Articolo metodologico

Definizione di riprogrammazione xenofree di progenitori del sangue cordonale in cellule staminali pluripotenti e blastomero-simili indotte

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 agosto 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo delinea metodi chimicamente definiti per xenofree (XF), feeder-free (FF), riprogrammazione episomiale dei progenitori mieloidi del sangue cordonale umano (CB) in cellule staminali pluripotenti indotte umane convenzionali (hiPSC). Queste XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) possono essere efficacemente trasformate in cellule staminali naive regolate da blastomeri (TIRN-SC) con un aumento della differenziazione e un potenziale chimera interspecie.

Abstract

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La riprogrammazione del progenitore mieloide del sangue del cordone ombelicale umano (CB) in uno stato di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ad alta fedeltà può essere ottenuta utilizzando vettori episomiali non integranti e segnali stromali. Queste linee CB-hiPSC convenzionali innescate possono successivamente essere ripristinate chimicamente con elevata efficienza in uno stato di cellule staminali naive regolate da tankirasi/inibitori di PARP (TIRN-SC) simile al blastomero con totipotenza funzionale. Le TIRN-SC regolate da PARP sono cellule staminali umane con elevata plasticità epigenetica, impronte epigenomiche stabili e hanno una maggiore potenza di differenziazione rispetto alle hiPSC convenzionali innescate dal lignaggio. Qui, vengono delineati metodi XF/FF ottimizzati per un'efficiente riprogrammazione episomiale attivata dallo stroma mesenchimale dei progenitori mieloidi CD34+ CD33+ CB in hiPSC XF/FF convenzionale. La reversione TIRN ha potenziato in modo riproducibile l'hiPSC convenzionale XF/FF per adottare caratteristiche trascrizionali, epigenetiche e funzionali delle cellule embrionali umane in stadio di clivaggio con ridotta espressione genica innescata dal lignaggio. Abbiamo convalidato che la XF-hiPSC derivata da CB con ritorno a TIRN mostrava un marcato miglioramento nel differenziamento diretto multi-lineage (comprese le linee ematovascolari) in un ampio repertorio di background geneticamente indipendenti. Questi metodi rappresentano un primo passo per la generazione di linee TIRN-SC conformi alle cGMP per banche TIRN-SC (UTIRN-SC) di donatori "universali" HLA di livello clinico. La derivazione di linee UTIRN-SC con una migliore versatilità di differenziazione dai progenitori CD34+ CD33+ CB potrebbe avere un forte impatto sulla medicina rigenerativa. Ad esempio, le UTIRN-SC potrebbero generare banche di tessuti di progenitori cardiaci, vascolari e neurali definiti da HLA, crio-conservati per terapie cellulari complete multi-lineage "off-the-shelf".

Introduzione

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Sebbene le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) offrano opportunità promettenti per terapie cellulari personalizzate, la loro applicazione clinica deve affrontare sfide importanti, tra cui la tumorigenicità, l'immunogenicità e l'eterogeneità fenotipica e funzionale1, che influiscono sulla loro sicurezza, efficacia ed economicità. Inoltre, i progenitori impegnati nel lignaggio derivati da linee hiPSC convenzionali innescate sono generati con efficienze di differenziazione interlinea altamente variabili2 e mostrano un attecchimento e una funzionalità in vivo limitati. Tuttavia, tali limitazioni possono essere superate utilizzando metodi di riprogrammazione ottimizzati3 o stati alternativi delle cellule staminali 4,5.

Sebbene l'efficienza della riprogrammazione episomiale non virale delle cellule somatiche della pelle o del sangue in hiPSC sia bassa (~0,01%-2%)6, è possibile ottenere una riprogrammazione a quattro fattori altamente ottimizzata dei progenitori CB e può raggiungere fino al 50% di efficienza di massa in condizioni di co-coltura mesenchimali attivate da progenitori stromali staminali (MSC)7. In questo sistema, la riprogrammazione cellulare dei progenitori mieloidi CB è stata accelerata da segnali stromali solubili e dipendenti dal contatto. Le linee hiPSC derivate da CB episomiali innescate con stroma (SP) si differenziano in progenitori vascolari (VP) con efficienze più elevate rispetto alle hiPSC 3,5 convenzionali derivate da fibroblasti. Il VP derivato da SP-CB-iPSC ha mostrato un'identità trascrizionale VP embrionale più autentica, una ridotta senescenza e sensibilità al danno al DNA 3,4. Il VP derivato da SP-CB-iPSC ha anche dimostrato un attecchimento in vivo più robusto rispetto al VP convenzionale derivato da hiPSC dopo trapianto sistemico o diretto nel vitreo di topi adulti immunodeficienti danneggiati da ischemia retinica 3,4.

Zimmerlin et al. hanno stabilito un sistema di riprogrammazione chimica in due fasi ("LIF-5i -> LIF-3i") che trasferisce cellule staminali pluripotenti umane convenzionali innescate a uno stato TIRN-SC con un potenziale di differenziazione multi-lineage migliorato5. I progenitori vascolari differenziati derivati da TIRN-SC hanno mostrato una funzionalità più elevata, una maggiore stabilità genomica e un attecchimento in vivo superiore, come dimostrato dalla loro migliorata capacità di migrare e ri-vascolarizzare gli strati neurali profondi della retina ischemica4. TIRN-SC è stato sottoposto a riprogrammazione proteogenomica per acquisire uno stato funzionale ibrido simile al blastomero con un elevato contributo nel saggio interspecifico della chimera8. TIRN-SC ha mantenuto l'espressione di DNMT1 ed è stato protetto contro l'erosione nelle regioni di impronta genomica metilata CpG. È interessante notare che SP-CB-hiPSC sono stati reintegrati in TIRN-SC in modo più efficiente rispetto a quelli derivati da hiPSC tramite metodi alternativi e meno efficienti 5,9.

Pertanto, le TIRN-SC sono uno stato alternativo delle cellule staminali con una migliore capacità di differenziazione multi-lignaggio e un efficiente contributo della chimera. Ulteriore ottimizzazione di
La riprogrammazione TIRN-SC in condizioni di coltura definite e conformi alle cGMP faciliterà la generazione di un'ampia gamma di tipi di cellule e tessuti funzionali e imnestabili per le terapie. Per soddisfare la necessità di progenitori terapeutici economicamente vantaggiosi, questi metodi possono essere applicati per produrre banche di TIRN-SC (UTIRN-SC) di grado cGMP utilizzando CB ematopoietici CD34+ definiti da HLA o progenitori del sangue periferico. I progenitori derivati da UTIRN-SC definiti da HLA potrebbero soddisfare le esigenze di un numero maggiore di pazienti che richiedono una rigenerazione immediata e multi-lineage di tessuti complessi.

