sono rimasti freschi per oltre 7 giorni, consentendo ai tripidi di sopravvivere (tasso di sopravvivenza del 90% del trattamento di controllo) per tutto il periodo di osservazione, indicando la stabilità del sistema di allevamento. Questo protocollo dimostra un sistema di allevamento stabile per la produzione di massa e per la valutazione della virulenza degli isolati di EPF contro i tripidi del peperoncino e che potrebbe avere utilità per altri tripidi, consentendo lo screening di potenziali isolati di EPF per il controllo dei tripidi sul campo.

Introduzione

I tripidi del peperoncino (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) è un parassita polifago che infesta oltre 100 specie di piante in 40 diverse famiglie di piante, tra cui ortaggi e colture ornamentali e frutticole1. È originario dell'Asia tropicale e subtropicale-sud-est asiatico, dell'India, del Giappone e di Taiwan2. Per quanto ne sappiamo, il tripide del peperoncino è il parassita delle colture agricole e ornamentali, tra cui mango, tè, mirtillo e loto a Taiwan. Negli ultimi due decenni, il peperoncino tripide è diventato un significativo parassita economico in diversi paesi a causa dell'aumento della globalizzazione e del commercio agricolo aperto. Inoltre, l'elevato potenziale riproduttivo e l'adattabilità alle aree appena invase hanno contribuito alla diffusione di questo parassita 1,3.

Il tripide del peperoncino si nutre principalmente di fogliame giovane, germogli, petali di fiori e frutti immaturi, portando alla necrosi e alla morte dei tessuti3. Inoltre, fungono da vettore per varie malattie delle piante, tra cui il virus della necrosi delle gemme di arachidi (GBNV), il virus della macchia clorotica delle arachidi (GCFSV), il virus della macchia gialla delle arachidi (GYSV)4 e il virus della striatura del tabacco (TSV)5. Di conseguenza, l'alimentazione con tripidi del peperoncino può ridurre significativamente la resa e il valore delle colture colpite. Una gestione efficace dei tripidi del peperoncino si basa su un piano di gestione integrata dei parassiti che utilizza strategie di controllo culturale, biologico e chimico1. A Taiwan, gli agricoltori biologici utilizzano comunemente materiali non chimici, come l'olio a gamma ristretta e l'olio di neem, o metodi di controllo biologico, tra cui l'uso di acari predatori e minuscole cimici pirata (mediante osservazione personale). Tuttavia, in base al feedback degli agricoltori, l'applicazione di questi oli durante la fioritura e la fruttificazione può interferire con l'impollinazione e danneggiare il polline, portando a una riduzione della resa e del valore economico. Pertanto, lo sviluppo di efficaci misure di controllo alternative per i tripidi del peperoncino è fondamentale per gli agricoltori biologici.

I funghi entomopatogeni (EPF) sono un gruppo di funghi insetticidi che hanno dimostrato di essere una tecnica di gestione dei parassiti efficace e sostenibile 6,7,8. Diversi studi hanno dimostrato l'efficacia dell'EPF contro i tripidi del peperoncino. Gli EPF commerciali, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) e Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), hanno mostrato un controllo significativo dei tripidi del peperoncino sulle piante di rosa 9,10. Le popolazioni di tripidi di peperoncino sulle piante di peperone possono anche essere ridotte da Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11. Altri EPF, come Lecanicillium lecanii e Purpureocillium lilacinum, sono stati testati contro i tripidi del peperoncino in diverse colture, tra cui piante di peperoncino e tè, e si sono dimostrati efficaci nel controllo di questo parassita12,13.

