Questo protocollo descrive un sistema di fissazione del trasduttore a ultrasuoni specificamente progettato per la stimolazione a ultrasuoni del midollo spinale in topi svegli. Il metodo impiega un sistema di fissazione per garantire un posizionamento accurato del trasduttore a ultrasuoni, consentendo allo stesso tempo ai soggetti sperimentali di muoversi liberamente senza compromettere la precisione della stimolazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Fissazione di trasduttori a ultrasuoni per la neuromodulazione del midollo spinale nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli ultrasuoni focalizzati (FUS) sono emersi come un'innovativa tecnologia di neuromodulazione non invasiva che dimostra un potenziale significativo per la regolazione neurale del midollo spinale. Tuttavia, il raggiungimento di una fissazione stabile del trasduttore lungo la colonna vertebrale presenta notevoli sfide tecniche. I metodi di immobilizzazione esistenti spesso richiedono un'anestesia prolungata dell'animale o dimostrano un'affidabilità di adesione inadeguata. Questi vincoli critici sottolineano l'urgente necessità di sviluppare un nuovo paradigma di fissazione che garantisca sia la stabilità operativa che la compatibilità fisiologica. Questo protocollo introduce un innovativo sistema di fissazione con trasduttore a ultrasuoni per la stimolazione del midollo spinale in topi svegli e in movimento libero. Stabilire un metodo affidabile per il posizionamento preciso del trasduttore a ultrasuoni sulla colonna vertebrale è fondamentale per gli esperimenti di neurostimolazione. Questo metodo integra tre fasi: esposizione chirurgica del corpo vertebrale T13, rettifica di precisione del processo spinoso per creare un'interfaccia di contatto planare e incollaggio sicuro della base metallica e del collimatore alla colonna vertebrale utilizzando il materiale della base della protesi e la miscela adesiva. Consente comportamenti motori naturali attraverso movimenti illimitati e garantisce un posizionamento stabile con una variazione spaziale minima tra le sessioni, facilitando lo studio degli interventi del midollo spinale mediati dagli ultrasuoni in modelli animali coscienti. È particolarmente rilevante per gli studi che richiedono valutazioni comportamentali nella riparazione delle lesioni spinali, nella modulazione della barriera sangue-midollo spinale e nei meccanismi del dolore cronico. Affrontando una sfida tecnica critica nella ricerca sulla neuromodulazione animale da sveglio, questo protocollo offre un'interfaccia trasduttore-colonna vertebrale stabile senza restrizioni di movimento, aprendo la strada a risultati sperimentali più accurati e affidabili.
Introduzione
Il midollo spinale è un hub cruciale per l'integrazione delle informazioni tra il sistema nervoso centrale e periferico, il che lo rende prezioso per la ricerca clinica in aree come la trasduzione del segnale del dolore, la ricostruzione della rete motoneurale e la regolazione della neuroplasticità. Gli ultrasuoni focalizzati (FUS), una tecnologia emergente di neuromodulazione non invasiva, sono diventati un importante mezzo di regolazione neurale del midollo spinale. Con le sue caratteristiche fisiche di penetrazione profonda dei tessuti, risoluzione spaziale a livello millimetrico e parametri di produzione di energia controllabili, la sua applicazione si estende dalla ricerca di base sui neuromeccanismi agli studi di traduzione preclinica di vari modelli patologici del midollo spinale.
