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Articolo metodologico

Il sistema Circadian Rave: un sistema economico, open-source e facile da costruire per qualsiasi esperimento basato sulla luce

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DOI:

10.3791/68611

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26 settembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, University of Bristol, 3Neuroscience and Mental Health Innovation Institute, School of Biosciences, Cardiff University

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per la costruzione, la programmazione e l'esecuzione del Circadian Rave System, un controller a diodi a emissione di luce (LED) basato su Arduino per la gestione di più regimi di luce complessi.

Abstract

Il controllo preciso dell'illuminazione ha ampie applicazioni in tutte le scienze biologiche, ma soprattutto nella ricerca circadiana. La vita sulla Terra ha sviluppato orologi circadiani che sono regolatori endogeni della fisiologia e del comportamento che si trascinano al giorno solare di 24 ore. Per studiare l'orologio, i ricercatori si affidano alla manipolazione sperimentale della luce o della temperatura per trascinare i ritmi circadiani. La maggior parte dei laboratori attualmente utilizza apparecchiature di illuminazione disponibili in commercio o costruite internamente per imitare o interrompere il ciclo naturale diurno e notturno. Questi sistemi offrono programmabilità e precisione limitate, mancano di standardizzazione e, in alcuni casi, di convenienza. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato il Circadian Rave System, un pacchetto software e hardware su misura che consente il controllo preciso di più scatole luminose indipendenti. Abbiamo reso il software open source, insieme a guide dettagliate per la costruzione dell'hardware, con l'obiettivo che la ricerca futura possa essere standardizzata attraverso l'uso di questo sistema. Per dimostrare la funzionalità di questo sistema e la sua utilità negli esperimenti circadiani, abbiamo misurato la longevità e l'attività di Drosophila in vari paradigmi di luce per mostrare la sincronizzazione circadiana e la distruzione attraverso la manipolazione della luce. In conclusione, abbiamo sviluppato un sistema di illuminazione standardizzato, scalabile e conveniente che può essere costruito internamente da qualsiasi ricercatore con conoscenze preliminari minime in elettronica o programmazione.

Introduzione

Il controllo preciso della luce è fondamentale in quasi tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali. Per l'allevamento in laboratorio di tali animali, è possibile acquistare incubatrici disponibili in commercio che hanno una capacità limitata per la programmazione di complessi regimi ciclici di luce e buio. La capacità di programmare regimi di illuminazione complessi è necessaria per molti campi di studio, ma è fondamentale nella ricerca circadiana. L'orologio circadiano, legato al giorno solare, è un oscillatore endogeno che regola i cambiamenti nella fisiologia e nel comportamento dagli insetti ai mammiferi1. In quanto tale, la ricerca circadiana ha iniziato a permeare molti campi della ricerca biologica, come lo sviluppo2, l'immunità3 e la patologia delle malattie umane4. Gli studi sull'orologio circadiano si basano fortemente sull'uso della luce o della temperatura per manipolare o addirittura interrompere l'orologio attraverso un controllo preciso dei tempi, dell'intensità e del ciclo 5,6. Attualmente, c'è bisogno di un sistema economico, scalabile e standardizzato di controllo di queste variabili da utilizzare negli esperimenti circadiani.

Oltre a manipolare l'orologio circadiano endogeno, sono stati sviluppati vari strumenti optogenetici che utilizzano specifiche lunghezze d'onda della luce per controllare l'espressione dei transgeni in vivo e in vitro. Ad esempio, l'immensa trattabilità genetica della Drosophila melanogaster ha portato a molti strumenti optogenetici a disposizione dei ricercatori. Ad esempio, la variante shineGal4 sensibile alla luce del fattore di trascrizione Gal4 può attivarsi in seguito all'esposizione alla luce blu ed è uno strumento utilizzato di routine da molti laboratori 7,8,9. I ricercatori tendono a ottenere cambiamenti di luce accendendo manualmente le luci o tramite induzione laser, ma entrambi i metodi possono introdurre vincoli logistici e tecnici durante la progettazione e l'implementazione sperimentale. La capacità di programmare l'avvio, l'arresto, la lunghezza d'onda specifica, il ciclo e l'intensità (dosaggio) della luce sarebbe di estremo beneficio.