I paradigmi sviluppati per il trapianto clinico di midollo osseo (BMT) possono guidare lo sviluppo di banche UTIRN-SC da cellule staminali ematopoietiche parzialmente HLA-compatibili o HLA-aplo-identiche provenienti da registri nazionali di donatori. Un'analisi computazionale predittiva globale dei primi 10 aplotipi combinati provenienti da 18 paesi, inclusi gli Stati Uniti, fornirebbe una copertura media del 68,4% dei pazienti da tali "aplobanche" hiPSC10. Una banca UTIRN-SC definita potrebbe non solo fornire progenitori impegnati nel lignaggio, ma anche supportare applicazioni terapeutiche TIRN-SC di sistemi di complementazione di blastocisti interspecifici all'interno di animali domestici (ad esempio, suini) per la generazione di interi organi11,12, inclusa la generazione di progenitori ematopoietici che inducono tolleranza per ridurre il rigetto del trapianto in popolazioni con ampia diversità genetica (ad esempio, USA).

Questo protocollo di riprogrammazione modificato per la generazione di linee XF/FF hiPSC competenti per TIRN è un primo passo per lo sviluppo di futuri banchi UTIRN-SC conformi alle cGMP. Questo protocollo delinea la riprogrammazione e la validazione funzionale graduale dei progenitori mieloidi CB umani in linee XF-hiPSC convenzionali. Queste XF-hiPSC hanno dimostrato una facile reversione in TIRN-SC, con un'efficienza simile ai metodi non-XF7 e hanno raggiunto una pluripotenza funzionale illimitata, inclusa una migliore capacità di produrre teratomi ben formati con riduzione del bias di lineage (rispetto a XF-hiPSC innescato isogenico)4,5,9. Descriviamo anche i protocolli che convalidano XF-hiPSC con ritorno TIRN per la loro migliore e robusta differenziazione diretta in linee ematovascolari.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti di riprogrammazione sono conformi alle linee guida pubblicate dalla National Academy of Sciences e dalla International Society of Stem Cell Research (ISSCR). Per la generazione di hiPSC, i protocolli di raccolta delle cellule del donatore e il consenso informato del donatore sono stati approvati dalla supervisione dell'Institutional Review Board (IRB) della Johns Hopkins University (JHU). Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto la supervisione istituzionale della ricerca sulle cellule staminali (ISCRO) della JHU e sono conformi agli standard istituzionali relativi al consenso informato e alla valutazione della provenienza. Inoltre, tutte le procedure chirurgiche e di uso degli animali sono state eseguite in conformità con i protocolli approvati dal JHU Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti gli esperimenti che coinvolgono procedure su animali (ad esempio, iniezioni sottocutanee/intramuscolari di NOD. I topi Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) per l'analisi del teratoma e il trasferimento di blastocisti in topi pseudogravidi ICR) sono stati esaminati e approvati dalla JHU IACUC. Queste revisioni includevano considerazioni per il sacrificio etico, l'alloggio umano e le misure appropriate per ridurre al minimo il disagio degli animali.