Alcuni studi precedenti che indagavano l'efficacia degli EPF per il controllo dei tripidi in serra o sul campo sono stati condotti senza prima effettuare uno screening per le specie/ceppi di EPF più efficaci, limitandone l'efficacia. Un attento screening degli EPF può migliorare notevolmente la gestione dei parassiti. Molti studi hanno allevato tripidi per saggi biologici su piante intatte all'interno di gabbie11,14. Sebbene un sistema di allevamento delle piante intatto offra un ambiente più naturale per i tripidi, pone sfide nella gestione delle diverse fasi di sviluppo, poiché i tripidi mostrano comportamenti distinti in ogni fase. Questa variabilità può complicare la selezione di stadi mirati per specifici scopi sperimentali. Inoltre, le condizioni del suolo all'interno del sistema di allevamento delle piante intatte possono influenzare l'impupamento e l'eclosione dei tripidi del peperoncino, riducendo così il numero di individui disponibili per i successivi saggi biologici15, limitando le risorse per ulteriori saggi biologici. Inoltre, i sistemi di allevamento dell'intera pianta richiedono più spazio e cure continue per le piante, poiché le piante stressate possono alterare il comportamento dei tripidi e possono richiedere più tempo e risorse. Ci sono poche segnalazioni di sistemi di allevamento di tripidi basati su materiale vegetale non vivente (ad esempio, tessuto vegetale staccato o diete artificiali) per esperimenti di bioanalisi di laboratorio, ma i dettagli di questi metodi erano spesso poco chiari o omessi12,16.

Questo studio mirava a sviluppare un sistema di allevamento di massa semplice, economico e sostenibile di tripidi di peperoncino in condizioni di laboratorio. In questo protocollo, un metodo di allevamento a disco fogliare7 è stato modificato per offrire un approccio più efficiente e controllato per i tripidi di allevamento di massa, consentendo una selezione precisa delle fasi di sviluppo per i saggi biologici attraverso uno stretto controllo delle condizioni ambientali. Inoltre, è stato sviluppato un sistema di biodosaggio stabile e riproducibile per valutare la virulenza degli isolati di funghi entomopatogeni (EPF) con il 50% di tempo letale (LT50) e il 50% di concentrazione letale mediana (LC50), che si riferiscono al tempo stimato con un dosaggio specifico, e alla concentrazione di sospensione fungina necessaria per causare il 50% di mortalità dei tripidi del peperoncino, rispettivamente. Attraverso l'applicazione di questo metodo, i tripidi raccolti sul campo possono essere identificati correttamente e le colonie stabili di tripidi di laboratorio possono essere mantenute per testare l'efficacia di diversi isolati fungini utilizzando una metodologia più semplice e riproducibile.

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Protocollo

NOTA: Il diagramma di flusso sperimentale completo è mostrato nella Figura 1.

