Microscopia di localizzazione ecografica per la mappatura a super-risoluzione della microvascolarizzazione del cervello dei roditori

Sommario

La microscopia di localizzazione ecografica (ULM) è una tecnica di recente sviluppo che consente un livello di risoluzione senza precedenti nell'imaging della microvascolarizzazione in vivo. In questo lavoro, descriviamo in dettaglio come ottenere immagini super-risolte della microvascolarizzazione cerebrale nei roditori utilizzando una piattaforma di imaging ecografico funzionale standardizzata progettata per la ricerca preclinica.

Abstract

La microscopia di localizzazione ecografica (ULM) è una tecnica di imaging a super-risoluzione che consente la visualizzazione in vivo dell'architettura microvascolare del cervello, superando il limite di diffrazione degli ultrasuoni convenzionali. Rilevando e tracciando le microbolle iniettate per via endovenosa mentre circolano attraverso i vasi cerebrali, l'ULM produce mappe ad alta risoluzione della densità vascolare, della velocità del flusso e dell'ampiezza del segnale retrodiffuso su scale spaziali fino a 5-10 μm. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro completo per l'esecuzione dell'imaging ULM nei roditori, compresa la preparazione degli animali, il posizionamento della sonda, l'acquisizione delle immagini, l'iniezione di microbolle e l'elaborazione dei dati, utilizzando una piattaforma ecografica funzionale dedicata. Vengono descritti due metodi di preparazione, adattati per topi (transcranici) e ratti (con finestre craniche), seguiti da istruzioni dettagliate per l'allineamento della sonda e il targeting anatomico utilizzando un atlante cerebrale integrato. Durante l'acquisizione, le sequenze di ultrasuoni ultraveloci vengono sincronizzate con iniezioni in bolo di microbolle per acquisire dati di flusso dinamico. Le fasi successive della ricostruzione riguardano il filtraggio dei disordini, l'interpolazione delle immagini, il rilevamento delle microbolle, la localizzazione dei subpixel e il tracciamento delle traiettorie. I risultati includono mappe di densità che riflettono l'occupazione delle navi, mappe di velocità che rivelano i modelli di flusso e direzionalità e mappe di ampiezza che offrono un contrasto aggiuntivo per l'interpretazione strutturale. I risultati rappresentativi illustrano il successo dell'acquisizione su piani coronali completi ed evidenziano insidie comuni come la scarsa qualità dell'iniezione, gli artefatti da movimento e l'aberrazione indotta dal cranio. Il protocollo è compatibile sia con studi trasversali che longitudinali ed è particolarmente adatto per studiare le alterazioni cerebrovascolari in modelli di invecchiamento, ictus, aneurisma e malattie neurodegenerative. Combinando la penetrazione in profondità, l'elevata risoluzione spazio-temporale e l'imaging vascolare senza marcatura, l'ULM offre un potente strumento per l'analisi non invasiva della microcircolazione cerebrale nei modelli preclinici.

Introduzione

Sebbene il cervello rappresenti solo il 2% della massa corporea, consuma circa il 20% dell'ossigeno e del glucosio per sostenere^l'attività neuronale. Questa elevata richiesta metabolica è soddisfatta da un'intricata rete vascolare, dalle grandi arterie e vene ai microvasi come arteriole, venule e capillari, regolata attraverso l'accoppiamento neurovascolare². L'interruzione di questo processo finemente sintonizzato è stata implicata in un ampio spettro di disturbi neurologici. Il disaccoppiamento neurovascolare, ad esempio, è una caratteristica patologica precoce in malattie come l'Alzheimer, il Parkinson, l'Huntington e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), spesso precedendo i classici segni distintivi della neurodegenerazione come l'amiloide-beta e la patologia tau 3,4,5,6. L'imaging della natura complessa del cervello in vivo è stato quindi di primaria importanza per affrontare la crescente necessità di comprendere i processi fisiologici. I progressi tecnologici hanno fornito capacità uniche per sondare la funzione e l'attività cerebrale, sia direttamente che indirettamente, con maggiore precisione, risoluzione e accessibilità.

L'ecografia Doppler è emersa come un potente strumento per la misurazione funzionale dell'attività cerebrale utilizzando il flusso sanguigno⁷. In particolare, l'imaging power Doppler, progettato per rilevare il movimento dei globuli rossi (RBC), trasmette impulsi ultrasonici ripetuti ai vasi sanguigni e registra l'ampiezza degli echi ultrasonici retrodiffusi dai globuli rossi in movimento⁸. L'avvento dell'ecografia ultraveloce, in particolare dell'ecografia funzionale (fUS), ha segnato un punto cruciale nel superamento dei limiti precedenti. Infatti, l'ecografia convenzionale scansiona i tessuti linea per linea, un approccio sequenziale che limita la sua applicazione alle principali arterie cerebrali, poiché i flussi sanguigni lenti tipici della microvascolarizzazione del cervello non possono essere rilevati⁹. La più recente tecnica fUS utilizza più trasmissioni a onda piana per acquisire migliaia di fotogrammi al secondo, migliorando notevolmente sia la risoluzione temporale che il rapporto segnale/rumore (SNR). Fondamentalmente, la fUS consente il rilevamento di cambiamenti emodinamici in vasi molto piccoli con velocità fino a 1 mm/s, supportando l'imaging funzionale in tempo reale dell'attività cerebrale fino al livello delle arteriole⁸.

