Articolo metodologico

Tecniche multi-omiche per la profilazione delle transizioni di stato della cromatina nei colangiociti primari di topo a basso input

DOI:

10.3791/68606

⸱

3 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto presenta un protocollo completo per ChIP-seq a basso input per profilare le modificazioni istoniche e ATAC-seq per valutare l'accessibilità della cromatina in piccole quantità di colangiociti primari di topo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia del fegato policistico (PLD) è una malattia ereditaria caratterizzata dalla formazione di cisti piene di liquido derivate dai colangiociti, che porta a una progressione della malattia e a una significativa riduzione della qualità della vita dei pazienti. Gli attuali trattamenti per la PLD sono inadeguati, sottolineando la necessità di nuove strategie terapeutiche. Il ruolo della regolazione epigenetica nella progressione della PLD, in particolare l'accessibilità della cromatina e le modificazioni istoniche, rimane poco esplorato. Le tecniche tradizionali di profilazione epigenetica, come ChIP-seq e DNase-seq, richiedono un gran numero di cellule, che sono difficili da ottenere dai colangiociti primari. Per risolvere questo problema, abbiamo ottimizzato i protocolli ChIP-seq e ATAC-seq a basso input per un basso numero di colangiociti primari. Questi approcci consentono l'analisi delle modificazioni istoniche e dell'accessibilità della cromatina con un input cellulare minimo. Il ChIP-seq a basso input utilizza la nucleasi micrococcica (MNase) per la frammentazione del DNA, mentre l'ATAC-seq impiega la trasposasi Tn5 per catturare le regioni aperte della cromatina. Queste tecniche multi-omiche forniscono preziose informazioni sulle dinamiche dello stato della cromatina durante le transizioni del destino dei colangiociti nella PLD e in altre malattie biliari. È importante sottolineare che i protocolli ottimizzati sono applicabili con sicurezza ad altre cellule primarie a basso input, consentendo l'esplorazione dei meccanismi epigenetici in vari contesti cellulari. Questo lavoro presenta un approccio sistematico per lo studio delle alterazioni dello stato della cromatina, contribuendo allo sviluppo di strategie terapeutiche su base epigenetica per la PLD e le malattie correlate.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La PLD è una malattia ereditaria caratterizzata dallo sviluppo di più cisti piene di liquido derivate dai colangiociti. Man mano che queste cisti si espandono progressivamente, hanno un grave impatto sulla qualità della vita dei pazienti 1,2. Le strategie terapeutiche esistenti per la PLD sono inadeguate, forniscono solo benefici limitati e spesso portano ad alti tassi di recidiva e complicanze 3,4. Pertanto, vi è un urgente bisogno di approcci terapeutici più sicuri ed efficaci per affrontare le sfide cliniche irrisolte nel trattamento della PLD.

In condizioni normali, i colangiociti rimangono quiescenti, mentre nella PLD mostrano un'eccessiva proliferazione, un fattore chiave della progressione della malattia 5,6. I meccanismi molecolari alla base di questa transizione cistica rimangono poco chiari. Mentre la regolazione epigenetica, compresa l'accessibilità della cromatina e le modificazioni istoniche, svolge un ruolo vitale nelle transizioni del destino cellulare 7,8, il suo ruolo nella progressione della PLD rimane poco studiato. Tuttavia, molte tecniche di profilazione epigenetica richiedono un gran numero di cellule. Il ChIP-seq tradizionale, che si basa sulla frammentazione della cromatina mediante sonicazione, così come i saggi di accessibilità della cromatina come DNase-seq e MNase-seq, richiedono in genere oltre10-6 cellule, superando di gran lunga il numero ottenibile dai colangiociti primari.