1. Raccolta in campo dei tripidi al peperoncino e manutenzione delle colonie

  1. Raccolta di tripidi al peperoncino
    1. Esamina visivamente entrambi i lati delle foglie e all'interno dei fiori per l'infestazione di tripidi di peperoncino sulle piante di mirtilli in una fattoria di mirtilli colpita.
    2. Registrare i dettagli di ogni campione (ad esempio, parte della pianta e gravità dell'infestazione) e confermare le pratiche di produzione con gli agricoltori, come l'agricoltura convenzionale o l'agricoltura biologica, compresa l'applicazione di olio minerale e nemici naturali.
    3. Taglia le foglie e i fiori infestati da tripidi al peperoncino e trasferiscili nel sacchetto di plastica con cerniera (Tabella dei materiali), quindi sigilla il sacchetto con cerniera con un po' d'aria all'interno per mantenere in vita i tripidi. Portare il campione in laboratorio entro 3 ore.
      NOTA: Mettere il campione in un frigorifero quando il tempo di raccolta sul campo è superiore a 3 ore.
    4. Preparare un contenitore di cottura in vetro (35 mm di altezza, 45 mm di diametro interno), posizionare tre strati di carta assorbente circolare (diametro 40 mm) sul fondo del contenitore di cottura in vetro, quindi aggiungere 8-10 gocce (400-500 μL) di acqua filtrata (Figura 1 e Tabella dei materiali).
    5. Raccogli una giovane foglia di mango rossa dai campi di mango (Figura 1). Lavare la foglia e controllare al microscopio ottico (Tabella dei materiali) la presenza di uova di insetti o altre contaminazioni di insetti prima di preparare il contenitore di allevamento in vetro. Tagliare la foglia di mango con un tagliapasta per pelle (Tabella dei materiali) in un disco circolare (40 mm) e posizionarla sulla carta assorbente bagnata.
      NOTA: Le foglie di mango sono risorse più stabili per l'alimentazione dei tripidi rispetto alle giovani foglie di mirtillo, che crescono solo stagionalmente.
    6. Osserva i tripidi del peperoncino al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x e trasferisci 10 tripidi adulti (cinque maschi e cinque femmine) usando un pennello da pittura fine (Tabella dei materiali) nel contenitore di vetro.
    7. Sigillare ogni contenitore di vetro con due strati di parafilm (Tabella dei materiali) e praticare circa 40 piccoli fori utilizzando un perno per insetti #00 per la ventilazione (Tabella dei materiali).
    8. Conservare il contenitore di lievitazione in vetro in un'incubatrice a 25 ± 1 °C, ~70% di umidità relativa con un fotoperiodo di luce:buio (L:D) = 12 h: 12 h (Tabella dei materiali).
    9. Rimuovere gli adulti con un pennello dopo 48 ore.
      NOTA: Sulla base della nostra osservazione, le femmine di tripidi deporranno le uova ~2 giorni dopo essere state trasferite nel contenitore di allevamento in vetro.
    10. Osservare i tessuti fogliari con le uova sotto uno stereomicroscopio per confermare ulteriormente l'ovideposizione (Figura 1 e Tabella dei materiali). Metti un disco di foglie di mango fresco sulla foglia con le uova e aggiungi 8-10 gocce di acqua filtrata sul tovagliolo di carta per mantenere l'umidità.
  2. Mantenimento della popolazione di tripidi del peperoncino
    NOTA: Le uova si schiudono in larve di 1° stadio dopo ~ 5-7 giorni.
    1. Trasferire direttamente la foglia contenente 1larva di stadio in un nuovo contenitore di vetro.
      NOTA: Usando un pennello, trasferire delicatamente 1° larva di stadio in un nuovo contenitore di vetro, evitando la contaminazione dalla crescita fungina marcia e inaspettata sulle foglie di mango. Sulla base della nostra osservazione, una femmina adulta depone in media 6 uova al giorno.
    2. Osserva i tripidi del peperoncino ogni giorno. Aggiungere 8-10 gocce di acqua filtrata ogni 4 giorni al tovagliolo di carta. Aggiungi un disco di foglie di mango fresche all'interno del contenitore ogni 4 giorni, prima che la foglia vecchia si asciughi.
      NOTA: Le larve del1° stadio emergono negli adulti in ~7-10 giorni, a seconda dei fattori ambientali come la temperatura e l'umidità.
    3. Osservare quotidianamente la popolazione di tripidi del peperoncino fino a quando i tripidi non si sviluppano in adulti e ripetere i passaggi dal passaggio 1.1.4 per il mantenimento della popolazione a lungo termine.
  3. Allevamento in massa di tripidi di peperoncino
    1. Raccogli le femmine adulte dalla popolazione mantenuta e prepara un contenitore di vetro per l'allevamento in base ai passaggi precedenti.
    2. Trasferisci 10 femmine adulte nel contenitore e segui i passaggi dai passaggi da 1.1.4 a 1.1.10 per ottenere una foglia con le uova.
      NOTA: Una femmina adulta depone in media 6 uova al giorno.
    3. Trasferisci delicatamente ~120 larve di 1° stadio in un nuovo contenitore di vetro per l'allevamento usando un pennello.
    4. Osserva i tripidi del peperoncino ogni giorno. Aggiungere 8-10 gocce di acqua filtrata sul tovagliolo di carta ogni 4 giorni. Aggiungi un disco di foglie di mango fresche nel contenitore ogni 4 giorni prima che la foglia vecchia si asciughi.
    5. Raccogliere 1° larva di stadio a 5-7 giorni dopo la deposizione delle uova; raccogliere le larve del 2° stadio dopo 7-10 giorni; raccogliere gli adulti dopo ~14 giorni per il biotest (Figura 2).
      NOTA: Osservare la morfologia per distinguere i diversi stadi dei tripidi del peperoncino per ulteriori esperimenti (Figura 2).