Sebbene i metodi Doppler ultraveloci abbiano migliorato significativamente l'imaging microvascolare, sono ancora limitati dalla risoluzione limitata dalla diffrazione degli ultrasuoni¹⁰. In tandem con fUS, la microscopia di localizzazione a ultrasuoni (ULM) supera questo ostacolo, consentendo la visualizzazione delle strutture microvascolari a livello capillare sfruttando agenti di contrasto e algoritmi di localizzazione ad alta precisione¹¹. Ciò fornisce informazioni senza precedenti sulla morfologia e la funzione vascolare. Più specificamente, nell'ULM, gli agenti di contrasto costituiti da microbolle riempite di gas stabilizzate, di circa 1-3 μm di diametro, vengono iniettati nel flusso sanguigno. Agiscono come potenti diffusori acustici che possono essere rilevati come singole sorgenti puntiformi. Dato che le microbolle sono significativamente più piccole della lunghezza d'onda degli ultrasuoni, possono essere isolate spazialmente e temporalmente, apparendo come la funzione di diffusione puntiforme (PSF) del sistema. Ispirata alle tecniche di super-risoluzione ottica come STORM e PALM, la localizzazione sub-pixel di queste microbolle si ottiene utilizzando metodi di deconvoluzione che mappano le loro posizioni con alta precisione 10,12,13,14. Ciò consente di risolvere le strutture vascolari con una risoluzione spaziale di 5-10 μm, ben oltre il limite imposto dalla diffrazione dell'imaging Doppler di potenza a ultrasuoni ultraveloci convenzionali.

L'ULM è uno strumento potente ed efficace per la mappatura vascolare fino alla scala capillare e supera i limiti di molti metodi ottici che sono limitati agli strati superficiali. La sua capacità di eseguire l'imaging microvascolare negli animali vivi, consentendo studi longitudinali e farmacologici, è un altro vantaggio chiave dell'ULM rispetto ad altre tecniche che richiedono la fissazione e la colorazione del cervello. Le informazioni estratte vanno oltre le mappe vascolari statiche, fornendo stime quantitative del flusso sanguigno fino al livello dei capillari, aprendo così strade promettenti sia per applicazioni precliniche che cliniche. Per facilitare la riproducibilità, descriviamo un flusso di lavoro completo per l'imaging cerebrale basato su ULM nei roditori, implementato utilizzando una piattaforma di imaging ecografico funzionale standardizzata progettata per la ricerca preclinica.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo studio sono state condotte in conformità con la Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 22 settembre 2010 (010/63/UE) e approvate dal comitato etico locale (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', project #2020-16). Gli esperimenti sono stati condotti su topi maschi adulti C57BL/6 Rj (2 mesi, 20-30 g) e ratti Sprague-Dawley Rj:Han (200-300 g) di provenienza commerciale. Gli animali sono stati alloggiati in gruppi di quattro persone per gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore, con una temperatura costante di 22 °C e con cibo e acqua forniti ad libitum. Prima dell'inizio degli esperimenti, tutti gli animali sono stati sottoposti a un periodo di acclimatazione minimo di una settimana alle condizioni di stabulazione. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli animali

1. Anestesia e preparazione animale nei topi
   1. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'isoflurano, somministrando isoflurano al 2% con aria (0,075 L/min) e ossigeno (0,175 L/min o aria medica).
   2. Dopo 5 minuti di induzione dell'anestesia, trasferire l'animale nel telaio stereotassico, che viene posizionato su un termoforo impostato a 37 °C per mantenere la temperatura corporea, e garantire l'erogazione continua di isoflurano tramite una maschera alla stessa concentrazione e portata.
   3. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia controllando l'assenza di riflessi in risposta a un pizzicamento del dito del piede o della coda esercitando una pressione decisa ma non dannosa. Se è presente un riflesso, aumentare leggermente la concentrazione di isoflurano. Rivalutare prima di procedere.
   4. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la formazione della cataratta.
   5. Radere la testa del mouse usando un rifinitore. Applicare una crema depilatoria, lasciare agire per 1-1,5 minuti, quindi risciacquare con acqua tiepida e asciugare con una garza. Ripetere se necessario fino a rimuovere tutti i peli. Evitare di lasciare la crema depilatoria per periodi di tempo più lunghi, poiché potrebbe causare danni chimici alla pelle.
   6. Applicare il gel centrifugato per ultrasuoni (senza bolle, degassato) sulla testa per garantire l'accoppiamento acustico.
2. Anestesia e preparazione animale nei ratti
   1. Dopo aver pesato il ratto, somministrare un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) utilizzando una siringa da 1 ml. Radere il pelo sulla parte superiore della testa e pulire la pelle con una soluzione di iodio.
      NOTA: La ketamina è una sostanza altamente regolamentata in molti paesi e può richiedere un'autorizzazione speciale per l'approvvigionamento e l'uso. Regimi anestetici alternativi possono essere utilizzati per ottenere un'anestesia a livello chirurgico.
   2. Posizionare l'animale su un apparecchio stereotassico posizionato sopra un termoforo impostato a 37 °C per mantenere la temperatura corporea. Applicare una generosa quantità di unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza e la formazione di cataratta.
   3. Iniettare per via sottocutanea meloxicam (2 mg/kg) utilizzando una siringa da 1 ml per l'analgesia intraoperatoria.
   4. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia controllando l'assenza di riflessi in risposta a un pizzicamento del dito del piede o della coda utilizzando una pressione decisa ma non dannosa. Se è presente un riflesso, somministrare una dose aggiuntiva pari a un quarto della dose iniziale di anestetico. Attendere circa 5 minuti prima di rivalutare la profondità dell'anestesia. Procedere solo una volta che viene confermato un piano chirurgico di anestesia e rivalutare ogni 20-30 minuti.
   5. Praticare un'incisione longitudinale lungo la sutura sagittale utilizzando un bisturi, assicurandosi che il taglio sia abbastanza profondo da includere la pelle e i tessuti connettivi attaccati al cranio.
   6. Mantenere i tessuti circostanti ben idratati durante l'intervento chirurgico utilizzando la soluzione fisiologica.
   7. Usando un trapano rotante, traccia leggermente il contorno della finestra cranica segnando lo strato superficiale del cranio. Per un accesso ottimale al cervello, la finestra dovrebbe essere di circa 14 mm nella dimensione laterale e di almeno 2 mm nella dimensione anteroposteriore, a seconda delle dimensioni del cranio.
   8. Continuare a fresare lungo il contorno fino a quando non rimane più resistenza ossea. Durante la perforazione, applicare periodicamente alcune gocce di soluzione fisiologica per raffreddare l'osso e ridurre al minimo i danni termici. Una spatola sottile e arrotondata deve essere facilmente inserita nella fessura senza forzare.
   9. Usando brevi movimenti di alesatura unidirezionali, assottigliare l'ultimo strato di osso fino a quando la resistenza è appena percettibile.
   10. Inserire una spatola sottile, leggermente curva, con bordi arrotondati sul bordo laterale della finestra cranica.
   11. Muovi lentamente la spatola verso il centro, staccando delicatamente l'osso dalle meningi. Una volta che non si avverte resistenza, sollevare e rimuovere completamente il pezzo di osso staccato.
   12. Applicare il gel per ultrasuoni centrifugato sopra la dura. Una descrizione della configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Figura 1: Schema della configurazione sperimentale per l'imaging cerebrale ULM nei roditori. Il sistema di imaging è costituito da un'unità di acquisizione ad ultrasuoni collegata ad una sonda ad alta frequenza montata su uno stadio di posizionamento motorizzato. Sia i topi che i ratti sono mostrati in fotogrammi stereotassici: il topo presenta un cuoio capelluto rasato per l'imaging transcranico, mentre il ratto viene sottoposto a imaging attraverso una finestra cranica preparata chirurgicamente. In entrambe le specie viene posizionato un catetere della vena caudale per l'iniezione di mezzo di contrasto. Questa configurazione consente l'acquisizione stabile di dati ecografici funzionali ad alta risoluzione durante l'iniezione di microbolle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Cateterismo della vena caudale
   1. Utilizzare un set per infusione alato da 27 G × 1/2" collegato a un ago da 18 G × 1/2" con tubo da 8". Accorciare il tubo, se possibile, per ridurre al minimo il volume morto.
   2. Ruotare delicatamente la coda dell'animale di 90 gradi per esporre le vene laterali della coda (vedi Figura 2). Fissare la coda in posizione con del nastro adesivo per garantire la stabilità ed evitare movimenti non necessari durante il cateterismo.
   3. Identificare la vena caudale iniziando dall'estremità distale (punta della coda) e spostandosi verso la base. Per facilitare questo passaggio, la coda può essere riscaldata con acqua tiepida per favorire la vasodilatazione e migliorare la visibilità delle vene.
   4. Usando un dito, applicare una leggera pressione alla base della coda e farla scorrere verso il sito di iniezione (cioè contro la direzione del flusso sanguigno). Questa manovra impedisce temporaneamente il ritorno venoso, provocando la distensione e l'aumento delle vene caudali, facilitando l'inserimento del catetere.
   5. Inserire l'ago da 27 G × 1/2" del set per infusione alato parallelamente alla vena, assicurandosi che lo smusso sia rivolto verso l'alto.
   6. Osservare il tubo per la presenza di ritorno di fiamma di sangue, che conferma il corretto posizionamento dell'ago.
      NOTA: Iniziare il cateterismo all'estremità della coda distale per evitare perdite dovute a punture precedenti durante le iniezioni successive. Se il cateterismo della vena caudale si rivela impegnativo o infruttuoso, possono essere prese in considerazione vie centrali alternative. Questi includono il seno retro-orbitale, la vena giugulare o la vena safena.