1. Riprogrammazione episomiale xenofree hiPSC senza alimentatore

  1. Preparazione delle cellule progenitrici ematopoietiche del donatore
    1. Utilizzare cellule staminali/progenitrici ematopoietiche CD34+ crioconservate (ad es. 1x106 cellule CB neonatali) immediatamente dopo la consegna o conservare i crioviali in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido. Assicurarsi che le celle siano state mantenute continuamente in uno stato congelato durante il trasporto e la movimentazione.
      NOTA: In alternativa, le cellule di donatore non crioconservate possono essere utilizzate anche immediatamente dopo la raccolta e l'arricchimento del CD34 utilizzando protocolli approvati.
    2. Prima di scongelare le cellule nel bagnomaria, aprire delicatamente il crioviale sterilizzato all'interno di una cabina di biosicurezza per rilasciare il gas intrappolato all'interno della fiala e quindi chiudere ermeticamente la fiala.
    3. Mettere il flaconcino in un bagnomaria a 37 °C per 1 o 2 minuti. Agitare delicatamente la fiala fino a quando non rimane quasi più ghiaccio. Rimuovere la fiala dal bagnomaria e sterilizzarla accuratamente (es. spray all'etanolo al 70%).
      NOTA: Tutte le fasi richiedono un'adeguata tecnica asettica e vengono eseguite all'interno di una cappa di sicurezza biologica sterile.
    4. Trasferire delicatamente e lentamente le cellule in una provetta conica sterile vuota da 50 mL. Lavare il flaconcino con 1 mL di terreno di espansione del progenitore ematopoietico xenofree freddo (XF-HP) (Tabella 1) e combinare delicatamente (goccia a goccia lungo i bordi della provetta) con le cellule per diluire il crioprotettore DMSO.
    5. Lasciare la provetta in una griglia per 30 s e aggiungere lentamente (goccia a goccia) 2 mL di terreno freddo XF-HP. Agitare delicatamente la sospensione cellulare mentre si aggiunge il terreno. Ripetere questo passaggio due volte aggiungendo in sequenza 4, 8 e 4 ml di terreno freddo XF-HP (fino a 20 ml di volume totale). Centrifugare le celle diluite a 100 x g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Non pipettare le cellule su e giù nella soluzione crioprotettiva e durante le fasi di diluizione. Aggiungere XP-HP medi a goccia e lentamente fino a quando il DMSO non si è diluito almeno 10 volte. Utilizzare un mezzo freddo poiché la diluizione del DMSO provoca una reazione esotermica.
    6. Aspirare il surnatante privo di cellule in una cabina di biosicurezza. Sganciare delicatamente il pellet della cella. Risospendere in 2 mL di terreno di espansione XF-HP per la conta cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
    7. Trasferire le cellule scongelate su piastre multipozzetto per colture cellulari a bassissimo attacco (ad es. trasferire 2 mL di miscela di cellule/terreno XF-HP in 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
    8. Avvolgere strettamente la piastra in Saran wrap per imitare le condizioni ipossiche. Trasferire la piastra in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida). In alternativa, posizionare la piastra non confezionata in un'incubatrice con controllo O2 (5% O2, 5% CO2, atmosfera umida).
    9. Coltura dei progenitori ematopoietici per 3 giorni in terreno XF-HP.
  2. Preparazione di cellule progenitrici staminali mesenchimali (MSC)
    1. Scongelare un'aliquota (0,75 - 1x106 cellule) di MSC umana a basso passaggio (da p2 a p3) incubando un'aliquota crioconservata in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 o 2 minuti. Agitare delicatamente la fiala fino a quando non rimane quasi più ghiaccio. Rimuovere la fiala dal bagnomaria e sterilizzarla accuratamente (cioè etanolo al 70%).
      NOTA: Le MSC umane a basso passaggio (p2) possono essere acquistate o preparate dal midollo osseo umano utilizzando protocolli stabiliti e crioconservate. Le MSC possono essere scongelate circa 7-10 giorni prima e irradiate/piastrate come strato di alimentazione il giorno prima della nucleofezione (Figura 1).
    2. Trasferire delicatamente e lentamente (goccia a goccia lungo i bordi della provetta) le cellule in una provetta conica da 15 mL contenente terreno freddo di cellule staminali mesenchimali prive di siero xenofree (XF-MSC) all'interno di una cabina di biosicurezza per diluire il crioprotettore DMSO di almeno 10 volte (ad esempio, trasferire 1 mL di aliquota di cellule crioconservate in 9 mL di terreno XF-MSC).
    3. Utilizzare 1 o 2 ml di terreno freddo XF-MSC per sciacquare la provetta e unirla nella provetta conica. Centrifugare le cellule diluite a 100 x g per 5 minuti a 4 °C.
    4. Aspirare il surnatante privo di cellule in una cabina di biosicurezza. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di terreno XF-MSC per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
    5. Trasferire le cellule scongelate su piastre multipozzetto per colture cellulari trattate con tessuti (ad es. 5.000-6.000 cellule per cm2 o circa 50.000 cellule in 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti). Mettere le piastre in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida). Aggiornare il terreno XF-MSC ogni 2-3 giorni all'interno di una cabina di biosicurezza.
    6. Il giorno prima della nucleofezione, aspirare il surnatante privo di cellule in una cabina di biosicurezza. Lavare MSC una volta con PBS (2 ml/pozzetto). Aspirare PBS. Aggiungere 1 mL/pozzetto di reagente di dissociazione cellulare (ad es. soluzione 1X di tripsina-EDTA). Incubare per 5 minuti a 37 °C in un incubatore di CO2 .
    7. Neutralizzare il reagente di dissociazione aggiungendo 1 mL di terreno XF-MSC (diluizione di almeno 2 volte) e triturare delicatamente con una pipetta in una sospensione di una singola cellula. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 100 x g per 5 min.
    8. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno XF-MSC per la conta cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
    9. Irradiare i progenitori mesenchimali (2.000 rad) in 5 passaggi utilizzando un irradiatore a raggi G o X e su piastre a 6 pozzetti con superficie sintetica rivestita di peptidi Arg-Gly-Asp (RGD) (2x10,5 cellule per pozzetto) in terreno XF-MSC. Conservare le piastre per una notte in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
  3. Riprogrammazione episomiale xenofree
    1. Raccogliere colture CB HP di 3 giorni in un terreno di espansione XF-HP in una provetta conica da 15 mL in una cappa di biosicurezza. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
    2. Aspirare il surnatante privo di cellule in una cabina di biosicurezza.  Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di terreno di espansione XF-HP per la conta cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
    3. Combinare 1x106 cellule HP espanse con 100 μL di soluzione di nucleofeczione cellulare CD34+ umana (kit di nucleofemi cellulari CD34+ umani). Aggiungere 6 μg di episoma concentrato purificato (<5 μL) e trasferire con cura in una cuvetta per nucleofector utilizzando la pipetta di trasferimento in plastica del kit per nucleofezione. Evita le bolle. Posizionare la cuvetta nel dispositivo nucleofettore e utilizzare il programma U-008.
      NOTA: Preparare le scorte del vettore pCEP4 pEP4 EO2S EM2K basato su EBNA episomiale mediante trasformazione di routine in TOP10 E. coli e purificare utilizzando i kit Maxi-prep del plasmide. Il giorno della nucleofezione, pulire e concentrare il plasmide utilizzando un kit di purificazione PCR 7.
    4. Immediatamente dopo la nucleofezione, aggiungere 500 μl di terreno di espansione XF-HP preriscaldato nella cuvetta e trasferire le cellule in 1 mL di terreno XF-HP su 1 pozzetto di piastra a 6 pozzetti per colture cellulari a bassissimo attacco utilizzando una pipetta di trasferimento sterile.
      NOTA: Le cellule nucleofettate sono molto fragili e non sopravvivono allo stress da taglio dei normali puntali per pipette da 1 mL. Il trasferimento su piastre di coltura con attacco ultrabasso è una fase che favorisce il recupero delle cellule post-nucleofecazione prima dell'attacco finale su piastre rivestite con RGD.
    5. Avvolgere strettamente la piastra in un involucro di plastica per imitare le condizioni di ipossia. Porre la piastra in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida). In alternativa, posizionare la piastra non confezionata in un'incubatrice con controllo O2 (5% O2, 5% CO2, atmosfera umida). Incubare per 4-6 ore.
      NOTA: Questo passaggio consentirà alle cellule HP nucleofectate di riprendersi prima del trasferimento su monostrati MSC.
    6. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 ml in una cabina di biosicurezza. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
    7. Aspirare il surnatante all'interno di una cabina di biosicurezza. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di espansione XF-HP. Piastra di cellule HP nucleofettate su MSC irradiata a una densità di circa 17.500 cellule per cm2 in piastre rivestite di RGD in terreno di espansione XF-HP (2 mL/pozzetto) integrato con l'inibitore ROCK Y-27632 (concentrazione finale 10 μM). Porre la piastra in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
    8. Due giorni dopo la nucleofezione, aggiungere 2 mL (volume uguale) di terreno E8 in ciascun pozzetto all'interno di una cappa di biosicurezza.
    9. Sostituire metà del volume del terreno di coltura a giorni alterni con il terreno E8. Raccogliere le cellule galleggianti in una provetta conica da 15 mL, centrifugare a 200 x g per 5 minuti e aggiungere nuovamente le cellule recuperate alla coltura.
    10. Il giorno 21, preparare piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale rivestita di vitronectina. Aggiungere 1 mL di soluzione diluita di vitronectina (ad es. 40 mL/mL per Vitronectin-XF) a 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    11. Preleva manualmente le singole colonie di XF-hiPSC utilizzando un microscopio invertito all'interno di una cabina di biosicurezza. Triturare con pipetta e trasferire singole colonie su piastre rivestite di vitronectina in terreno E8 integrato con l'inibitore ROCK Y-27632 (concentrazione finale 5 μM). Porre la piastra in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
    12. Il giorno successivo, sostituire con cura il terreno con il terreno E8 senza integrazione di inibitori ROCK. Successivamente sostituire il terreno E8 ogni giorno (2 ml/pozzetto) in una cabina di biosicurezza.