Per dare ai ricercatori il pieno controllo delle condizioni di illuminazione, abbiamo progettato il Circadian Rave System (CRS). Si tratta di un sistema alternativo, economico e fai-da-te (DIY) che può essere costruito e adattato dai ricercatori, consentendo la completa personalizzazione dei regimi di illuminazione. Il sistema si basa su un microcontrollore Arduino in grado di controllare fino a sei canali LED indipendenti, rendendo il sistema conveniente e scalabile. I microcontrollori come gli Arduino sono stati utilizzati con successo per realizzare molte apparecchiature di laboratorio fai-da-te grazie alla loro facilità d'uso 10,11,12. Questo sistema può essere utilizzato in incubatori esistenti ed è stato testato con successo a temperature sperimentali tipiche, fornendo un'ampia gamma di funzionalità (4-37 °C). Gli utenti possono programmare il CRS tramite il software open source su misura che è stato sviluppato per diversi sistemi operativi. Il software ha un'interfaccia utente facile da usare, che consente la programmazione di regimi di luce complessi per imitare più da vicino i modelli di luce solare. Questi regimi di luce personalizzati possono essere creati, salvati e quindi caricati successivamente sul microcontrollore, in modo da poter utilizzare un insieme di regimi di luce generati in precedenza, risparmiando tempo durante la configurazione sperimentale. Una volta programmato, il dispositivo può essere scollegato dal computer, il che consente la scalabilità rispetto ai sistemi convenzionali che richiedono computer dedicati per eseguire i regimi di illuminazione. Per testare l'affidabilità del CRS, abbiamo eseguito l'analisi della durata e dell'attività su Drosophila esposta a vari regimi di luce generati da CRS. È stato riscontrato che il CRS esegue in modo affidabile più regimi di illuminazione ininterrottamente per mesi.

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Protocollo

1. Costruire il SR

NOTA: Il CRS è stato progettato per essere costruito internamente dai ricercatori e, come tale, tutti i componenti sono disponibili in commercio da più fornitori (Tabella dei materiali). Le eccezioni sono i circuiti stampati (PCB) che devono essere prodotti commercialmente da specialisti della stampa di PCB o contattando gli autori. Per la produzione commerciale, i file Gerber si trovano nel repository GitHub (@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/microcontroller_PCB). I dipartimenti di ingegneria universitari dispongono in genere di impianti di stampa PCB. Di seguito sono riportate istruzioni dettagliate su come costruire, controllare la qualità e programmare una singola unità CRS.