Figura 2: Anatomia della sezione trasversale della coda del roditore che illustra i punti di riferimento vascolari per il cateterismo. Un disegno schematico di una sezione trasversale attraverso la coda distale del roditore, che mostra le posizioni relative dei principali vasi sanguigni. Vicino alla linea mediana sono presenti due arterie: l'arteria caudale dorsale, situata nella regione superiore (dorsale), e l'arteria caudale ventrale, posizionata nella parte inferiore (ventrale) della sezione trasversale della coda. Queste arterie sono in genere evitate durante le procedure endovenose. Ai lati delle arterie ci sono le vene caudali, che corrono simmetricamente su entrambi i lati e si trovano appena sotto la pelle, rendendole i siti di accesso preferiti per il cateterismo o l'iniezione di microbolle. Questa panoramica anatomica aiuta nella localizzazione precisa delle vene, soprattutto se potenziata dal riscaldamento per favorire la vasodilatazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Posizionamento della sonda tramite il software IcoScan
   1. Sulla piattaforma di acquisizione, avviare il software di acquisizione fUS (ad esempio, IcoScan per Iconeus One) e creare una sessione di esperimento. Regolare la posizione della sonda ecografica.
      NOTA: Posizionare la sonda a circa 1 mm sopra la testa dell'animale. Assicurarsi che la sonda sia a contatto con il gel per ultrasuoni prima di iniziare qualsiasi sequenza di imaging.
   2. Avviare l'acquisizione Live View e regolare la posizione della sonda in base alle esigenze utilizzando l'imaging del volume del sangue cerebrale (CBV) in tempo reale. Il cervello dovrebbe essere centrato sull'immagine. Ottimizza i parametri di imaging, come il contrasto e la compressione, per migliorare la qualità della visualizzazione.
   3. Aprire il menu Angio3D nel software di acquisizione. Regola i parametri di scansione (Prima fetta, Ultima fetta e Dimensione passo), assicurandoti che coprano l'intero cervello. Inizia l'acquisizione.
      NOTA: Quando si impostano i parametri di scansione, assicurarsi che la scansione copra la parte posteriore del cervello, vale a dire l'intera arteria posteriore.
   4. Tenere aperto il software di acquisizione e avviare il software IcoStudio per l'analisi e la visualizzazione dei dati. Caricare la scansione Angio3D .
   5. Vai al pannello Brain Registration e registra la scansione nel Common Coordinate Framework di Allen Mouse utilizzando la modalità di registrazione completamente automatica o manuale.
   6. Salvare la registrazione come file .bps.
   7. Quindi, vai al menu Brain Navigation . Nel pannello Gestione atlante , utilizzare il navigatore ad albero Padre/Figlio per sfogliare l'Atlante Allen Mouse Brain. Seleziona le regioni anatomiche mirate, che verranno sovrapposte alla scansione nel pannello a 3 visualizzazioni.
   8. Scegliere un piano di imaging che si sovrapponga alle regioni di interesse. Impostare manualmente due marcatori nella vista coronale per definire la fetta di imaging mirata.
   9. Fare clic sul Brain Positioning System (BPS) per estrarre le coordinate motorie corrispondenti alla posizione della sonda per l'imaging del piano selezionato. Controlla l'anteprima dell'immagine, calcolata dalla scansione Angio3D, e fai clic su Copia coordinate BPS.
   10. Passare al software IcoScan e aprire il pannello Posizionamento sonda . Fare clic su Inserisci coordinate BPS e incollare i valori estratti nel passaggio 1.4.9. La sonda si sposterà e si allineerà automaticamente con il piano di imaging selezionato.
   11. Eseguire un'acquisizione Live View per verificare che il piano di imaging corrente corrisponda al piano previsto dal passaggio 1.4.8.
       NOTA: Salvando e riutilizzando gli stessi marcatori spaziali, il piano di imaging può essere ridefinito in modo coerente tra le sessioni, consentendo un riposizionamento accurato della sonda per gli studi longitudinali.