Questo manoscritto fornisce un protocollo completo per ChIP-seq 9,10,11 a basso input per profilare le modificazioni istoniche e ATAC-seq 11,12,13 per valutare l'accessibilità della cromatina in un basso numero di colangiociti primari. Il ChIP-seq a basso input impiega la MNasi per frammentare il DNA9, mentre l'ATAC-seq cattura frammenti di DNA da regioni aperte della cromatina utilizzando la trasposasi Tn512. L'analisi multi-omica che utilizza questi approcci offre preziose informazioni sulle dinamiche dello stato della cromatina durante le transizioni del destino dei colangiociti nella PLD e in altre malattie biliari, facilitando così lo sviluppo di terapie mirate epigenetiche.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di soluzioni e colangiociti per ATAC-seq

  1. Almeno 1 giorno prima dell'esperimento ATAC-seq, preparare il tampone di lisi ATAC utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 1.
    NOTA: Il tampone di lisi ATAC può essere conservato a 4 °C al buio per almeno 1 mese.
  2. Per i colangiociti primari14 appena isolati, contare le cellule utilizzando un emocitometro subito dopo l'isolamento e procedere con l'esperimento ATAC-seq.
    NOTA: Prima è, meglio è per ridurre al minimo l'impatto sulla vitalità cellulare. Tuttavia, se tenuto sul ghiaccio, procedere entro 2 ore non è generalmente un problema.

2. ATAC-seq

NOTA: Utilizzare 100.000 colangiociti per ATAC-seq. Conservare i campioni e le soluzioni in ghiaccio. Per l'esperimento ATAC-seq, l'intera procedura richiede circa 2 giorni.

  1. Centrifugare a 500 × g per 5 min a 4 °C.
  2. Scartare il surnatante, aggiungere 200 μl di tampone di lisi ATAC contenente inibitore della proteasi, pipettare delicatamente per miscelare e incubare con ghiaccio per 20 minuti. Per i primi 10 minuti, pipettare delicatamente per mescolare.
  3. Centrifugare a 1.500 × g per 10 min a 4 °C.
  4. Preparare il tampone di reazione di trasposizione (50 μL) mescolando 3 μL di Enzyme Mix dal kit di preparazione della libreria di DNA ATAC, 10 μL di tampone 5x dal kit di preparazione della libreria di DNA ATAC e 37 μL di acqua priva di nucleasi. Mescolare accuratamente.
  5. Scartare con cautela il surnatante, posizionare il pellet nucleare raccolto sul ghiaccio e aggiungere immediatamente 50 μl di tampone di reazione di trasposizione. Risospendere delicatamente e incubare a 37 °C per 60 minuti, muovendo il fondo della provetta ogni 10 minuti per miscelare.
    NOTA: Preparare il tampone di reazione di trasposizione prima di scartare il surnatante per evitare che le cellule si secchino.
  6. Purificare il DNA utilizzando il kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: In questa fase è stato possibile rimuovere le perle di proteina G residue dal processo di isolamento dei colangiociti14 . I campioni di DNA possono essere conservati a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
  7. Eseguire la costruzione della libreria utilizzando il kit di preparazione della libreria ATAC DNA secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Conservare tutti i campioni e le soluzioni su ghiaccio se non diversamente specificato. Sebbene le procedure possano differire tra le altre marche di kit, tutte sono compatibili con il nostro protocollo.
    1. Arricchimento PCR: preparare la miscela di arricchimento PCR (50 μL) in una provetta PCR mescolando i seguenti componenti nell'ordine specificato: 10 μL di campione di DNA (dal passaggio 2.6), 14 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di 5x TAB, 5 μL di PPM, 1 μL di TAE, 5 μL di primer P5 e 5 μL di primer P7. Pipettare delicatamente per mescolare.
    2. Trasferire la provetta in uno strumento PCR ed eseguire il seguente programma: (72 °C per 3 min) x 1 ciclo, (98 °C per 30 s) x 1 ciclo, (98 °C per 15 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 3 min) x 15 cicli e (72 °C per 5 min) x 1 ciclo, e mantenere a 4 °C.
    3. Purificazione: Portare le perle DNA Clean a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso, quindi eseguire una purificazione magnetica delle microsfere in due fasi.
      1. Primo ciclo: aggiungere 30 μl di perle di DNA Clean ai prodotti PCR (dal passaggio 2.7.2), pipettare delicatamente per miscelare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la provetta per PCR su un separatore magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida (~5 min). Trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta ed eliminare le perle di DNA Clean.
      2. Secondo ciclo: aggiungere 7,5 μl di perle di DNA Clean al surnatante raccolto (dal passaggio 2.7.3.1), pipettare delicatamente per miscelare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la provetta su un separatore magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida (~5 min). Eliminare con cautela il surnatante.
    4. Tenere la provetta sul separatore magnetico e sciacquare le perle DNA Clean per 2 x 30 s con 200 μL di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente. Scartare con cura il surnatante dopo ogni risciacquo. Con la provetta ancora sul separatore magnetico, aprire il coperchio della provetta e asciugare le perle all'aria per 10 minuti. Infine, aggiungi 22 μL di acqua priva di nucleasi per eluire il DNA.
      NOTA: I campioni di DNA possono essere conservati a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
  8. Sequenzia le librerie utilizzando un sequencer standard di nuova generazione.
    NOTA: Si consiglia di ottenere almeno 50 milioni di letture di coppia.