  1. Assemblaggio del circuito
    1. Saldare i componenti elettrici sul PCB del microcontrollore. I pin del connettore Arduino A1 sono gli unici componenti montati sul fondo. Il posizionamento dei componenti sul circuito stampato corrisponde all'etichettatura con il numero di lettera sul circuito stampato (Tabella 1). Testare i collegamenti saldati con un multimetro.
    2. Inserisci Arduino nella parte inferiore del PCB assemblato utilizzando le connessioni A1.
    3. Saldare i LED o le strisce LED a un cavo da 12 V (si consiglia che sia lungo almeno 1 m) e avvitare le estremità positiva e negativa del cavo da 12 V alla morsettiera del circuito stampato, quindi fissarle in posizione con un cacciavite.
      NOTA: I PCB LED personalizzati (@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/LED_PCB) possono essere utilizzati come alternativa alle strisce LED; ogni PCB LED ospita un singolo LED. Ciò offre il vantaggio di utilizzare LED con spettri di emissione noti e discreti.
    4. Ripetere il passaggio 1.1.3 per ciascuno dei sei canali.
      NOTA: Se si utilizzano strisce LED, ogni canale LED può gestire fino a 400 mA di corrente, che equivale a un massimo di 20 LED (20 mA ciascuno). Pertanto, il sistema è stato progettato per essere utilizzato con strisce LED da 5 V con un massimo di 20 LED collegati a ciascuno dei sei canali di uscita.
  2. Edificio CRS recinzione
    1. Racchiudi il CRS (PCB e Arduino) per garantire la sicurezza e la longevità dei circuiti.
      NOTA: Il repository GitHub ha un involucro stampabile in 3D stampato con successo sia in PLA che in ABS, proteggendo il dispositivo (@Trincatalyst/CRS/Hardware/CRS_enclosure).
  3. Custodie LED
    1. Integrare i LED direttamente negli incubatori, sostituendo le configurazioni di illuminazione preesistenti, oppure posizionarli in involucri su misura che possono essere impilati in un unico incubatore (Figura 1).
    2. Gli armadi su misura offrono i vantaggi di una maggiore scalabilità, convenienza e requisiti di spazio ridotti. Il riciclaggio della plastica di laboratorio, come le scatole dei puntali, può ridurre ulteriormente i costi (Figura 1D). "Annerisci" queste scatole riciclate con nastro isolante per evitare perdite di luce. Tuttavia, per una soluzione più duratura, gli involucri delle macchine in acrilico, che sono stati testati con successo (@Trincatalyst/CRS/Hardware/LED_enclosure).
      NOTA: Assicurarsi di verificare che l'involucro sia a prova di luce, poiché le perdite potrebbero confondere altri esperimenti vicini in esecuzione in parallelo, e verificare che i LED non aumentino la temperatura interna del contenitore se si utilizzano strisce LED in un contenitore piccolo.
  4. Installazione del firmware su CRS
    1. Scarica il firmware CRS che consiste in due file: i file definition.h e CircadianRaveSystem.ino. Entrambi possono essere trovati nel repository GitHub (@Trincatalyst/CRS/Software/PCB_firmware).
    2. Scarica e installa il software IDE (Integrated Development Environment) Arduino da www.arduino.cc/software.
    3. Collega Arduino al computer tramite un cavo USB e all'interno dell'IDE Arduino seleziona la porta di comunicazione (COM) Arduino corretta e stabilisci una connessione.
      NOTA: Non è necessario collegare Arduino al circuito PCB durante la configurazione del firmware.
    4. Successivamente, vai su File > Apri e seleziona la cartella contenente i file definition.h e CircadianRaveSystem.ino.
    5. Una volta aperta una nuova finestra IDE, fare clic su Verifica e quindi su Carica . Questo installerà il firmware su Arduino. Il terminale di uscita dovrebbe visualizzare un'uscita di completamento.
    6. Scollega l'Arduino, che ora è pronto per essere utilizzato come CRS.
  5. Accensione del CRS
    1. Alimenta il CRS inserendo un alimentatore da 5 V con una capacità di 2,5 A nel cilindro di alimentazione del circuito stampato.
      NOTA: Ogni canale LED è progettato per gestire una corrente fino a 400 mA, che equivale a un massimo di 20 LED a 20 mA ciascuno. Il sistema è stato progettato per essere utilizzato con strisce LED da 5 V con un massimo di 20 LED collegati a ciascuno dei sei canali di uscita. Il PCB è dotato di un dispositivo di protezione da sovratensione e sovracorrente, che si attiva a una corrente continua di 3 A o se l'utente collega una tensione di alimentazione superiore a 6,2 V, l'alimentazione verrà interrotta.
  6. Test di qualità del CRS
    1. Prima di eseguire esperimenti con il CRS, verificare che ogni LED/striscia LED collegata al CRS funzioni in modo affidabile per almeno 2 giorni. Per fare ciò, esegui il file CRS_test_profile.txt che si trova nel repository GitHub (@Trincatalyst/CRS/Software/Test/CRS_test_2days.txt) o progetta un regime leggero all'interno del software CRS. Il passaggio 2.6 del caricamento dei profili contiene istruzioni su come eseguire il file CRS_test_2days.txt.