2. Acquisizione ULM

1. Preparazione microbolle
   NOTA: È possibile utilizzare una varietà di agenti di contrasto per ultrasuoni disponibili in commercio. Tuttavia, la composizione del gas, la concentrazione delle bolle, il diametro e la stabilità possono variare a seconda del prodotto utilizzato. Si prega di seguire le raccomandazioni del produttore per quanto riguarda la preparazione e la conservazione.
   1. Utilizzando una siringa sterile, iniettare 5 mL di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% nel flaconcino attraverso il setto.
      NOTA: Per somministrazioni ripetute in bolo o infusione continua, è possibile utilizzare un volume inferiore di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% per preparare una sospensione di microbolle più concentrata. Regolare il fattore di diluizione di conseguenza in base all'applicazione prevista.
   2. Agitare energicamente la fiala per 20 s per risospendere completamente le microbolle e ottenere una dispersione uniforme.
2. Registrazione ULM
   1. Predefinisci i parametri di registrazione, tra cui la sequenza di ultrasuoni, la frequenza dei fotogrammi e il tempo di registrazione totale.
      NOTA: I parametri consigliati per la registrazione sono 5-10 minuti a 2,5 Hz.
   2. Aspirare il volume delle microbolle da iniettare e iniziare l'acquisizione. Una volta avviata l'acquisizione, procedere con l'iniezione di microbolle. Si raccomanda di iniettare 200 μl per i ratti e 100 μl per i topi, alla diluizione appropriata.
   3. Confermare il miglioramento del contrasto sull'immagine Live View. Subito dopo, sciacquare le microbolle rimanenti nel volume morto iniettando fluido fisiologico nel catetere. Un tipico esempio di profilo di intensità delle microbolle è mostrato nella Figura 3.
   4. Attendi il completamento dell'acquisizione e salva i dati.
   5. Al termine dell'acquisizione, procedere come segue, a seconda del protocollo utilizzato:
      1. Per i topi (protocollo non invasivo): invertire l'anestesia interrompendo la somministrazione di isoflurano e monitorare l'animale durante il recupero in un ambiente caldo fino al completo risveglio.
      2. Per i ratti (protocollo invasivo con finestra cranica): sopprimere l'animale mediante iniezione intraperitoneale di Euthasol (pentobarbital sodico, 140 mg/kg), in conformità con le linee guida istituzionali ed etiche.

Figura 3: Intensità del segnale delle microbolle nel tempo. (A) Illustrazione della regione di interesse (ROI) utilizzata per l'estrazione del segnale, che comprende l'intera fetta di cervello coronale. (B) Andamento temporale dell'intensità del segnale delle microbolle durante un'acquisizione di 5 minuti. Il bolo a microbolle è stato iniettato a 30 s, determinando un caratteristico aumento dell'ampiezza del segnale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Ricostruzione dell'immagine con il software IcoLab

1. Apri IcoLab e naviga su ULM facendo clic sulla scheda ULM nella parte più a sinistra dello schermo.
2. Fare clic su Calcola mappe ULM per avviare il flusso di lavoro di elaborazione, come descritto in dettaglio nella Figura 4.
3. Selezionare la cartella di origine contenente i dati acquisiti.
4. Scegliere la scansione specifica da elaborare e regolare i limiti del tempo di elaborazione, se necessario.
5. Fare clic su Avanti per procedere alla fase di reporting. Nel passaggio Report, configura il percorso della cartella di output in cui verranno salvati i file elaborati. Imposta i parametri di visualizzazione per le immagini che verranno incluse nel report PowerPoint.
6. Rivedere il riepilogo delle opzioni selezionate visualizzato nella schermata finale.
7. Quando sei pronto, fai clic su ESEGUI per avviare l'elaborazione. Una volta completata l'elaborazione, verrà generato un file .trk, contenente tutte le coordinate delle microbolle localizzate, insieme ai file TIFF rasterizzati per densità, velocità e ampiezza retrodiffusa (BSA).
   NOTA: Un'acquisizione di 5 minuti può richiedere diverse ore di elaborazione. È meglio eseguire questo passaggio durante la notte o su una workstation dedicata.
   1. Generazione di mappe di densità delle microbolle: le posizioni localizzate di tutte le microbolle rilevate vengono accumulate nel tempo di acquisizione selezionato. Mappa queste posizioni su una griglia spaziale a risoluzione fissa.
      NOTA: ogni pixel nella mappa di densità risultante riflette il conteggio delle microbolle localizzate all'interno di quel contenitore spaziale. L'output finale è un'immagine in scala di grigi (TIFF) in cui l'intensità dei pixel corrisponde all'occupazione del vaso, consentendo la ricostruzione ad alta risoluzione della rete vascolare.
   2. Generazione di mappe di velocità: il software tiene traccia delle singole microbolle attraverso fotogrammi consecutivi per formare traiettorie. Per ogni traiettoria, il software calcola un vettore di velocità dividendo lo spostamento per il tempo trascorso (ottenendo un vettore di velocità in mm/s).
      NOTA: È possibile generare due tipi di mappe di velocità: mappe di velocità assolute, in cui ogni pixel memorizza l'entità della velocità media delle microbolle che lo attraversano, e mappe di velocità direzionali, in cui la velocità viene scomposta lungo un asse anatomico scelto (ad esempio, x o z) e viene memorizzato il corrispondente componente con segno. Queste mappe vengono rasterizzate sulla stessa griglia spaziale e salvate come singole immagini TIFF.
   3. Generazione di mappe BSA: per ogni microbolla localizzata, viene visualizzata l'ampiezza del segnale ultrasonico grezzo (intensità retrodiffusa). Proietta queste ampiezze sulla griglia spaziale, accumulando l'intensità del segnale in ogni pixel. La mappa BSA risultante evidenzia le regioni in cui le microbolle sono passate attraverso l'area focale del raggio, fornendo un contrasto che completa le mappe di densità e velocità¹⁵.