3. Preparazione di soluzioni e colangiociti per ChIP-seq a basso input

  1. Almeno 1 giorno prima dell'esperimento ChIP-seq a basso input, preparare il tampone di lisi ChIP, il tampone ChIP MNase, il tampone ChIP Stop Buffer, il tampone ChIP 2x RIPA, il tampone ChIP RIPA e il tampone ChIP LiCl utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 2, Tabella 3, Tabella 4 e Tabella 5.
    NOTA: Le soluzioni di cui sopra possono essere conservate a 4 °C per almeno 1 mese.
  2. Per i colangiociti primari14 appena isolati, contare le cellule utilizzando un emocitometro subito dopo l'isolamento e procedere con l'esperimento ChIP-seq a basso input.
    NOTA: Prima è, meglio è per ridurre al minimo l'impatto sulla vitalità cellulare. Tuttavia, se tenuto sul ghiaccio, procedere entro 2 ore non è generalmente un problema.

4. Giorno 1 di ChIP-seq a basso input: lisi cellulare, digestione della MNasi e incubazione degli anticorpi

NOTA: Per l'esperimento ChIP-seq a basso input, l'intera procedura richiede circa 3 giorni.

  1. Dividere i colangiociti in aliquote di 100.000 cellule per provetta e mantenere i campioni e le soluzioni sul ghiaccio.
    NOTA: Se si esegue un esperimento ChIP-seq a basso input per più modifiche istoniche, è accettabile aumentare il volume proporzionalmente prima di aggiungere l'anticorpo di modifica istonica. I volumi dei reagenti nelle fasi seguenti si basano su una provetta contenente 1 × 105 cellule.
  2. Centrifugare a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
  3. Scartare il surnatante, aggiungere 19 μl di tampone di lisi ChIP contenente l'inibitore della proteasi, pipettare delicatamente per mescolare e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Evita di generare bolle.
  4. Aggiungere 19 μl di tampone ChIP MNase e pipettare delicatamente per miscelare.
  5. Aggiungere 2 μL di MNasi (0,01 U/μL) e pipettare delicatamente per miscelare. Incubare a 37 °C per 5 min.
    NOTA: Il tempo di incubazione è critico. La concentrazione finale di MNasi è 0,0005 U/μL. La concentrazione ottimale di MNasi può essere determinata in base al tipo e al numero di cellule.
  6. Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio, aggiungere 5 μl di tampone ChIP STOP per terminare la digestione e pipettare delicatamente per miscelare.
  7. Aggiungere 45 μl di tampone ChIP 2x RIPA contenente inibitore della proteasi, pipettare delicatamente per miscelare e incubare ulteriormente su ghiaccio per 10 minuti.
  8. Centrifugare a 20.000 × g per 15 min a 4 °C. Trasferire lentamente il surnatante in un nuovo tubo.
    NOTA: In questa fase è stato possibile rimuovere le perle di proteina G residue dal processo di isolamento dei colangiociti14 .
  9. Aggiungere 40 μl di tampone ChIP RIPA.
  10. Per i campioni di immunoprecipitazione (IP), aggiungere 1 μg di anticorpo per campione e incubare la sospensione su un rotatore (20 giri/min) a 4 °C per una notte.
  11. Per i campioni in ingresso, non aggiungere alcun anticorpo e incubare la sospensione su un rotatore (20 giri/min) a 4 °C per una notte.