La ricerca mostra che la FUS può regolare i circuiti neurali del midollo spinale in due modi: inibendo o attivandoli attraverso effetti termici e meccanici. Si caratterizza anche per la sua reversibilità temporale e sicurezza per i tessuti 1,2,3. Nello studio di modelli di lesione del midollo spinale, FUS ha migliorato la capacità motoria dei ratti modulando le risposte infiammatorie e promuovendo la riparazione neurale 4,5,6. Inoltre, è stato dimostrato che la FUS apre la barriera sangue-midollo spinale e migliora l'efficienza della somministrazione locale di farmaci attraverso un effetto di cavitazione mediato da microbolle 7,8. Nel campo del dolore neuropatico, Liao et al. hanno confermato che FUS allevia efficacemente le manifestazioni di dolore neuropatico nei ratti regolando l'espressione di KCC2 e inibendo la via9 di CaMKIV KCC2. Song et al. hanno dimostrato che la tsFUS a bassa intensità applicata al midollo spinale lombare riduce significativamente l'allodinia meccanica e sopprime l'attivazione microgliale in un modello di lesione da costrizione cronica di ratto10. Il raggiungimento di una modulazione precisa del midollo spinale con FUS dipende dalla stabilità spaziale del sistema di erogazione dell'energia a ultrasuoni. Le attuali strategie di fissazione si dividono principalmente in due categorie: 1) Metodo di fissazione rigida: raggiunge un posizionamento preciso utilizzando un telaio stereotassico, ma richiede un'anestesia continua, che sopprime l'attività neurale dei soggetti sperimentali e influisce sulla validità delle valutazioni comportamentali 1,2,3,4,10 ; 2) Metodo di fissazione flessibile: consente la ricerca su soggetti coscienti utilizzando un dispositivo a cintura elastica, ma a causa della grande mobilità della colonna vertebrale, si verificano errori di spostamento e distacco del trasduttore 6,8,9. Inoltre, l'eterogeneità geometrica della lamina della colonna vertebrale porta ad una significativa attenuazione dell'energia degli ultrasuoni, riducendo l'efficienza della modulazione neurale 7,8.
Questo studio propone in modo innovativo uno schema di fissazione del trasduttore a ultrasuoni focalizzato impiantabile per la ricerca sulla modulazione neurale del midollo spinale in topi coscienti e in movimento libero. Questo protocollo utilizza un approccio chirurgico minimamente invasivo per integrare la base metallica, il collimatore e la colonna vertebrale, supporta l'uso ripetuto del trasduttore a ultrasuoni, garantisce la coerenza del target ecografico e mantiene l'attenuazione dell'energia ultrasonica attraverso la lamina entro un intervallo accettabile. La metodologia sviluppata affronta i limiti critici degli approcci esistenti, consentendo così esperimenti di neuromodulazione del midollo spinale più affidabili e riproducibili in animali svegli e comportabili. I parametri chiave includono un'incisione della linea mediana di 2,5 cm a T13, il fissaggio della base metallica in acciaio inossidabile e un rapporto in volume di 3:1 tra il materiale della base della protesi e l'adesivo cianoacrilato. Le limitazioni includono una moderata invasività chirurgica e una precisione operatore-dipendente nella preparazione della superficie ossea.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sugli animali descritte nel presente studio sono state approvate dal Comitato Etico Istituzionale per la Sperimentazione Animale degli Istituti di Tecnologia Avanzata di Shenzhen (numero di certificato: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Tutti gli esperimenti hanno utilizzato topi maschi C57BL/6J (8 settimane di età). I topi pesavano 18-22 g al momento dell'intervento chirurgico.
1. Induzione e mantenimento dell'anestesia (5 ± 1 min)
- Precaricare il circuito dell'anestesia per 5 minuti.
- Impostare la camera di induzione in modo che fornisca il 4% di isoflurano nell'aria medicale a una portata di 2 L/min.
- Passare alla ventilazione con maschera facciale dopo la perdita del riflesso raddrizzante.
- Regola il vaporizzatore per mantenere una concentrazione dell'1,5-2% di isoflurano.
- Mantenere la temperatura corporea del topo utilizzando una coperta riscaldante a 37 °C, con un intervallo target di 36-38 °C durante l'anestesia.
- Applicare l'unguento oftalmico Terramycin.
2. Posizionamento (1 ± 1 min)
- Utilizzare un adattatore stereotassico regolabile per il mouse.
- Posizione prona del mouse con allineamento spinale per mantenere la curvatura fisiologica della colonna vertebrale.
- Fissare la testa del mouse utilizzando le barre auricolari.
- Posizionare gli arti simmetricamente.
3. Preparazione del campo chirurgico (1 ± 1 min)
- Utilizzare un tagliacapelli elettrico (distanza tra le lame 0,1 mm) per rimuovere i peli dal sito chirurgico.
- Assicurarsi che l'area di depilazione sia di circa 3 cm × 1 cm.
- Eseguire tre passaggi di taglio nella direzione opposta alla crescita dei peli.
4. Incisione e avvicinamento (2 ± 1 min)
- Pulire l'area con iodoforo 3 volte (intervalli di 30 s).