Figura 4: Diagramma di flusso della pipeline di elaborazione per la ricostruzione della mappa ULM. La figura illustra le fasi di elaborazione sequenziali eseguite nel software di analisi per generare mappe ULM a partire da dati ecografici grezzi. A partire da frame composti (n = 200), il passaggio 1 applica il filtraggio del clutter SVD (Singular Value Decomposition) per isolare i segnali di microbolle (MB) dallo sfondo tissutale. Nel passaggio 2, i segnali MB subiscono l'interpolazione di Lanczos, risultando in una pila di immagini pre-elaborata. La fase 3 esegue il rilevamento dei massimi locali e li correla con la funzione di diffusione dei punti (PSF) del sistema per identificare le posizioni delle microbolle candidate. Nella fase 4, la localizzazione dei subpixel (rilevamento del centroide) e il tracciamento delle particelle vengono utilizzati per estrarre le traiettorie delle microbolle, da cui vengono calcolate le mappe di velocità e ampiezza retrodiffusa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Visualizzazione dei dati con il software IcoStudio

1. Carica un file .trk in IcoStudio per iniziare l'esplorazione dei dati.
2. Regola i parametri di visualizzazione come contrasto, compressione e mappa dei colori nel pannello laterale destro per perfezionare la rappresentazione dei dati.
3. Imposta il tempo di integrazione utilizzando il doppio cursore nella parte inferiore della vista principale per definire i fotogrammi di inizio e fine.
4. Aprire la scheda Densità per visualizzare le occorrenze delle microbolle e selezionare tra Densità assoluta (conteggio per pixel) e Densità direzionale (ponderata assialmente).
5. Utilizzare la scheda Velocità per visualizzare la velocità delle microbolle in mm/s in diverse modalità: Assoluta, Direzionale, Assiale e Laterale. Regola le soglie di contrasto, compressione e velocità per migliorare la visualizzazione.
6. Esplora la scheda BSA per visualizzare la riflettività delle microbolle, fornendo un meccanismo di contrasto alternativo che evidenzia le strutture microvascolari e il movimento fuori dal piano. Esporta schermate PNG ad alta risoluzione o genera file TIFF per l'analisi quantitativa con impostazioni personalizzabili di dimensioni in pixel e tipo di dati.

Risultati

Gli esempi rappresentativi in Figura 5 mostrano un tipico esempio di dati ULM di un cervello di ratto acquisiti in 1 minuto di registrazione dopo 200 μL di iniezione in bolo di microbolle, con una risoluzione di 10 μm.

Figura 5: Output rappresentativi di ULM acquisiti da un ratto craniotomizzato dopo una singola iniezione di microbolle. Esempi di mappe della densità delle microbolle (MB) (a sinistra), della velocità (al centro) e dell'ampiezza retrodiffusa (a destra) sono mostrate per una fetta di cervello coronale completa, acquisita in 1 minuto di registrazione a seguito di un'iniezione in bolo di 200 μL di microbolle. Barra della scala: 2 mm. I riquadri ingranditi evidenziano la microvascolarizzazione corticale sinistra (barra della scala: 0,5 mm). La mappa della densità riflette la distribuzione spaziale delle occorrenze di MB, rivelando la struttura della rete vascolare. La mappa della velocità illustra la velocità del flusso e la direzionalità dei singoli MB, consentendo la differenziazione tra i tipi di recipienti. La mappa dell'ampiezza mostra il segnale ultrasonico retrodiffuso dagli MB, fornendo un meccanismo di contrasto aggiuntivo che migliora la visualizzazione della morfologia del vaso e del movimento fuori dal piano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le mappe risultanti illustrano tre punti di vista complementari della microvascolarizzazione cerebrale: densità delle microbolle (MB) (a sinistra), velocità (al centro) e ampiezza retrodiffusa (a destra). Ogni mappa corrisponde a una fetta coronale completa del cervello, con inserti ingranditi che evidenziano la microvascolarizzazione corticale sinistra (barre della scala: 2 mm e 0,5 mm, rispettivamente).

La mappa della densità mostra la distribuzione spaziale delle occorrenze MB nel campo visivo. La morfologia dei vasi si risolve molto al di sotto del limite di diffrazione, rivelando sia vasi di grandi dimensioni che strutture capillari fini. Questo tipo di mappa consente una chiara visualizzazione della topologia della rete vascolare, comprese le biforcazioni e i modelli di ramificazione, anche nelle regioni corticali profonde.

La mappa della velocità mostra la velocità del flusso dei singoli MB proiettati lungo la direzione assiale (z). Questa proiezione produce valori di velocità con segno, dove le velocità negative riflettono il flusso verso l'alto nella corteccia e i valori positivi riflettono il flusso verso il basso. Nella corteccia cerebrale dei roditori, l'architettura vascolare è altamente stereotipata: le arteriole penetranti scendono dalla superficie piale negli strati corticali, mentre le venule risalgono dalla corteccia verso la superficie per drenare il sangue deossigenato¹⁶. Questa disposizione anatomica coerente consente l'uso di misurazioni della velocità direzionale per distinguere tra i tipi di vasi, con velocità assiali positive che indicano tipicamente il flusso arterioso e velocità negative che indicano il drenaggio venoso. Nel complesso, i valori di velocità misurati con ULM sono coerenti con gli intervalli precedentemente riportati in letteratura^10,17, che vanno da 10-20 mm/s nelle arteriole penetranti a diversi centimetri al secondo nelle principali arterie intracraniche. Questi risultati sono in linea con le precedenti osservazioni secondo cui le microbolle che scorrono imitano da vicino il comportamento reologico dei globuli rossi¹⁸, convalidando l'uso dell'ULM per quantificare la dinamica fisiologica del flusso sanguigno su microscala.