2. Coltura e manutenzione di routine dell'hiPSC

  1. Quando le colonie diventano più grandi 5-6 giorni dopo (cioè da 0,5 a 1 mm di diametro o circa l'80% di confluenza), aspirare il terreno in una cabina di biosicurezza.
  2. Aggiungere 2 ml/pozzetto di PBS per lavare le cellule. Aspirare il PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare a base di EDTA. Incubare per 5 minuti in un incubatore di CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida). Verificare che le cellule siano attaccate in modo lasco (ad esempio, cellule rotonde lucide, ma ancora attaccate alla piastra) utilizzando un microscopio.
  3. Aspirare delicatamente la soluzione di dissociazione all'interno di una cabina di biosicurezza senza distruggere le cellule.
  4. Raccogliere le cellule in 1-2 mL di terreno E8 integrato con l'inibitore ROCK Y-27632 (concentrazione finale 5 μM) con pipettaggio non vigoroso per mantenere i grumi cellulari. Trasferire i grumi cellulari su piastre trattate con colture cellulari a 6 pozzetti rivestite di vitronectina (vedere paragrafo 1.3.11) (equivalenti a 10 colonie per pozzetto o divisione 1:10). Porre la piastra in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
  5. Continuare la subcoltura utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare a base di EDTA ogni 5-7 giorni.
    NOTA: Di solito non è necessario un ulteriore sub-clonaggio o prelievo manuale di colonie per la riprogrammazione SP-CB-hiPSC, ma se i cloni hiPSC contengono colonie con morfologia anormale (ad esempio, differenziazione spontanea come fibroblasti o formazione di corpi embrioidi, comparsa di colonie anormali non piatte), selezionare manualmente le colonie utilizzando una micro-pipetta e un microscopio all'interno di una cabina di biosicurezza o scartare i cloni aberranti. La riprogrammazione non efficiente e non stabile di hiPSC non è compatibile con la reversione TIRN-SC.

3. Validazione fenotipica di cloni XF-hiPSC

  1. Espandere i cloni XF-hiPSC per almeno 5-7 passaggi per la convalida iniziale (Figura 2) come descritto nella sezione 2, prima della crioconservazione a lungo termine e dell'applicazione in studi funzionali. Registrare il numero di passaggi su ogni fiala crioconservata.
    NOTA: La caratterizzazione iniziale dei cloni XF-hiPSC a basso passaggio può essere confermata da saggi multipli come l'attività della fosfatasi akalina e l'immunorilevazione dell'antigene TRA-1 o del NANOG.
  2. Eseguire la convalida e l'enumerazione XF-hiPSC con colorazione con fosfatasi alcalina (Figura 2A, B).
    NOTA: Le efficienze di riprogrammazione nelle colture di massa possono essere determinate a P0 3-5 settimane dopo le nucleofections episomiali enumerando il numero di colonie completamente riprogrammate per singola cellula di input placcata il giorno 3 7,13.
    1. Aspirare il terreno di coltura in una cappa di biosicurezza.
    2. Lavare le celle con PBS (2 mL per pozzetto). Aspirare PBS. Fissare le cellule aggiungendo una soluzione di paraformaldeide/PBS al 2%. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere e smaltire la soluzione di paraformaldeide/PBS secondo le linee guida sulla sicurezza dei rifiuti chimici.
    4. Lavare le celle con PBS (2 mL per pozzetto). Aspirare PBS. Aggiungere 1-2 mL di substrato di fosfatasi alcalina e incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente con agitazione lenta.
    5. Lavare 3 volte con PBS per fermare la reazione. Fotomicrografare ed enumerare.
      NOTA: Evitare un tempo di incubazione o una temperatura eccessivi in quanto possono causare macchie false positive.
  3. Eseguire la convalida e l'enumerazione della colorazione XF-hiPSC con immunocolorazioni dell'antigene TRA-1 (Figura 2C).
    NOTA: Per la riprogrammazione episomiale, il rilevamento dell'espressione transgenica e della spina dorsale del vettore EBNA1 durante i passaggi iniziali deve essere eseguito utilizzando i protocolli pubblicati7. La convalida di routine include la cariotipizzazione mediante bande G (Figura 2D) o saggi di copertura basati su array di intero genoma. La pluripotenza funzionale di base può anche essere valutata utilizzando protocolli di differenziazione del teratoma (Figura 2E) o scorecard quantitative di espressione multigenica di differenziazioni di corpi embrioidi non diretti14.
    1. In una cabina di biosicurezza, l'immunocolorazione replica i pozzetti per gli antigeni TRA-1-60 o TRA-1-81 per 30 minuti aggiungendo anticorpi vivi-colorati coniugati con fluorocromo al terreno E8 alla concentrazione appropriata.
    2. Aspirare il terreno di coltura. Lavare due volte con terreno E8 (2 ml per pozzetto).
    3. Fotomicrografare ed enumerare in terreno E8 o terreno privo di rosso fenolo.
      NOTA: In alternativa, fissare le cellule utilizzando una soluzione di paraformaldeide/PBS al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente e immunocolorare per gli antigeni TRA-1 utilizzando anticorpi standard.
  4. Convalidare l'immunofenotipo XF-hiPSC mediante citometria a flusso.
    1. In una cappa di biosicurezza, aspirare il terreno di coltura.
    2. Lavare le celle in PBS (2 mL per pozzetto). Aspirare PBS. Aggiungere un reagente di dissociazione enzimatica (ad es. Accutase, 1 ml per pozzetto). Incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C in un incubatore di CO2 (5% CO2, atmosfera umida).
    3. Raccogliere le cellule aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura e passarle attraverso un filtro cellulare (filtro da 40-70 μm). Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
    4. Pellet di cellule di risospensione in PBS con il 5% di FBS (1 mL per pozzetto equivalente). Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Distribuire circa 100.000-200.000 cellule in provette a fondo tondo per saggio FACS (mantenendo i volumi a circa 100 μl per saggio).
    5. Per le colorazioni extracellulari, dopo una fase di blocco facoltativa con siero di topo puro (aggiungere 5 μl per saggio, 5 minuti a temperatura ambiente), incubare con anticorpi coniugati con fluorocromo (ad es. TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) secondo le istruzioni del produttore. Lavare con 3 ml di PBS. Centrifugare per 5 min a 300 x g. Risospendere nel buffer FACS (ad esempio, PBS con FBS al 5%) e acquisire utilizzando uno strumento FACS.
      NOTA: utilizzare sempre controlli isotipici appropriati e colorare campioni paralleli per convalidare la specificità delle proteine immunorilevate.
    6. Per le colorazioni intracellulari (ad es. NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE), seguire le istruzioni del produttore per le fasi di fissaggio/permeabilizzazione. Incubare con anticorpi coniugati con fluorocromo o controlli di isotipo corrispondenti. Acquisisci utilizzando uno strumento FACS.