- Palpare l'ultima costola (attaccata alla vertebra T13 nei topi) e usarla come
il punto di riferimento principale. Creare un'incisione di 2,5 cm a livello vertebrale T13 lungo
la linea mediana dorsale utilizzando un bisturi. - Sezionare in sequenza la fascia sottocutanea.
- Esporre i muscoli paraspinali attraverso i piani anatomici.
5. Dissezione del muscolo paraspinale (5 ± 1 min)
- Impostare l'ingrandimento del microscopio operatorio su 5x per una visualizzazione ottimale dei muscoli paraspinali e delle strutture vertebrali.
- Eseguire una dissezione acuta dei muscoli paraspinali utilizzando le microforbici.
- Resecare completamente i muscoli paraspinali dorsali e laterali preservando gli strati muscolari ventrali.
- Gestisci il sanguinamento con una garza emostatica riassorbibile.
6. Installazione su base metallica (1 ± 1 min)
- Montare l'asta di fissaggio (plastica) sull'adattatore stereotassico.
- Montare la base metallica personalizzata (acciaio inossidabile, 0,28 g) all'estremità distale dell'asta (Figura 1A).
- Posizionare bilateralmente la base metallica personalizzata in corrispondenza dei processi trasversali spinali T13.
- Verificare la stabilità del giunto.
7. Preparazione dell'interfaccia ossea (2 ± 1 min)
- Rimuovere il tessuto muscolare residuo dalla lamina e dai processi spinosi al microscopio operatorio.
- Ottenete un'emostasi completa con la compressione in cotone sterile.
- Crea una superficie di contatto planare utilizzando una fresa ossea di precisione con irrigazione salina continua. Azionare il trapano a una velocità di 5.000-10.000 giri/min per ridurre al minimo la generazione di calore. Indossare una protezione per gli occhi e una maschera durante la perforazione.
- Rimuovere la polvere di ossa con tamponi di cotone inumiditi con soluzione salina.
8. Sigillatura del sistema di fissaggio (3 ± 1 min)
- Mescolare i materiali della base della protesi e l'adesivo cianoacrilato (colla 502) con un rapporto di volume di 3:1. Indossare guanti in nitrile e occhiali di sicurezza per evitare il contatto con la pelle e gli occhi.
- Fissare il collimatore a ultrasuoni (plastica, 0,6 g, Figura 1B) e la base metallica alla colonna vertebrale utilizzando la miscela adesiva (Figura 1C).
- Lasciare indurire la miscela adesiva in condizioni ambientali controllate (24 ± 1 °C, 40-60% di umidità relativa). Mantenere il posizionamento statico per 60 s fino alla conferma visiva della completa solidificazione (perdita di lucentezza superficiale e formazione di un'interfaccia rigida).
- Separare la base metallica dall'asta di fissaggio in plastica.
- Verifica della stabilità del fissaggio: Applicare una leggera forza di rotazione alla base metallica sul piano orizzontale. Osservare l'interfaccia collimatore-vertebra con un ingrandimento di 5x per qualsiasi spostamento (tolleranza <0,1 mm). Se il movimento supera la tolleranza, riapplicare la miscela adesiva (passaggio 8.2) e ripetere l'indurimento (passaggio 8.3).
9. Chiusura della ferita (1 ± 1 min)
- Allineare i bordi avvolti per incapsulare completamente la base metallica.
- Eseguire la sutura interrotta con suture di seta 4-0.
- Pulisci l'incisione con iodoforo.
- Eliminare i residui di sangue/detriti ossei all'interno del sito di esposizione laminare del collimatore e imballare con cotone sterile per la sigillatura e l'emostasi.
10. Gestione postoperatoria
- Termoregolazione: Mantenere il topo su una coperta riscaldante (37°C) fino al completo recupero della deambulazione (in genere 2-3 ore dopo l'anestesia).
- Profilassi antibiotica postoperatoria: somministrare cefazolina sodica (50 mg/kg, disciolta in soluzione fisiologica allo 0,9% a una concentrazione di 50 mg/mL) tramite iniezione sottocutanea nella regione dorsale del collo immediatamente dopo l'intervento chirurgico.
- Mantenere l'igiene della ferita. Pulire la ferita utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina una volta al giorno per i primi 3 giorni ed eseguire un'ispezione giornaliera del sito chirurgico per segni di infezione, deiscenza o infiammazione.
- Analgesia postoperatoria: somministrare carprofene (5 mg/kg, per via sottocutanea) ogni 12 ore per 3 giorni dopo l'intervento11.