La mappa dell'ampiezza retrodiffusa (BSA) fornisce una rappresentazione spaziale dell'intensità del segnale ultrasonico restituita da ciascun MB. Poiché l'energia retrodiffusa è massimizzata quando gli MB passano attraverso la regione focale, questa mappa offre un contrasto basato sulla posizione elevativa. Aiuta a perfezionare la segmentazione identificando il movimento fuori dal piano o i vasi di bassa ampiezza, in particolare a profondità maggiori o vicino ai bordi focali. Le mappe BSA sono utili anche per rilevare l'attenuazione del segnale correlata alla profondità o identificare discrepanze nell'allineamento focale¹⁵.

Per dimostrare la riproducibilità del targeting del piano con il sistema di posizionamento cerebrale, la Figura 6A mostra le mappe di densità vascolare ULM acquisite nello stesso topo in anestesia il giorno 0 (settimana 1) e il giorno 7 (settimana 2), mirate allo stesso piano coronale. La sovrapposizione di entrambe le mappe mostra una forte corrispondenza spaziale del segnale vascolare, confermando la precisione del riposizionamento del piano e l'affidabilità degli esperimenti longitudinali, come precedentemente mostrato¹⁹.

L'analisi quantitativa può essere applicata a uno qualsiasi di questi output. Ad esempio, gli utenti possono segmentare i vasi utilizzando soglie di intensità o algoritmi di clustering, quindi estrarre statistiche regionali come la densità dei vasi, la velocità media del flusso e i parametri morfometrici tra cui il raggio dei vasi, la lunghezza media, il numero di rami e altri descrittori strutturali della rete vascolare. I confronti tra regioni corticali o gruppi sperimentali (ad esempio, iniettato con farmaco vs. controllo) possono essere eseguiti direttamente su queste mappe o attraverso statistiche parametriche derivate su vasi comunemente identificati^20,21. Come esempio di tale analisi, abbiamo eseguito quantificazioni regionali dei parametri vascolari nella corteccia somatosensoriale sinistra (S1BF, Figura 6B) e nel talamo sinistro (Figura 6C). Le mappe di densità sono state prima binarizzate, scheletrate e i raggi delle navi sono stati stimati utilizzando una trasformata di distanza euclidea. Le velocità di flusso sono state ottenute direttamente dalle traiettorie MB e la velocità di flusso è stata derivata dal raggio del recipiente utilizzando la legge di Poiseuille, come precedentemente descritto²¹. In questo caso è stata applicata la stessa metodologia descritta in tale studio. I grafici dei baffi mostrano le distribuzioni del raggio, della velocità e della portata del recipiente per d0 e d7, dimostrando una buona riproducibilità tra le sessioni. Insieme, questi output ULM multimodali consentono una caratterizzazione completa della rete microvascolare del cervello, offrendo intuizioni sia anatomiche che dinamiche con una risoluzione senza precedenti.

Figura 6: Riproducibilità longitudinale del targeting del piano ed esempio di quantificazioni vascolari utilizzando il Brain Positioning System. (A) Mappe di densità vascolare ULM acquisite dallo stesso topo anestetizzato il giorno 0 (Settimana 1) e il giorno 7 (Settimana 2), mirando allo stesso piano coronale utilizzando il Brain Positioning System (barra della scala = 1 cm). La sovrapposizione di entrambe le mappe mostra una forte corrispondenza spaziale del segnale vascolare, illustrando la riproducibilità del posizionamento del piano tra le sessioni. (B,C) Quantificazione rappresentativa di parametri vascolari estratti da due regioni di interesse: corteccia somatosensoriale sinistra (S1BF, B) e talamo sinistro (C). Per ogni regione, mostriamo la mappa della densità vascolare a d0 (barra della scala = 0,5 cm), insieme a grafici dei baffi che mostrano la distribuzione del raggio del vaso (μm), la velocità del flusso (mm/s) e la velocità del flusso (mm³/s) a d0 e d7 (mediana, 25°-75° percentile, baffi = 1,5×IQR, valori anomali tracciati individualmente). Questi risultati illustrano la capacità della pipeline di estrarre metriche morfometriche ed emodinamiche dai dati ULM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La microscopia di localizzazione ecografica (ULM) rappresenta un progresso trasformativo nell'imaging a ultrasuoni, consentendo la visualizzazione a super-risoluzione della microvascolarizzazione oltre il limite di diffrazione convenzionale. Questa discussione evidenzia i passaggi critici del protocollo ULM, affronta le potenziali modifiche e le strategie di risoluzione dei problemi, esplora i limiti del metodo, ne valuta l'importanza rispetto alle modalità di imaging alternative e ne considera l'importanza e le potenziali applicazioni nella ricerca biomedica.

Passaggi critici nel protocollo ULM

Diversi passaggi sono cruciali per il successo dell'implementazione dell'ULM e la loro influenza è illustrata nella Figura 7. Uno dei passaggi più importanti è la somministrazione di microbolle, poiché sia la concentrazione che la qualità dell'erogazione influenzano direttamente i risultati dell'imaging. Una concentrazione ottimale è necessaria per bilanciare la risoluzione spaziale e la rilevabilità. Un'erogazione inadeguata, come un cattivo posizionamento del catetere o lo stravaso, può portare a un segnale vascolare molto basso e a ricostruzioni incomplete, come mostrato nella Figura 7B, dove solo un numero sparso di microbolle raggiunge il flusso sanguigno. L'imaging ad alta frequenza di fotogrammi, in genere nell'ordine dei kilohertz, è essenziale per catturare il rapido movimento delle microbolle e consentire un tracciamento affidabile tra i fotogrammi. Qualsiasi instabilità durante l'acquisizione, come il movimento introdotto dalla respirazione, la scarsa fissazione o l'anestesia insufficiente, può degradare l'accuratezza della localizzazione. Un esempio di ciò è illustrato nella Figura 7C, dove un movimento eccessivo durante l'acquisizione si traduce in una mappa di densità sfocata e inutilizzabile.