5. Giorno 2 di ChIP-seq a basso input: immunoprecipitazione, lavaggio ed eluizione

NOTA: Per i campioni IP, seguire i passaggi 5.1-5.7. Per i campioni di input, seguire i passaggi 5.8-5.12.

  1. Prelavare le perle di proteine G con 1 mL di tampone ChIP RIPA ghiacciato.
  2. Aggiungere 400 μg di perle di proteina G ai campioni e incubare con rotazione (20 giri/min) a 4 °C per 2 ore.
  3. Lavare le perle per 5 x 5 minuti con 150 μL di ChIP RIPA Buffer ghiacciato per 5 minuti a 4 °C su un rotatore (20 giri/min). Rimuovere il surnatante utilizzando un separatore magnetico.
  4. Lavare le perle con 150 μL di ChIP LiCl Buffer ghiacciato per 5 minuti a 4 °C su un rotatore (20 giri/min). Rimuovere il surnatante utilizzando un separatore magnetico.
  5. Aggiungere 30 μL di tampone di eluizione ChIP (29 μL di acqua priva di nucleasi e 1 μL di proteinasi K) per risospendere le perle e agitare a 900 giri/min a 55 °C per 90 min. Muovere delicatamente il tubo periodicamente per mantenere le perline in sospensione.
  6. Raccogliere il surnatante utilizzando un separatore magnetico e trasferirlo lentamente in una nuova provetta. Incubare a 72 °C per 40 minuti per inattivare la proteinasi K.
  7. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro.
    NOTA: I campioni di DNA possono essere conservati a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
  8. Per i campioni in ingresso, aggiungere 1 μL di proteinasi K e agitare a 900 giri/min a 55 °C per 90 minuti.
  9. Purificare il DNA mediante estrazione fenolo-cloroformio. Aggiungere 130 μl di reagente per l'estrazione del DNA e agitare energicamente fino a quando la soluzione diventa rosa. Centrifugare a 20.000 × g per 5 min.
  10. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, aggiungere 130 μl di isopropanolo ghiacciato, quindi aggiungere 1 μl di glicogeno e 6,5 μl di NaAc 3M. Centrifugare a 20.000 × g per 15 min.
  11. Eliminare il surnatante, lavare una volta con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 20.000 × g per 15 minuti. Asciugare il pellet e risospenderlo in 30 μL di acqua priva di nucleasi.
  12. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro.
    NOTA: I campioni di DNA possono essere conservati a -80 °C per una conservazione a lungo termine.