2. Identificazione molecolare dei tripidi del peperoncino

NOTA: I tripidi raccolti sul campo devono essere identificati a livello di specie mediante identificazione molecolare utilizzando un frammento del gene della citocromo ossidasi I (COI) mitocondriale, un marcatore comunemente usato per i tripidi del peperoncino17,18.

  1. Estrazione del DNA genomico dei tripidi del peperoncino
    1. Raccogliere un tripide di peperoncino adulto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml (Tabella dei materiali).
    2. Omogeneizzare i tripidi del peperoncino utilizzando un pestello a pellet, quindi isolare il DNA genomico utilizzando il kit commerciale secondo il protocollo del produttore (Tabella dei materiali).
  2. Amplificazione PCR e sequenziamento del DNA
    1. Amplificare il frammento di DNA dei tripidi del peperoncino utilizzando PCR Master Mix (2x) con una coppia di primer COI, il primer diretto LCO 1490 e il primer inverso HCO 2198, che amplifica il gene COI mitocondriale parziale (Table of Materials).
      1. Preparare una miscela PCR da 20 μl contenente 2 μl di stampo di DNA genomico tripip, 1 μl di primer diretti e inversi, 10 μl di 2x PCR Master Mix e 6 μl di ddH2O (Tabella dei materiali).
      2. Eseguire la PCR con un termociclatore con le seguenti condizioni di ciclo: denaturazione iniziale a 94 °C per 2 min, 35 cicli di 94 °C per 30 s, 52 °C per 1 min, 72 °C per 1 min, seguita da un'estensione finale di 72 °C per 10 min (Tabella dei materiali).
    2. Controllare l'amplicone PCR mediante elettroforesi in un gel di agarosio all'1% per verificare il risultato dell'amplificazione (Figura 3).
    3. Asportare la banda target (la dimensione prevista dell'amplicone era di 658 bp) e purificare l'amplicone COI PCR dai tripidi del peperoncino utilizzando un kit di purificazione Gel/PCR secondo il protocollo del produttore. Inviare il prodotto purificato per il sequenziamento attraverso un servizio di sequenziamento commerciale. (Tabella dei materiali).
  3. Analisi delle sequenze
    1. Valutare la qualità della sequenza utilizzando il software di riferimento (Tabella dei materiali).
    2. Aprendo il file FASTA o TXT e tagliando manualmente le basi di bassa qualità sia alle estremità 5' che 3' eliminando le sequenze indesiderate.
    3. Eseguire una ricerca BLAST sul database NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizzando i parametri predefiniti per confermare l'identità della specie.

3. Preparazione di funghi entomopatogeni

NOTA: Gli isolati EPF utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.