La localizzazione e il tracciamento delle microbolle dipendono da algoritmi avanzati di elaborazione delle immagini che rilevano le singole bolle, eseguono la localizzazione dei subpixel e ricostruiscono le traiettorie con precisione di sub-diffrazione. Anche con un'acquisizione e un'elaborazione adeguate, fattori anatomici come le aberrazioni indotte dal cranio possono comunque influenzare la qualità dell'immagine. Nell'imaging transcranico, in particolare nei topi più anziani, l'ispessimento del cranio può introdurre distorsioni acustiche. Ciò porta a caratteristici artefatti di ombreggiamento sotto la sutura sagittale, dove non vengono rilevate microbolle, come illustrato nella Figura 7D. Tali aberrazioni riducono il rapporto segnale/rumore e possono oscurare le strutture vascolari a meno che non vengano corrette con il filtraggio adattivo o perfezionando il posizionamento della sonda.

Quando tutti i passaggi sono stati eseguiti con successo, è possibile ottenere mappe ULM di alta qualità, come mostrato nella Figura 7A, in cui una rete vascolare densa e ben risolta viene ricostruita attraverso un approccio transcranico.

Figura 7: Esempi di riferimento e risoluzione dei problemi per la qualità dell'imaging ULM nei mouse. Il pannello (A) mostra una mappa di densità transcranica di microbolle ULM (MB) di alta qualità acquisita in un giovane topo adulto, che illustra il successo della mappatura vascolare su tutto il piano coronale. Il pannello (B) mostra un esempio di scarso segnale vascolare dovuto allo stravaso di microbolle o all'accesso venoso insufficiente, con conseguente scarsità di rilevamenti di MB. Il pannello (C) mostra un'acquisizione influenzata da un eccessivo movimento animale, producendo una mappa di densità sfocata e non interpretabile. Il pannello (D) evidenzia l'aberrazione acustica indotta dal cranio comunemente osservata nei topi più anziani, visibile come un cono d'ombra sotto la sutura sagittale dove non vengono rilevati MB a causa del ridotto rapporto segnale/rumore. Questi esempi fungono da riferimenti visivi per identificare e affrontare gli artefatti sperimentali comuni nell'imaging ULM. Barra della scala: 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Limitazioni del metodo

Nonostante i suoi numerosi vantaggi, l'ULM presenta limitazioni intrinseche che ne influiscono sull'applicabilità. La polarizzazione del vaso fuori dal piano è un problema significativo nell'imaging 2D, poiché i vasi che si estendono al di fuori del piano di imaging non vengono ricostruiti adeguatamente, portando a mappe vascolari incomplete. Questa limitazione può essere mitigata passando ad approcci di imaging volumetrico (^{3D) 22}, sebbene ciò aumenti la complessità computazionale. Anche le sfide del cateterismo endovenoso rappresentano un ostacolo, soprattutto nei modelli di piccoli animali, dove ottenere un'erogazione costante di microbolle può essere tecnicamente impegnativo. Anche la stabilità delle microbolle è un fattore limitante, soprattutto durante le sessioni di imaging prolungate. A causa della loro breve emivita di circolazione, le microbolle possono richiedere iniezioni ripetute in bolo o protocolli di infusione continua per mantenere un contrasto adeguato durante il periodo di acquisizione. Gli artefatti da movimento rimangono una preoccupazione significativa, in particolare per i soggetti svegli, dove anche piccoli movimenti involontari possono degradare l'imaging a super risoluzione. Infine, la penetrazione in profondità nell'ULM è intrinsecamente limitata dall'attenuazione degli ultrasuoni. Sebbene questo non sia generalmente problematico per l'imaging dei roditori ad alte frequenze (ad esempio, 15 MHz), diventa più impegnativo negli animali più grandi come i suini o i primati non umani. In questi casi, potrebbero essere necessarie sonde a bassa frequenza per ottenere una profondità di imaging sufficiente, ma ciò comporta una riduzione della risoluzione spaziale, sottolineando un compromesso chiave tra profondità e dettaglio che deve essere considerato quando si traduce l'ULM in modelli preclinici più grandi.

Importanza dell'ULM rispetto ai metodi esistenti

La microscopia di localizzazione ecografica (ULM) offre vantaggi sostanziali rispetto alle modalità di imaging convenzionali, in particolare nel contesto dell'imaging microvascolare. Tra i suoi punti di forza più notevoli c'è la capacità di superare il limite di diffrazione degli ultrasuoni tradizionali, ottenendo immagini di sub-diffrazione su scale spaziali paragonabili a tecniche ottiche come la microscopia a due fotoni. A differenza di questi metodi ottici, tuttavia, l'ULM fornisce una penetrazione più profonda dei tessuti, consentendo l'accesso a regioni cerebrali altrimenti difficili da visualizzare in modo non invasivo.

ULM offre anche funzionalità di imaging funzionale, consentendo la valutazione quantitativa della velocità del flusso sanguigno, della dinamica di perfusione e del rimodellamento vascolare. Queste caratteristiche lo rendono particolarmente adatto per studiare sia i processi fisiologici che i cambiamenti patologici nelle reti neurovascolari. Rispetto alla risonanza magnetica e alla PET, l'ULM è più economico, non richiede infrastrutture pesanti ed evita l'uso di agenti di contrasto con noti rischi di tossicità, affidandosi invece a microbolle riempite di gas con profili di sicurezza favorevoli.

La combinazione di un'elevata risoluzione spaziale e temporale rende l'ULM particolarmente prezioso per una vasta gamma di applicazioni di ricerca. È particolarmente potente negli studi mirati alle strutture microvascolari e ai nuclei cerebrali profondi, dove le modalità tradizionali spesso non sono all'altezza. Inoltre, a differenza degli approcci istologici che richiedono la fissazione e la colorazione dei tessuti, l'ULM consente l'imaging in tempo reale negli animali vivi, supportando disegni longitudinali e interventi dinamici come le sfide farmacologiche.