4. Crioconservazione e scongelamento di cloni di XF-hiPSC

  1. Espandere i cloni XF-hiPSC per almeno 5-7 passaggi per eseguire la convalida iniziale (Figura 2) prima della crioconservazione a lungo termine e dell'applicazione negli studi funzionali. Registrare il numero di passaggi su ogni fiala crioconservata.
    1. Aspirare il terreno di coltura in una cappa di biosicurezza.
    2. Lavare le celle con PBS (2 mL per pozzetto). Aspirare PBS.  Aggiungere una soluzione di distacco cellulare a base di EDTA (1 mL per pozzetto) per dissociare le colonie di XF-hiPSC in grumi cellulari. Incubare la piastra per 5 minuti in un incubatore di CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida). Verificare che le cellule siano attaccate in modo lasco (ad esempio, cellule rotonde lucide) utilizzando un microscopio.
    3. Aspirare delicatamente la soluzione di dissociazione senza interrompere le colonie di monostrato cellulare e raccogliere le cellule in terreno E8 da 1-2 mL con pipettaggio non vigoroso per mantenere i grumi cellulari (10-50 cellule per grumo). Raccogliere XF-hiPSC in una provetta conica sterile da 15 mL. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
    4. Aspirare il surnatante in una cabina di biosicurezza. Risospendere il pellet cellulare in soluzione di congelamento (Tabella 2, ~ 1 pozzetto equivalente per mL).
    5. Trasferire le cellule in provette criogeniche per la conservazione a lungo termine. Collocare le provette in un contenitore a lenta surgelazione e lasciare congelare i campioni per una notte in un congelatore a -80 °C. Il giorno successivo, metti i crioviali in un congelatore ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  2. Per lo scongelamento, preparare una piastra mediante rivestimento preliminare con vitronectina (vedere paragrafo 1.3.11).
    1. Mettere la fiala congelata in un bagnomaria a 37 °C e scongelare le cellule per ~1-2 minuti. Sterilizzare (cioè spray all'etanolo).
    2. Trasferire lentamente XF-hiPSC in una provetta conica sterile da 15 mL contenente 9 mL di terreno di scongelamento (Tabella 2) per diluire lentamente le cellule di 10 volte all'interno di una cappa di sicurezza biologica sterile.
      NOTA: Non pipettare energicamente.
    3. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
    4. Aspirare il surnatante privo di cellule in una cabina di biosicurezza. Risospendere il pellet cellulare in terreno E8 (1-2 mL) integrato con inibitore ROCK (concentrazione finale 5 mM).
      Nota: l'esclusione di Y-27632 comporterà una scarsa efficienza di recupero post-scongelamento.
    5. Trasferire le cellule scongelate su 1 o 2 pozzetti rivestiti di vitronectina di una piastra a 6 pozzetti. Il giorno successivo, cambiare il terreno con un normale terreno E8 senza inibitore ROCK per l'espansione cellulare.

5. Differenziazione ematovascolare xenofree di XF-hiPSC

  1. Differenziare XF-hiPSC utilizzando il nostro protocollo di differenziazione emato-vascolare xenofree ottimizzato (Figura 3)4.
    NOTA: Questo protocollo è stato modificato rispetto al15.
    1. Preparare XF-hiPSC a ~40-50 % di confluenza (1-3 giorni dopo il passaggio).
    2. Aspirare il terreno di coltura e aggiungere 2 mL di terreno di determinazione mesodermica (Tabella 2) in una cabina di biosicurezza.
    3. Dopo 2 giorni, aspirare il terreno e aggiungere 2 mL/pozzetto di terreno di differenziazione vascolare (Tabella 2) in una cabina di biosicurezza. Se in questa fase sono visibili molte cellule morte o galleggianti, lavare una volta con 2 ml di PBS.
    4. Sostituire il mezzo di differenziazione vascolare a giorni alterni in una cabina di biosicurezza fino all'11° giorno.
      NOTA: Se il terreno diventa giallo a causa dell'elevata densità cellulare e del pH basso, aggiungere 1 ml di terreno fresco o sostituire ogni giorno.
  2. Dopo 7-10 giorni di coltura in terreno di differenziazione vascolare, purificare le cellule vascolari CD31+ o CD34+ dal monostrato aderente con un metodo di selezione delle cellule a biglie magnetiche.
    NOTA: Ogni singolo clone può mostrare una cinetica di differenziazione distinta. Determinare il punto temporale di picco per l'espressione di CD31/CD34 mediante analisi FACS (Figura 4A). È richiesta l'analisi FACS dell'arricchimento pre e post magnetico delle bigelle. I progenitori ematopoietici (HP) possono essere recuperati in questa fase dal surnatante e arricchiti utilizzando microsfere CD34. L'HP derivato da CD34+ XF-hiPSC può essere ulteriormente convalidato utilizzando il saggio della metilcellulosa (Figura 4B-C)16.
    1. In una cabina di biosicurezza, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule in PBS (2 mL per pozzetto). Aspirare PBS e dissociare le colonie di hiPSC in singole cellule aggiungendo un reagente di dissociazione enzimatica (ad es. Accutase, 1 mL per pozzetto). Incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C in un incubatore di CO2 (5% CO2, atmosfera umida).
    2. In una cappa di biosicurezza, raccogliere le cellule aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
    3. Pellet cellulare di risospensione in mezzo di differenziazione vascolare (Tabella 2). Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Mettere da parte circa 50.000-100.000 cellule per il saggio FACS di arricchimento pre-magnetico con biglie utilizzando anticorpi anti-CD31 o anti-CD34 coniugati direttamente.
    4. Centrifugare le celle rimanenti a 300 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in un tampone di arricchimento con biglie magnetiche (PBS pH 7,2, albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e 2 mM EDTA) in una cappa di biosicurezza.
    5. Passare le cellule attraverso un colino cellulare (filtro da 40-70 μm). Centrifugare a 300 x g per 5 min. Risospendere in un tampone di arricchimento a biglie magnetiche da 60 μL.
    6. Aggiungere 20 μl di reagente bloccante FcR, quindi aggiungere 20 μl di microsfere CD31 o CD34 e incubare per 15-20 minuti a 4 °C.
    7. Lavare le celle con 2 mL di tampone per l'arricchimento di microsfere magnetiche in una cabina di biosicurezza e centrifugare (300 x g, 5 min).
    8. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone per l'arricchimento di biglie magnetiche in una cappa di biosicurezza.
    9. Posizionare una colonna LS nel campo magnetico di un separatore di celle magnetiche all'interno della cabina di biosicurezza. Colonna di lavaggio con tampone per l'arricchimento di microsfere magnetiche da 3 mL.
    10. Applica le celle alla colonna.  Raccogliere le cellule non marcate in una provetta conica da 15 mL. Lavare la colonna 3 volte con 3 mL di tampone per l'arricchimento di microsfere magnetiche.
    11. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su una nuova provetta conica da 15 mL.
    12. Eliminare le cellule marcate magneticamente aggiungendo 3-5 ml di terreno di crescita endoteliale. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
    13. Risospendere in 1 mL di terreno di crescita endoteliale in una cabina di biosicurezza. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Mettere da parte circa 50.000 cellule per la purezza del tipo di arricchimento di biglie post-magnetiche mediante analisi FACS utilizzando anticorpi anti-CD31 o anti-CD34 coniugati direttamente.
    14. Il VP isolato può essere ulteriormente espanso su piastre di fiasche trattate con colture tissutali rivestite di fibronectina (10 μg/mL) in terreno di crescita endoteliale.