  1. Recupero di isolati fungini da una libreria di risorse fungine
    1. Scongelare il brodo di conidi fungini conservato (conidi sospesi in glicerina al 30%) da un congelatore a -80 °C.
    2. Trasferire circa 10 μl della sospensione di conidi e distribuirla uniformemente su una piastra di agar destrosio Sabouraud (SDA) da 5,5 cm 1/4 utilizzando uno spandiconcime cellulare in una cappa a flusso laminare. Il terreno viene preparato mescolando 0,75 g di brodo di destrosio Sabouraud e 1,5 g di agar agar in 100 ml di acqua bidistillata (ddH2O) (Tabella dei materiali).
    3. Sigillare la capsula di Petri con parafilm (Table of Materials) e trasferire la piastra nell'incubatrice al buio a 25 °C per 10-14 giorni.
    4. Sottocoltivare il micelio fungino in crescita attiva facendo scorrere su una piastra fresca di agar destrosio Sabouraud (SDA) da 1/4. Incubare i funghi al buio a 25 °C per 10-14 giorni per consentire lo sviluppo dei conidi prima del raccolto.
      NOTA: Utilizzare colture fungine di circa 10 giorni per i successivi test biologici. Le colture più vecchie di 14 giorni non sono raccomandate per i test di virulenza a causa delle potenziali riduzioni della vitalità dei conidi.
  2. Preparazione della sospensione di conidi
    1. Aggiungere 2-3 mL di Tween 80 allo 0,03% sulla superficie di una coltura fungina di 10-14 giorni su 1/4 di SDA. Raschiare delicatamente i conidi utilizzando un anello sterile (Tabella dei materiali).
    2. Trasferire la sospensione fungina in una provetta da centrifuga pulita da 15 mL.
    3. Omogeneizzare la sospensione mediante vortice alla massima velocità e filtrarla attraverso carta da filtro per rimuovere i detriti ifali e ottenere una sospensione di conidi puri.
    4. Utilizzare un emocitometro (Tabella dei materiali) per controllare il numero di conidi al microscopio ottico e diluire la sospensione a 108 conidi/mL.
    5. Trasferire la sospensione di conidi in un micro-spruzzatore sterilizzato con luce UV per la successiva applicazione del biodosaggio.
      NOTA: Assicurarsi che la sospensione conidiale sia completamente vorticata prima di ogni trasferimento per evitare che si depositi. Prima dell'uso, sterilizzare il micro-spruzzatore esponendolo alle radiazioni ultraviolette per 30 minuti all'interno di una cappa a flusso laminare.

4. Screening della virulenza contro i tripidi del peperoncino

  1. Preparazione delle larve di 2° stadio
    1. Raccogli le larve del 2° stadio seguendo i passaggi 1.3.1-1.3.5 per il seguente esperimento.
      NOTA: Distinguere le larve del 2° stadio dal colore giallo del corpo e dall'addome largo rispetto alle larve del primo stadio (Figura 2).
  2. Preparazione del contenitore per l'inoculazione
    NOTA: Selezionare le specie di foglie in base alla coltura target di tripidi di peperoncino. In questo studio, i tripidi del peperoncino sono stati raccolti dal campo di foglie infestate di mirtillo 'Biloxi' (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp). Pertanto, il biodosaggio dell'EPF contro i tripidi del peperoncino sarà effettuato su foglie di mirtillo.
    1. Raccogli le giovani foglie di mirtillo da una fattoria di mirtilli e lava le foglie di mirtillo per rimuovere la polvere superficiale e qualsiasi altro artropodi, se presente.
    2. Asciugare le foglie all'aria o usare della carta assorbente per asciugare l'acqua; Quindi, controlla la superficie delle foglie di mirtillo per eventuali altri artropodi o uova sotto uno stereomicroscopio. Rimuovere eventuali artropodi, se presenti.
    3. Tagliare un disco fogliare di 2,8 cm di diametro utilizzando un taglierino per pelle (Tabella dei materiali), disinfettare la foglia con candeggina all'1% (soluzione di ipoclorito di sodio) e risciacquare 2 volte con acqua sterilizzata per rimuovere eventuali residui di candeggina sulle foglie.
      NOTA: Preparare il disco fogliare prima della solidificazione dell'agar per assicurarsi che il disco fogliare possa essere incorporato correttamente nell'agar d'acqua.
    4. Autoclavare in autoclave una soluzione di agar acquoso al 2,5% (2,5 g di agar per 100 ml di ddH2O) per la sterilizzazione.
    5. Versare 3 ml di agar agar acquoso al 2,5% in piccoli contenitori di vetro (35 mm di altezza, 30 mm di diametro interno) all'interno di una cappa a flusso laminare prima che l'agar si solidifichi. Lasciare raffreddare l'agar agar a circa 40 °C fino a raggiungere uno stato semisolido.
    6. Posizionare delicatamente il disco fogliare (lato adassiale rivolto verso l'alto) sull'agar, incorporandolo leggermente con un'esposizione minima sopra la superficie dell'agar. Una volta che l'agar d'acqua si è completamente solidificato, i contenitori di vetro sono pronti per il biotest.
  3. Inoculazione e osservazione dell'EPF
    1. Prima dell'applicazione, agitare accuratamente la sospensione conidiale. Utilizzando un microspruzzatore, applicare uniformemente 0,1 ml di sospensione (preparata al punto 3.2.4) sulla superficie di ciascun disco fogliare da una distanza di circa 10 cm all'interno del contenitore di vetro.
      NOTA: Testare le aree di spruzzatura prima dell'esperimento. Assicurarsi che la spruzzatura copra uniformemente l'intero disco fogliare con uno strato sottile. Se le goccioline si accumulano nell'acqua stagnante sulla foglia, ridurre il volume di inoculazione per evitare di bagnare eccessivamente.
    2. Asciugare all'aria la sospensione di conidi sulla foglia per 30 minuti in condizioni sterili (ad esempio, in una cappa a flusso laminare).
    3. Trasferisci 10 larve di 2° stadio in ogni contenitore usando un pennello fine e sigilla ogni contenitore di vetro con due strati di parafilm.
    4. Fai ~ 30 piccoli fori usando un perno per insetti #00 (Tabella dei materiali) per la ventilazione.
    5. Inoculare il contenitore a 25 ± °C con ~70% di umidità relativa e un fotoperiodo di L:D = 12 h: 12 h.
    6. Osserva e registra la mortalità dei tripidi del peperoncino allo stereomicroscopio con un ingrandimento 10x al giorno per 7 giorni.
    7. Conservare le larve morte all'interno del contenitore di vetro per l'osservazione della micosi per confermare l'infezione da EPF.