2. Esecuzione di un esperimento

  1. Segui i passaggi successivi per installare il software CRS che consente la programmazione, l'esecuzione e il controllo di regimi di illuminazione complessi.
  2. Installazione del software CRS
    1. Scarica il software CRS direttamente dal repository GitHub (@CRS/CRS_software).
      NOTA: Il software è stato accuratamente testato ed è completamente compatibile con i seguenti sistemi operativi:
      Per Windows 10 e 11, scarica @Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zip.
      Per macOS Ventura, scarica @Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zip.
    2. Individua e apri il software CRS scaricato. In questo modo verrà avviata l'installazione e, una volta completata, sarà pronta per l'uso.
      NOTA: Si consiglia di modificare la posizione del software in una cartella più accessibile.
  3. Connessione al dispositivo CRS
    1. Accendere il CRS.
    2. Utilizzare un cavo FTDI (Future Technology Devices International) per collegare il dispositivo CRS a un computer con il software CRS preinstallato.
    3. Apri il software CRS, quindi fai clic sul menu a discesa Seleziona porta nella scheda Visualizza , seleziona il SR e le sei tabelle LED dovrebbero aggiornarsi una volta collegate. Se gli esperimenti fossero in esecuzione, ogni profilo si aggiornerebbe di conseguenza. Ogni LED CRS è ora pronto per essere programmato.
  4. Programmazione CRS
    NOTA: Il CRS è stato progettato pensando agli esperimenti circadiani e sono state aggiunte quante più funzionalità pertinenti possibili. Ad esempio, un tipico esperimento complesso può richiedere un trascinamento della luce che dura giorni, seguito dall'oscurità per alcuni giorni e quindi un ulteriore rientramento.
    1. Programmare completamente l'esperimento nel SR prima della sperimentazione. Programmare ciascuno dei LED/strisce LED in ciascuno dei sei canali di uscita in modo indipendente utilizzando le linguette LED da uno a sei (Figura 1B). Trova una rappresentazione grafica dei regimi di illuminazione programmati all'interno di ciascuna scheda LED e usala come riferimento durante la programmazione.
    2. I regimi di illuminazione sono stati suddivisi in tre fasi distinte e ciascuna può avere un'intensità e una durata della luce impostate. Le fasi 1 e 3 eseguono un ciclo e possono fungere da fasi di sincronizzazione tra diversi canali LED, ovvero consentire il caricamento di campioni nelle custodie LED in momenti diversi. Ripetere il passaggio 2 utilizzando un interruttore di ciclismo, che in genere è programmato per coprire un periodo di 24 ore.
    3. Alternando l'intensità della luce e la durata di T1, T2, T3 e T4, si creano regimi di luce complessi. T1 e T3 agiscono come intermedi consentendo l'aumento e la diminuzione dell'intensità della luce, imitando più da vicino il giorno naturale e il ciclo della luce. Una volta impostato un programma, salva ed esegui.
      NOTA: Quando è in esecuzione un regime di illuminazione programmato, il regime grafico si aggiornerà di conseguenza e la scheda Visualizza si aggiornerà.
  5. Stoccaggio e caricamento di profili leggeri
    1. Per i regimi di luce che vengono ripetuti tra gli esperimenti, salva il profilo utilizzando il pulsante Salva , che convertirà il profilo in un file txt leggibile da CRS.
    2. Carica i profili salvati in precedenza in CRS utilizzando il pulsante Carica , accelerando la programmazione futura.
  6. Profili di carico e di esecuzione
    1. Per il test, eseguire contemporaneamente il profilo del tester per ciascuna striscia LED. Vai alle schede LED , fai clic sul profilo di carico e fai clic sul CRS_test_profile.txt.
    2. Fare clic su Programma per caricare il profilo nel CRS. Il grafico dovrebbe aggiornarsi insieme alle statistiche del profilo.
    3. Fare clic su Avvia e il grafico verrà aggiornato in tempo reale con l'avanzamento dell'esecuzione. Ripetere l'operazione per tutti e sei i profili LED.
  7. Disconnessione dall'hardware CRS
    1. Disconnettiti con il pulsante Disconnetti situato nella scheda Visualizza . Ora, rimuovi il cavo FTRI in modo sicuro.
  8. Controllo dello stato di avanzamento degli esperimenti
    1. Per controllare lo stato dei regimi di luce mentre il SR è in esecuzione, aprire il software CRS, quindi nella scheda Visualizza , fare clic sul menu a discesa Seleziona porta e selezionare il SR. La scheda di visualizzazione contiene tutte le informazioni correnti di tutte e sei le schede LED. Disconnettersi come descritto in precedenza.