6. Linee guida per la progettazione sperimentale per la validazione funzionale di XF-hiPSC

  1. Stabilire le scorte di XF-hiPSC convalidate fin dai primi passaggi utilizzando un metodo non integrativo consolidato, come il 7,17 episomiale, il virus Sendai18 o la riprogrammazione dell'mRNA19.
    NOTA: Un confronto tra l'efficienza e l'affidabilità dei metodi di non riprogrammazione è fornito altrove6. La clearance del materiale transgenico nei metodi di riprogrammazione del virus episomiale o Sendai può essere verificata durante i passaggi iniziali utilizzando i metodi PCR 7,20. La ritenzione del transgene non è compatibile con la generazione di TIRN-SC.
  2. Validare il cariotipo normale nei cloni XF-hiPSC mediante G-banding o saggi di copertura basati su array di intero genoma9.
  3. Convalidare l'espressione genica e l'integrità epigenomica delle linee XF-hiPSC (ad esempio, impronte parentali, attivazione X) utilizzando array di metilazione del DNA e di espressione genica o metodi di sequenziamento 5,11,14.
  4. Convalidare la pluripotenza funzionale di base utilizzando protocolli di differenziazione del teratoma (Figura 2E), saggi quantitativi di differenziazione del corpo embrioide (EB) utilizzando array RT-PCR14 o saggi di differenziazione diretta verso i 3 strati germinali9.
    NOTA: Metodi quantitativi per la capacità di differenziazione multilinea e l'indice proliferativo intra-lineage dei saggi di teratoma utilizzando la caratterizzazione istologica mediante microscopia sono forniti altrove4. I protocolli per la differenziazione diretta verso le linee mesodermiche e la specifica emato-vascolare (Figura 4A-C) sono stati precedentemente dettagliati 4,5,9, così come il saggio di differenziazione diretta verso l'endoderma definitivo (Figura 4D)5. Esempi di saggio di differenziazione diretta verso l'ectoderma sono forniti altrove 4,5.

7. Adattamento chimico TIRN di XF-hiPSC

  1. Acquistare o preparare internamente alimentatori MEF a basso passaggio da embrioni di topo CF1 o CF1 x DR4 ibrido E13.5 seguendo i protocolli pubblicati 9,21. Piastra 200.000 alimentatori MEF per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti gelatinizzata (0,1% di gelatina in acqua, 1 mL per pozzetto) trattata con coltura tissutale almeno un giorno prima della fase di adattamento TIRN (i protocolli TIRN dettagliati sono forniti altrove 4,5,9).
  2. Mantenere ed espandere colture XF-hiPSC prive di transgeni con cariotipi normali convalidati in un sistema di coltura privo di alimentatore (ad esempio, terreno E8, vedere la Tabella 1 per la formulazione interna).
  3. Sostituire il terreno E8 con il terreno LIF-5i (2 mL per pozzetto; Tabella 1) dopo che le colture XF-hiPSC hanno raggiunto una confluenza del ~50% (cioè 3-5 giorni dopo la piastrina iniziale) in una cappa di biosicurezza.
  4. Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura e lavare una volta XF-hiPSC adattato a LIF-5i con PBS (2 mL per pozzetto) in una cappa di biosicurezza. Aspirare il surnatante e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare enzimatica a ciascun pozzetto. Incubare per 5 minuti a 37 °C in un incubatore di CO2 .
  5. Triturare delicatamente con una pipetta in una sospensione di una singola cellula in una cappa di biosicurezza. Neutralizzare con terreno LIF-5i (1 ml per pozzetto). Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica sterile da 15 mL.  Centrifugare a 200 x g per 5 min.
  6. Aspirare il surnatante in una cabina di biosicurezza. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno LIF-5i.
    NOTA: Se possibile, prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule. È possibile neutralizzare l'attività enzimatica con il terreno LIF-5i/LIF-3i senza l'integrazione con inibitori o fattori di crescita.
  7. Lavare due volte la piastra MEF con PBS (2 mL per pozzetto in piastre a 6 pozzetti) e aggiungere le cellule (1 pozzetto equivalente a cellule adattate LIF-5i su 1 pozzetto di alimentatori MEF in 2 mL di terreno LIF-5i).
    NOTA: L'ottimizzazione delle densità di placcatura iniziali per ogni singola linea XF-hiPSC è opzionale. Se le cellule sono state contate nel passaggio precedente, impiattare almeno 1x106 celle per pozzetto sugli alimentatori.  Trasferire la piastra in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
  8. Coltivare e mantenere XF-hiPSC per 3-5 giorni in LIF-5i su MEF in un incubatore di CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida). Cambia LIF-5i medium ogni giorno.
  9. Quando si formano colonie TIRN-SC a forma di cupola (dopo 3-5 giorni di coltura su alimentatori), aspirare il terreno di coltura in una cappa di biosicurezza. Lavare ogni pozzetto con 2 ml di PBS.
  10. Aspirare PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco di cellule (ad es. Accutasi) in ciascun pozzetto. Incubare per 5 minuti a 37 °C in un incubatore di CO2 (5% CO2, atmosfera umida).
  11. Aggiungere 1 mL di terreno LIF-3i (Tabella 1) a ciascun pozzetto in una cabina di biosicurezza per neutralizzare il reagente di dissociazione. Triturare delicatamente e raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
  12. Aspirare il surnatante in una cabina di biosicurezza. Risospendere in terreno LIF-3i (1 mL per pozzetto) per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Piastra ~5 x 105 cellule in terreno LIF-3i da 2 mL per pozzetto su MEF irradiato in piastre gelatinizzate a 6 pozzetti in una cabina di biosicurezza.
    NOTA: ripetere i passaggi 7.12 5o 7.16 per tutti i passaggi successivi.  Dopo la coltura iniziale adattata a LIF-5i, le colture LIF-3i su piastra a una densità inferiore (2x105 cellule/pozzetto) e il passaggio ogni 3-4 giorni.
  13. Passaggio XF-hiPSC ripristinato TIRN per almeno 6-7 passaggi continui in terreno LIF-3i prima dell'uso in studi funzionali o crioconservazione. Registrare il numero di passaggi in terreni di coltura innescati xenofree (ad es. E8) o in terreni TIRN LIF-5i/LIF-3i.
    NOTA: L'inversione TIRN delle linee XF-hiPSC ad alto passaggio (ad es. >p40) è inefficiente e non consigliata. Le linee ad alto passaggio spesso ospitano difetti cromosomici o subcromosomici, che non sono compatibili con un'efficiente reversione TIRN e si tradurranno in scarse efficienze di reversione e limitata stabilità della coltura. Inoltre, l'uso di colture TIRN che hanno subito più di 15 passaggi in terreno LIF-3i non è raccomandato per gli studi funzionali. L'impatto funzionale della reversione TIRN di XF-hiPSC è più evidente tra 7 e 15 passaggi in LIF-3i medium.