NOTA: La Figura 1D mostra il sistema di fissazione impiantato in un topo vivo dopo il recupero.
11. Smaltimento di rifiuti pericolosi
- Raccogliere la polvere ossea e i materiali contaminati dal sangue in sacchetti a rischio biologico a prova di perdite etichettati con i simboli "Rischio biologico" per il trasferimento a un impianto di smaltimento dei rifiuti sanitari autorizzato.
- Collocare il materiale di base della protesi non polimerizzata e i residui di colla 502 in contenitori sigillati resistenti agli agenti chimici etichettati come "Rifiuti chimici" e conservarli in un armadio ventilato designato per lo smaltimento tramite protocolli di gestione dei rifiuti chimici.
- Gettare aghi, lame di bisturi e trapani per ossa in contenitori per oggetti taglienti resistenti alla perforazione contrassegnati con etichette "Biohazard".
12. Avvertenze di sicurezza
- Quando si maneggiano i materiali della base della protesi, evitare il contatto diretto con la pelle indossando guanti in nitrile e occhiali di sicurezza ed eseguire la miscelazione e l'indurimento in una cappa ben ventilata per ridurre al minimo l'inalazione di monomeri volatili.
- Smaltire il materiale residuo come rifiuto chimico secondo le linee guida istituzionali. Per gli adesivi cianoacrilati 502, evitare il contatto con la pelle o gli occhi e sciacquare immediatamente con acqua per 15 minuti in caso di esposizione, rivolgendosi a un medico. Utilizzarli in aree ventilate, conservarli in luoghi freschi e asciutti, lontano da fonti di accensione, ed evitare il contatto con tessuti di cotone o lana.
- Quando si utilizzano trapani di precisione, fissare il manipolo, indossare una visiera e una maschera chirurgica e irrigare il sito di perforazione con soluzione fisiologica per evitare lesioni termiche.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Test in campo aperto
Il test in campo aperto è stato progettato per valutare potenziali cambiamenti comportamentali nei topi dopo l'intervento chirurgico (Figura 2A). È stata impiegata una camera standard a campo aperto di 40 cm × 40 cm per garantire uno spazio di attività sufficiente per i topi, mantenendo condizioni ambientali relativamente coerenti e riducendo al minimo le interferenze esterne. L'esperimento consisteva in due fasi: pre-operatoria e 7 giorni dopo l'inte...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo studio presenta un nuovo protocollo di accoppiamento vertebrale che facilita la neuromodulazione ultrasonica precisa del midollo spinale in topi svegli e che si comportano liberamente. A differenza degli approcci di fissazione convenzionali, questa metodologia supera i limiti degli approcci di fissazione convenzionali. A differenza delle strutture stereotassiche rigide che necessitano di anestesia continua (che sopprime l'attività neurale e complica le valutazioni comportamentali<...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal progetto di avvio della ricerca scientifica di talento di alto livello dell'Università di Hong Kong-Shenzhen Hospital nell'ambito di una sovvenzione HKUSZH202207003. Ringraziamo sinceramente tutti i membri del laboratorio per la loro assistenza nell'ottimizzazione del protocollo e nella cura degli animali e lo Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (SIAT), per il loro supporto istituzionale.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Camera di induzione per anestesia | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Adesivo cianoacrilato (colla 502) | Fabbrica chimica di Pechino | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=vero& id=736 869038961& LTK2=1752156592779 MDBP47QQP4VYV57MQ156E& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| Materiali della base per protesi dentarie | Nuovo secolo Dentale | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Asta di fissaggio | Costume | ||
| Isoflurano | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Base in metallo | Costume | ||
| Microstrumentazione | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | ||
| Trapano di precisione | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Sistema di anestesia multicanale per piccoli animali | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Adattatore stereotassico per topi e ratti giovani | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =vero& id=651346369142& LTK2=1752 157416717WLSrozz5UroeHTBQ5YCIM4 & ns=1& prezzoTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0ddd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| Microscopio operatorio | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Sutura chirurgica (Prolene) | Ethicon (Johnson & Johnson) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =vero& id=774292384846& LTK2= 1752157506907C0321FinubB5 RPKUB6AV6N& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Unguento oftalmico Terramycin | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Collimatore ad ultrasuoni | Costume |
Riferimenti
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