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Risultati

Panoramica del CRS
Il CRS è una combinazione di hardware e software che consente agli utenti di programmare regimi di illuminazione complessi per un massimo di sei strisce LED indipendenti per dispositivo (Figura 1A). Il software può essere facilmente scaricato dal repository GitHub (@Trincatalyst/CRS/Software) e all'interno della pagina principale del software si possono trovare ulteriori istruzioni dettagliate per l'uso (Figura 1B). L'hardw...

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Discussione

Per studiare come la luce influenza la fisiologia e il comportamento, sono necessari programmi di illuminazione complessi, in genere con più condizioni in esecuzione in parallelo. Il controllo preciso dei tempi e dell'intensità dell'esposizione alla luce è anche la chiave per ottenere dati affidabili e riproducibili in questi esperimenti circadiani. Il ciclo di luce può essere ottenuto con incubatori disponibili in commercio o LED collegati a spine timer meccaniche. Tuttavia, questi sist...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Ringraziamenti

Desideriamo ringraziare il Dr. Edgar Buhl e il Prof. James Hodge per l'uso del sistema DAM e la guida alla configurazione. Vorremmo anche ringraziare il Prof. Paul Martin per il suo supporto e la sua guida nello sviluppo del CRS. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione BBSRC BB/T001984/1 assegnata al Prof. Paul Martin.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,1 µ F Condensatore ceramicoFarnell 2507749Quantità = 2
100 kΩ resistore THT assiale 250 mWFarnell 3951804Quantità = 6
100 e omega; resistore THT assiale 250 mWFarnell 3496799Quantità = 6
1 µ F Condensatore ceramicoFarnell 2819603Quantità = 2
Intestazione a foro passante con passo da 2,54 mm a montaggio orizzontale - FTDI Farnell 3756363Quantità = 6
Connettori Arduino a 10 vieFarnell 1593417Quantità = 1
Connettori Arduino a 3 vieFarnell 1593412Quantità = 1
Connettori Arduino a 8 vieFarnell 1593416Quantità = 1
Arduino Uno R3Arduino A000066Quantità = 1
Jack a botteFarnell 224959Quantità = 1
PCB del sistema Rave circadianoLaboratorio MartinLaboratorio Martin1 (120 strisce o 1 componente LED con un PCB LED)
Diodo Farnell 4245041Quantità = 1
Protezione del circuito eFuseFarnell 4178928Quantità = 1
Cavo FTDIFarnell 2419945Quantità = 1
LedRS 855-5933120 strisce o 1 componente LED con un PCB LED
ALIMENTAZIONE 15WFarnell 2815857Quantità = 1
Terminali a vite Farnell 2314973Quantità = 6
STP30NF10 MOSFET a canale N di ST MicroelectronicsFarnell 9946403Quantità = 6

Riferimenti

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