5. Biodosaggio di isolati di EPF selezionati

NOTA: L'isolato EPF più virulento o diversi isolati con elevata virulenza possono essere selezionati per un biotest dose-dipendente contro i tripidi del peperoncino. Per valutare la relazione tra dose e patogenicità sono state utilizzate tre diverse concentrazioni di conidi, comprese tra 106 e 108 conidi/mL.

  1. Preparazione della sospensione di conidi
    1. Recuperare l'isolato EPF selezionato seguendo il passaggio 3.1.
    2. Preparare tre concentrazioni di sospensioni di conidi (10,6, 10,7 e 10,8 conidi/mL) come descritto al punto 3.2.
  2. Preparazione delle larve di 2° stadio
    1. Raccogli le larve di secondo stadio seguendo il passaggio 4.1 per ottenere adulti appena emersi.
  3. Preparazione del contenitore per l'inoculazione
    1. Segui il passaggio 4.2. per preparare il contenitore di inoculazione contenente dischi di foglie di mirtillo incorporati nell'agar d'acqua.
  4. Inoculazione e osservazione dell'EPF
    1. Condurre l'inoculazione dell'EPF con tre concentrazioni di sospensione di conidi, come descritto al punto 4.3.

6. Analisi statistica

  1. Calcolo della mortalità
    1. Trasformare i dati di mortalità di ciascun ceppo fungino mediante trasformazione di Arcsin prima di condurre un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) per valutare le differenze tra i trattamenti fungini (livello di significatività impostato come p < 0,05).
    2. Eseguire confronti post hoc dei mezzi di trattamento utilizzando il test Honest Significant Difference (HSD) di Tukey.
  2. Calcolo del tempo letale mediano (LT50) e della concentrazione letale mediana (LC50)
    1. Calcola i valori del tempo letale mediano (LT50) e della concentrazione letale mediana (LC50) utilizzando l'analisi di regressione Probit.
    2. Crea e popola le variabili denominate "totale", "risposta" e "durata" (per LT50) o "concentrazione" (per LC50) con i dati osservati nell'interfaccia del software.
      NOTA: Se la mortalità cumulativa non supera il 50% entro il periodo di osservazione, i valori di LT50 e/o LC50 non possono essere stimati in modo affidabile.
    3. Esegui l'analisi Probit accedendo a Analizza | Regressione | Probit. Imposta il "totale" come il numero totale di insetti testati, la "risposta" come il numero di insetti morti e la "durata" o "concentrazione" come covariata. Impostare il livello di significatività per il fattore di eterogeneità su 0,05 premendo Opzioni e impostando il Livello di significatività per l'uso del fattore di eterogeneità su 0,05.