6. Giorno 3 di ChIP-seq a basso input: costruzione e sequenziamento della libreria

  1. Eseguire la costruzione della libreria utilizzando un kit di preparazione della libreria ChIP DNA secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: I passaggi includono la preparazione dell'estremità, la legatura dell'adattatore e l'amplificazione della libreria. Pipetta 5 ng di campioni ChIP (campioni di input e IP) per la costruzione di librerie. Conservare tutti i campioni e le soluzioni in ghiaccio, se non diversamente specificato. Sebbene le procedure possano differire tra le altre marche di kit, tutte sono compatibili con il nostro protocollo.
  2. Preparazione finale: Preparare il tampone di reazione per la preparazione finale (65 μl) in una provetta per PCR mescolando 5 ng di campione di DNA (dal passaggio 5.6 o 5.11), 15 μl di miscela 4 per la preparazione finale, 6,5 μl di Tris EDTA e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 65 μl. Pipettare delicatamente per miscelare. Trasferire la provetta in uno strumento PCR ed eseguire il seguente programma: 20 °C per 15 minuti, 65 °C per 15 minuti e mantenere a 4 °C (coperchio caldo: 105 °C).
  3. Legatura dell'adattatore: Adattatore DNA diluito S con un rapporto di 1:100. Preparare il tampone di reazione di legatura adattatore (100 μl) in una provetta PCR miscelando 65 μl di prodotti per la preparazione finale (dal passaggio 6.2), 25 μl di tampone di legatura rapida 2, 5 μl di DNA ligasi rapida e 5 μl di adattatore DNA diluito S. Pipettare delicatamente per miscelare. Trasferire la provetta in uno strumento PCR ed eseguire il seguente programma: 20 °C per 15 minuti, seguito da una pressione a 4 °C (coperchio caldo: 105 °C).
  4. Purificazione:
    1. Portare le perle DNA Clean a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Aggiungere 60 μL di perline DNA Clean ai prodotti di legatura dell'adattatore (dal passaggio 6.3). Pipettare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
    2. Posizionare la provetta per PCR su un separatore magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida (~5 min). Eliminare con cautela il surnatante.
    3. Tenere il tubo sul separatore magnetico. Sciacquare le perle DNA Clean per 2 x 30 s con 200 μl di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente. Scartare con cura il surnatante dopo ogni risciacquo.
    4. Con la provetta ancora sul separatore magnetico, aprire il coperchio della provetta e asciugare le perle all'aria per 5 minuti. Infine, aggiungere 22,5 μl di 10 mM di Tris-HCL (PH 8,0) per eluire il DNA.
  5. Amplificazione della libreria: Preparare il tampone di reazione di amplificazione della libreria (50 μL) in una provetta per PCR mescolando 20 μL di prodotti di purificazione (dal passaggio 6.4), 2,5 μL di i5 PCR Primer, 2,5 μL di i7 PCR Primer e 25 μL di Amplification Mix. Pipettare delicatamente per mescolare. Trasferire la provetta in uno strumento PCR ed eseguire il seguente programma: (95 °C per 3 min) x 1 ciclo, (98 °C per 20 s, 60 °C per 15 s, 72 °C per 30 s) x 18 cicli, (72 °C per 5 min) x 1 ciclo e mantenere a 4 °C.
  6. Purificazione: Portare le perle DNA Clean a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso, quindi eseguire una purificazione magnetica delle microsfere in due fasi.
    1. Primo round: aggiungere 30 μl di perline DNA Clean ai prodotti di amplificazione della libreria (dal passaggio 6.5). Pipettare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la provetta per PCR su un separatore magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida (~5 min). Trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta ed eliminare le perle di DNA Clean.
    2. Secondo round: aggiungere 7,5 μl di perle di DNA Clean al surnatante raccolto. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare la provetta su un separatore magnetico e attendere che la soluzione diventi limpida (~5 min). Eliminare con cautela il surnatante. Tenere il tubo sul separatore magnetico. Sciacquare le perle DNA Clean per 2 x 30 s con 200 μl di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente. Scartare con cura il surnatante dopo ogni risciacquo. Con la provetta ancora sul separatore magnetico, aprire il coperchio della provetta e asciugare le perle all'aria per 10 minuti. Infine, aggiungere 22,5 μl di 10 mM di Tris-HCl (PH 8,0) per eluire il DNA.
      NOTA: I campioni di DNA possono essere conservati a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
  7. Sequenzia le librerie in un sequencer standard di nuova generazione.
    NOTA: Si consiglia di ottenere almeno 10-20 milioni di letture pair-end.