8. Linee guida per la progettazione sperimentale per il differenziamento diretto di TIRN-SC derivato da XF/FF hiPSC.

  1. Utilizzare direttamente TIRN-SC derivato da XF/FF hiPSC in protocolli di differenziazione diretta stabiliti senza alcuna fase di "re-priming" (cioè, nessuna necessità di riportare le cellule staminali TIRN a condizioni convenzionali "innescate" prima del loro utilizzo in saggi di differenziazione diretta).
  2. Per la valutazione funzionale dell'impatto di TIRN su XF-hiPSC, impostare colture isogeniche sorelle, con un numero di passaggi equivalente in parallelo. Mantenere in parallelo colture di XF-hiPSC isogeniche prime/TIRN nei rispettivi terreni (ad esempio, E8 su vitronectina vs. LIF-3i su MEF) ed eseguire contemporaneamente il test del teratoma (Figura 5) o differenziare utilizzando un corpo embrioide identico o protocolli e materiali di differenziazione diretta (Figura 6).
  3. Eseguire la valutazione funzionale delle linee differenziate terminali, quando possibile. Ad esempio, i progenitori vascolari possono essere valutati mediante l'espressione proteica, il saggio di captazione delle lipoproteine acetilate a bassa densità (LDL) coniugate con DiI e il saggio in provetta Matrigel (Figura 7).
    NOTA: Ulteriori saggi funzionali per VP derivati da CB-hiPSC e TIRN-SC (ad esempio, saggi di assorbimento/senescenza/proliferazione/migrazione di DiI-Ac-LDL, saggi in vitro in provetta Matrigel, test di plugassay Matrigel animale, saggi di xenotrapianto) sono descritti altrove 3,4.
  4. Regolare e ottimizzare le densità e la cinetica iniziali della placcatura (Figura 6) per ogni singolo clone XF-hiPSC in ogni saggio di differenziazione.
    NOTA: Le colture di XF-hiPSC con ritorno TIRN hanno una capacità proliferativa e di differenziazione più robusta nei saggi di differenziazione diretta rispetto alle colture di XF-hiPSC innescate. Le colture TIRN richiedono tipicamente una densità di placcatura iniziale inferiore rispetto alle colture E8 e non richiedono l'uso di integratori anti-apoptotici per migliorare la sopravvivenza clonale.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo ottimizza i metodi pubblicati per un'efficiente riprogrammazione dei progenitori mieloidi in uno stato pluripotente innescato ad alta fedeltà utilizzando vettori episomiali e segnali stromali7. Il protocollo (Figura 1) delinea i metodi definiti per la riprogrammazione episomiale con priming stromale XF/FF dei progenitori CB CD34+ umani in XF-hiPSC e fornisce istruzioni su come convalidare la loro funzionalità tramite la specifica ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il gruppo di Zambidis ha originariamente riportato un metodo episomiale a quattro fattori altamente ottimizzato per riprogrammare i progenitori mieloidi CB impegnati nel lignaggio in CB-hiPSC con efficienze di massa che raggiungono fino al 50% in cellule purificate che esprimono episomi7. Qui, abbiamo presentato una versione modificata del protocollo originale di riprogrammazione episomiale del progenitore CB umano in condizioni di stroma innescato da XF/FF. Quest...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nessuna divulgazione da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NIH/NEI (R01EY032113; ETZ), il Fondo per la ricerca sulle cellule staminali del Maryland (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) e la Fondazione Lisa Dean Moseley (ETZ).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaPannello AAB-1001
anticorpo anti-CD143 (BB9), coniugato APC BD Bioscienze557929utilizzare 10-20 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-CD144, PE coniugato BD Bioscienze560410utilizzare 10-20 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-CD146, PE coniugato BD Bioscienze550315utilizzare 10-20 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-CD184/CXCR4, coniugato APC BD Bioscienze555976utilizzare 10-20 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-CD31BD Bioscienze550389Diluire 1:100 in soluzione bloccante per test di immunofluorescenza
anticorpo anti-CD31, coniugato APC eBioscience17-0319-42utilizzare 2 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-CD34, coniugato APC BD Bioscienze555824utilizzare 5 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-CD45, PE coniugato BD Bioscienze555483utilizzare 10-20 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-NANOG, coniugato PEBD Bioscienze560483utilizzare 10-20 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-OCT4, PE coniugatoR& Sistemi DIC1759Putilizzare 10 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-SOX17, Alexa488 coniugato BD Bioscienze562205utilizzare 5 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-SOX2, PE coniugatoR& Sistemi DIC2018Putilizzare 10 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-SSEA-4, coniugato APCR& Sistema DFAB1435Autilizzare 5 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-SSEA-4 GloLIVE, NL493 coniugatoR& Sistema DNLLC1435GUtilizzo a diluizione 1:50 (immunocolorazioni vive e fissate)
kit coniugato anti-TRA-1-60 A488ThermoFisher ScientificoCodice: A25618
anticorpo anti-TRA1-60, coniugato PEBD Bioscienze560193utilizzare 10 µ L per test (FACS)
anticorpo anti-TRA-1-60 GloLIVE, NL557 coniugato R& Sistemi DNLLC4770RUsa AT  una diluizione 1:50 (immunocolorazioni vive e fissate)
anti-TRA-1-60 Anticorpo StainAlive, DyLight 488 coniugatoStemgent09-0068Utilizzare con diluizione 1:100 (immunocolorazioni vive e fisse)
anticorpo anti-TRA1-81, coniugato PEBD Bioscienze560161utilizzare 10 µ L per test (FACS)
anti-TRA-1-81 Anticorpo StainAlive, DyLight 488 coniugatoStemgent09-0069Utilizzare con diluizione 1:100 (immunocolorazioni vive e fisse)
Kit CD31 MicroBeads, umanoMiltenyi Biotec130-091-935