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Risultati

Il diagramma di flusso sperimentale presentato in questo studio ha dimostrato che il sistema di allevamento stabile dei tripidi di peperoncino potrebbe essere stabilito, a partire dalla raccolta in campo fino allo screening della virulenza degli isolati di EPF (Figura 1). Sebbene l'osservazione morfologica possa distinguere i tripidi del peperoncino dagli altri tripidi dei fiori, l'uso della sequenza COI parziale come marcatore molecolare, comprese le dimensi...

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Discussione

Il tripide del peperoncino è un parassita significativo a livello globale che colpisce numerose colture economicamente importanti come mais, arachidi, peperoni, soia, fragole, patate dolci e pomodori 1,11,19. Le attuali strategie di controllo si basano su approcci integrati che coinvolgono pratiche colturali, agenti di controllo biologico e trattamenti chimici, compreso l'uso di nemici naturali,...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.

Ringraziamenti

Rivolgiamo un ringraziamento speciale al signor Lin, Huanf-Jen della fattoria di mirtilli Humi (Wufeng Dist., Taichung City), che ha fornito le piante di mirtilli. Questa ricerca è stata supportata da 113-2313-B-005 -024 -MY3 del National Science and Technology Council (NSTC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#00 spilla per insettiEntosfingeDMM0220Prodotto nel Regno Unito
Provetta da centrifuga da 1,5 mLCorning incorporataMCT-175-CProdotto negli Stati Uniti
10 μ L Ansa di inoculazioneNEST Scientifico718201Prodotto negli Stati Uniti
Scala DNA 100 bp IIIGeneaidDL007Prodotto a Taiwan.
2x SuperRed PCR Master MixStrumenti biologiciTE-SR01Prodotto a Taiwan
Piastra di Petri da 6 cmAlpha Plus Scientifico16021Prodotto a Taiwan
agarBioman ScientificoAGR001.1Grado microbiologico
agarosioBioman ScientificoPB1200Prodotto a Taiwan
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificoSDB001TProdotto a Taiwan
Kit di tessuti per l'estrazione ad alta velocità Easy DNAFisher BiotecET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Prodotto in Australia)
Innesco anteriore: LCO 1490Genomica PO-PR220919G6Sequenza: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
contenitore di allevamento in vetro Azienda di attrezzature Sunshine LabDimensioni: 35 mm di altezza, 45 mm di diametro interno. Può essere sostituito da qualsiasi dimensione simulata di tazza di plastica o vetro.
EmocitometroPaul Marienfeld640030Prodotto in Germania
incubatriceHipointF740Prodotto a Taiwan
taglierina per pelleVero laboratorio artigianalehttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp TermociclatoreThermo Fisher ScientificoCodice: A37834Prodotto negli Stati Uniti
microscopio ottico Nikon  Ci-LProdotto in Giappone
pennello da pitturaAzienda di spazzole Tian Cheng4716608400352Può essere sostituito da un pennello per acquerello a punta fine, equivalente a un pennello rotondo di misura 0 o 1.
scottexFioritura di maggioBLS007-8Prodotto a Taiwan
Parafilm MBemisPM-996Prodotto negli Stati Uniti
pestello a pelletBioman ScientificoGT100RProdotto a Taiwan
Innesco inverso: HCO 2198Genomica PO-PR220919G6Sequenza: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
Sabouraud Brodo di destrosioHiMediaMH033-500GProdotto in India
StereomicroscopioSoptopSZN71Prodotto a Taiwan
tampone TAE 50XBioman ScientificoTAE501000Prodotto a Taiwan
Interpolazione 80PanReac AppliChem142050.1661Prodotto a Taiwan
borsa con cernieraAzienda di plastica Wenchen1809000061Dimensioni: 12 cm di larghezza e 17 centimetri di lunghezza. (Prodotto a Taiwan)

Riferimenti

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