Oltre alla mappatura vascolare statica, l'ULM consente anche l'imaging funzionale ad alta risoluzione catturando le dinamiche del flusso sanguigno cerebrale con eccezionale precisione spaziale e temporale. Recenti progressi hanno dimostrato la sua fattibilità per il neuroimaging funzionale dell'intero cervello nei roditori, rivelando cambiamenti nel flusso sanguigno a livello capillare attraverso reti cerebrali distribuite² evocati da stimoli e dipendenti dall'attività spontanea. Ciò posiziona l'ULM come un potente strumento per gli studi funzionali, colmando efficacemente il divario tra l'imaging emodinamico a mesoscala e la mappatura dell'attività neuronale.

Considerazioni su usabilità, efficienza e riproducibilità

Il flusso di lavoro ULM descritto in questo protocollo è stato ottimizzato per facilitare l'implementazione e la riproducibilità in diverse configurazioni sperimentali. L'uso di componenti disponibili in commercio, tra cui microbolle approvate dalla FDA e dall'EMA e procedure standard di anestesia per roditori, garantisce un'ampia accessibilità. Inoltre, l'integrazione dell'intera pipeline di elaborazione all'interno del software dedicato (IcoLab) migliora notevolmente l'usabilità automatizzando passaggi complessi come la localizzazione delle microbolle, la ricostruzione delle traiettorie e la generazione delle mappe. Questa interfaccia semplificata riduce la necessità di codice personalizzato e riduce al minimo l'intervento dell'utente, supportando risultati coerenti tra utenti ed esperimenti. Mentre l'elaborazione ULM ad alta risoluzione è ad alta intensità di calcolo, soprattutto per lunghe acquisizioni o dati volumetrici, gli strumenti di elaborazione batch e l'accelerazione GPU riducono significativamente i tempi di analisi. Il design modulare del protocollo supporta anche la riproducibilità, consentendo ai ricercatori di mettere a punto i parametri di acquisizione ed elaborazione mantenendo un solido quadro analitico. Il protocollo include anche una sezione dedicata al posizionamento della sonda utilizzando IcoScan e IcoStudio, che consente agli utenti di riposizionare in modo affidabile la sonda nella stessa identica fetta di imaging tra le sessioni, con una precisione di circa 100 μm. Questa caratteristica è particolarmente preziosa per gli studi longitudinali, dove una precisa coerenza spaziale è essenziale per tracciare i cambiamenti vascolari nel tempo. Queste caratteristiche riducono collettivamente la barriera all'ingresso per i nuovi utenti e supportano l'implementazione scalabile di ULM sia negli studi di imaging esplorativi che in quelli longitudinali.

Conclusione

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro completo per l'implementazione della microscopia di localizzazione ecografica (ULM) nell'imaging del cervello dei roditori, che copre la preparazione chirurgica, la somministrazione di microbolle, l'acquisizione di immagini e la mappatura vascolare ad alta risoluzione utilizzando una piattaforma di acquisizione e analisi standardizzata ottimizzata per la ricerca preclinica. L'ULM rappresenta un importante progresso nell'imaging biomedico, offrendo una visualizzazione in vivo a super risoluzione della microvascolarizzazione con dettagli senza precedenti. Rispetto alle modalità di imaging esistenti, l'ULM offre una combinazione unica di alta risoluzione spaziale, quantificazione del flusso funzionale e accessibilità, che lo rende particolarmente adatto per gli studi sullo sviluppo vascolare, l'accoppiamento neurovascolare e la fisiopatologia della malattia. Con la continua maturazione della tecnologia, l'ULM è pronta a diventare una pietra miliare sia nella ricerca preclinica che, infine, nelle applicazioni di neuroimaging clinico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Regolatore di temperatura animale (piastra riscaldante abbinata a una sonda rettale)	Fisitempa	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, Francia	Antisedan	Soluzione iniettabile da 5 mg/mL
Mouse C57BL/6	Janvier Labs	SC-C57J-M	Maschio di topi C57BL/6Rj, 8 settimane
Trapano dentale	Foredom, USA	Kit Micromotore Rotativo ad Alta Velocità K.1070
Crema depilatoria	Vichy	N/A
Pomata per gli occhi	TVM, Regno Unito	Ocry-gel
Tagliacapelli	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
Software di elaborazione IcoLab (v 1.2.0.0)	Iconeus, Francia	IcoLab
Configurazione Iconeus One Xpand	Iconeus, Francia	IconeusOne Xpand
Sonda IcoPrime 15MHz	Iconeus, Francia	Sonda IcoPrime-15MHz
Software di acquisizione IcoScan (v1.9.0)	Iconeus, Francia	IcoScan
Software di analisi IcoStudio (v2.2.0)	Iconeus, Francia	IcoStudio
Soluzione di iodio	Mylan, Francia	N/A
Stazione di anestesia isoflurano	Minerve, Esternay, Francia	N/A
Ketamina	Virbac, Francia	Ketamina1000	Soluzione iniettabile da 100 mg/mL
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	Metacam	Soluzione iniettabile da 0,5 mg/mL
Aghi	Terumo, Francia	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” ago da 8" Tubi
Acqua salina	Laboratoire Gilbert Physiodose, Farmacia, Francia	N/A
Bisturi	DREXCO medical, Francia	80011
Microbolle SonoVue	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Spatola	Phymed, Francia.	Kit Micromotore Rotativo ad Alta Velocità K.1070
Sprague-Dawley Rj:Han rats	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - Maschi di ratti Sprague Dawley, 200-300 g
Fotogramma stereotassico	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Uso dell'adattatore del mouse  (Rif: 922) e Barre Auricolari Non Rotture (rif: 922)
Siringa	DREXCO medical, Francia	2058
Gel per ultrasuoni	DREXCO medical, Francia	Medi'Gel
Set infusione alata	Terumo, Francia	SV*27EL
Xylazine 2%	Bayer, Francia	Rompun	Soluzione iniettabile da 20 mg/mL