Kit CD34 MicroBeads, umanoMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Donatori misti,  Sangue del cordone ombelicale, 1 milione di celluleTutte le celleCB, CR, CD34+, Misto, PS, CS10, 1Mfonti alternative di cellule includono fegato fetale, midollo osseo adulto e sangue periferico mobilizzato
Mouse CF1Fiume Charles023
CHIR99021R& Sistema DL5283ricostituire a 100 mM in DMSO
Piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale Corning CostarCorning3506
Substrato Corning Synthemax II-SC, flaconcino da 10 mgCorning3535Utilizzare a 5 μ g/cm2 in sostituzione del Corning 3978
Piastra a 6 pozzetti Corning Synthemax-RCorning3978fuori produzione e sostituito in 3535
Costar Piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso a fondo piatto trasparente a 6 pozzettiCorning3471
Contessa  vetrino della camera di conteggio delle celluleThermo Fisher ScientificoCodice: C10228
Contacelle automatizzato CountessThermo Fisher ScientificoAMQAX1000
CryoStore CS10Tecnologie StemCell100-1061
DII-AC-LDLThermo Fisher ScientificoL3484Utilizzo a 5-15 & micro; g/mL
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientifico11995065
DMEM/F-12 , integratore GlutaMAXThermo Fisher Scientifico10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Scientifico11330032
DMSO (dimetilsolfossido)Sigma AldrichD2650
Mouse DR4Il laboratorio Jackson3208
Essential 8 (E8) medioTecnologie StemCell5940
Siero fetale di bovino (FBS)Thermo Fisher ScientificoSH30071.03
CORREZIONE & Kit di permeabilizzazione cellulare PERMThermo Fisher ScientificoGAS004
ForskolinaStemgent04-0025ricostituire a 100 mM in DMSO
Gelatina (suina)Sigma AldrichG1890-100Grisospendere in acqua e sterilizzare in autoclave
nucleofeme cellulare CD34+ umano  corredoLonzaVPA-1003
Isotipo di topo IgG1 PE coniugatoBD Bioscienze554680
Isotipo di topo IgG2a PE coniugatoBD Bioscienze558595
Isotipo di ratto IgG2b PE coniugatoR& Sistemi DIC013P
Sostituzione del siero knockoutThermo Fisher Scientifico10828-028
Acido L-ascorbicoMillipore SigmaCodice: A8960
L-Glutammina (100X)Thermo Fisher Scientifico25030-081
Colonne LSMiltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237utilizzare 200 µ L/pozzetto in piastre a 48 pozzetti
MEM Aminoacido non essenziale (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientifico11140-050
MethoCult SF H4436Tecnologie StemCell04436
Separatore MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 medioTecnologie StemCell85850
Fiale criogeniche NalgeneThermo Fisher Scientifico5000-0020
Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBSThermo Fisher ScientificoJ19943. K2diluire alla concentrazione richiesta utilizzando PBS
PD0325901Sigma AldrichPZ0162ricostituire a 100 mM in DMSO
Penicillina/streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientifico15140-122
episoma pEP4 E02S EM2KAddgene20923I plasmidi sono stati propagati in TOP10 E.  coli (Invitrogen) e purificato con i maxi kit plasmidi QIAGEN.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Industrie Biologiche02-023-1A
Poietics cellule staminali mesenchimali umane LonzaPT-2501750.000 celle al passaggio 2 possono essere scongelate ed espanse secondo le istruzioni del produttore per 1-2 passaggi prima dell'uso o del banking secondario
PurmorfeminaStemgent04-0009ricostituire a 10 mM in DMSO
Activina A ricombinantePeprotech120-14Erisospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
FGF2 umano ricombinantePeprotech100-18Brisospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
FGF-basico umano ricombinante (bFGF)Peprotech100-18Bresuppend a 100 µ g/mL in siero bovino allo 0,1%/albumina umana in PBS
ligando FLT3 umano ricombinanteR& Sistemi D308-FKHB o 308E-GMPrisospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
insulina umana ricombinanteBiogemme10-365
Kit-ligando umano ricombinanteR& Sistemi DBT-SCF o BT-SCF-GMPrisospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
LIF umano ricombinantePeprotech300-05resuppend a 100 µ g/mL nell'albumina sierica bovina/umana allo 0,1% nella PBS
TGF&beta umano ricombinante; 1Peprotech  100-21resuppend a 100 µ g/mL nell'albumina sierica bovina/umana allo 0,1% nella PBS
trombopoietina umana ricombinante R& Sistemi D288-TPN o 288E-GMPrisospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
transferrina umana ricombinanteMillipore SigmaT3705
raccomandante umano BMP4Peprotech120-05risospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
SB431543SelleckchemEpisodio 1067ricostituire a 10 mM in DMSO
SIGMAFAST, substrato di fosfatasi alcalina, cromogenico, compressaMillipore SigmaB5655sciogliere 1 compressa in 10 ml di acqua purificata
Selenito di sodioMillipore SigmaS5261
Stemolecola Y27632 in soluzioneStemgent04-0012-02Inibitore ROCK in soluzione (10 mM)
Reagente per dissociazione cellulare StemPro AccutaseThermo Fisher ScientificoCodice A11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher ScientificoA1067501Preparare il terreno XF-MSC mescolando 5 ml di StemPro MSC SFM XenoFree Supplement con 500 ml di StemPro MSC SFM Basal Medium. Il terreno aliquotato può essere crioconservato a -20°C.
StemSpan SFEMTecnologie StemCell9600
Thermo Scientific Mr. Frosty Contenitore per congelamentoThermo Fisher Scientifico5100-0001
Ulex europaeus agglutin I (UEA-1), biotinilatoLaboratori VectorB-1065-2Diluire 1:200 in soluzione bloccante per saggio fluorescente
VEGFPeprotech100-20risospensione a  (100 µ g/mL) in PBS sterile, albumina sierica umana o bovina allo 0,1%
Soluzione VerseneThermo Fisher Scientifico15040066
Matrice XF di vitronectinaTecnologie StemCell7180diluire a 40 & micro; L/mL nel tampone di diluizione CellAdhere
XAV939Sigma AldrichX3004ricostituire a 100 mM in DMSO
β-mercaptoetanoloThermo Fisher Scientifico21985-023sensibile alla luce

Riferimenti

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