7. Analisi dei dati di ATAC-seq e Low-input ChIP-seq

  1. Preparazione dell'ambiente virtuale di analisi (miniconda)
    1. Scarica Miniconda3 dal sito Web utilizzando i seguenti comandi e segui le istruzioni di installazione di Miniconda.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Creare un ambiente virtuale per la pipeline di analisi sia di ATAC-seq che di ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda attiva NGSpipeline
      Conda Install BioConda::FastQC BioConda::MultiQC BioConda::Trim-Galore BioConda::Bowtie2 BioConda::Samtools BioConda::MacS2 BioConda::d EEPreps BioConda::p iCard BioConda::IGV
    3. Scarica il file della sequenza del genoma di riferimento e crea un indice di allineamento per l'allineamento del papillon2.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. Esegui il controllo di qualità delle letture ATAC-seq e ChIP-seq con FastQC e riepiloga il rapporto di controllo qualità utilizzando MultiQC per garantire la distorsione GC dei risultati del sequenziamento e una complessità della libreria sufficiente per l'analisi a valle. Scartare la libreria di sequenze con risultati di controllo di qualità significativamente diversi.
    fastqc -o ......
    MultiQC
  3. Adattatore per la sequenza di ritaglio utilizzando trim a bizzeffe.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. La mappa tagliata legge l'assemblaggio del genoma di riferimento mm10 con Bowtie2 utilizzando i parametri predefiniti e passa i parametri di addizione (--very sensitive -X 2000) a bowtie2 per ATAC-seq a causa dell'ampia distribuzione della lunghezza del frammento ATAC-seq.
    1. Per ATAC-seq:
      bowtie2 -p --molto-sensibile -X 2000 -x -1 < file fastq pulito da 4.2 lettura 1> -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
    2. Per ChIP-seq:
      bowtie2 -p -x -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
  5. Rimuovere le letture con un punteggio di allineamento basso (q30) e le letture allineate al genoma dei mitocondri e al cromosoma non standard.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
  6. Utilizzare il comando Picard MarkDuplicates per rimuovere le letture dei duplicati PCR.
    picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=true
  7. Chiama il picco utilizzando il comando MACS2 callpeak con il parametro -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t -g mm -n -B -q 0.01
  8. Genera file BigWig utilizzando il comando Deeptools BamCoverage.
    Indice Samtools -@ 4
    bamCoverage -b     -o -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. Usa il browser del genoma IGV per visualizzare il file narrowPeak da macs2 e i file BigWig da Deeptools BamCoverage.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per generare il panorama cromatinico dei colangiociti primari, abbiamo ottimizzato i protocolli ChIP-seq e ATAC-seq a basso input per un numero basso (~100.000) di colangiociti primari. I risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio per i colangiociti primari hanno indicato che per 1 × 10-5 colangiociti primari, 0,02 U MNasi a 37 °C per 5 minuti ha determinato la produzione di mononucleosomi, che è stata identificata come la concentrazione ottimale (Figura 1).

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per mappare in modo sistematico e completo le dinamiche di stato della cromatina alla base della transizione di stato dei colangiociti cistici, abbiamo ottimizzato con successo ChIP-seq e ATAC-seq a basso input per un numero limitato di colangiociti primari. Sebbene questo studio si sia concentrato sui colangiociti primari, siamo fiduciosi che il protocollo possa essere applicato anche ad altre cellule primarie ad alta vitalità con disponibilità limitata. Allo stesso modo, mentre questo ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82402166 to R.J.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7,5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8,0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Gel di agarosioBiosharpBS081
ATAC DNA Library Kit di preparazioneVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M stock
Kit di preparazione della libreria di DNA ChIPVazymeND607
Perline di pulizia del DNAVazymeN411
Reagente per l'estrazione del DNASolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) stock
FluorimetroInvitrogenQ33226
GlicogenoThermo ScientificR0561
EmocitometroQIUJINGXB. K.25.
Igepal CA-630SigmaI889610% stock
Separatore magneticoPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881,5 M stock
MNaseSigmaN37550,01 U/µ L stock
NaClSangon BiotechA6104765 M stock
NP40SolarbioN8030
Acqua priva di nucleasiLife TechnologiesAM9937
Strumento PCRApplied Biosystems4484073
PCR Kit di purificazioneQIAGEN28106
Inibitore della proteasiRoche
Perle di proteine GInvitrogen10004D
Proteinasi KTransGenGE201-01
RotatoreKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010% stock
Sodio desossicolatoSigmaS1827
Thermomixer comfortEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
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04693132001

Riferimenti

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