Articolo metodologico

Deplezione mirata del nervo sensoriale corneale tramite iniezione sottocongiuntivale: un modello per lo studio dell'adesione batterica e delle interazioni neuroimmuni

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DOI:

10.3791/68614

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29 agosto 2025

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1New England College of Optometry

In questo articolo

Sommario

Questo studio stabilisce un modello raffinato per la deplezione del nervo sensoriale corneale utilizzando la bupivacaina, rivelando il suo impatto sul nervo corneale e sull'adesione batterica. Il modello simula le condizioni neuropatiche, fornendo informazioni sulle interazioni neuroimmunitarie nelle infezioni oculari e offrendo applicazioni nella somministrazione di farmaci, nella neuroprotezione, nella modulazione immunitaria e negli studi di modifica genica.

Abstract

I nervi sensoriali corneali svolgono un ruolo fondamentale nel sostenere l'integrità della superficie oculare e i meccanismi di difesa immunitaria. La perdita di questa innervazione è stata associata a una maggiore vulnerabilità all'invasione microbica, ma il contributo preciso della deplezione nervosa all'adesione batterica sulla cornea rimane non sufficientemente caratterizzato. Qui, presentiamo un metodo riproducibile e temporalmente controllato per la soppressione selettiva del nervo sensoriale corneale utilizzando bupivacaina, un bloccante dei canali del sodio a lunga durata d'azione. Combinando le vie di somministrazione sottocongiuntivale e topica, questa strategia a doppia applicazione raggiunge una denervazione robusta e sostenuta, consentendo un'indagine precisa su come l'input sensoriale alterato influenzi la suscettibilità dell'epitelio corneale alla colonizzazione batterica.

Utilizzando questo modello, studiamo come la denervazione sensoriale influenzi le dinamiche di adesione microbica per Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Pseudomonas aeruginosa, tre patogeni clinicamente rilevanti con distinti meccanismi di adesione. L'inoculazione batterica standardizzata tramite il metodo di blotting con salvietta da laboratorio garantisce una deposizione uniforme sulla superficie corneale, seguita da una valutazione quantitativa dell'adesione batterica. La deplezione nervosa indotta dalla bupivacaina è correlata a una ridotta densità del nervo corneale e a un aumento dell'adesione batterica, confermando un legame funzionale tra deplezione sensoriale e suscettibilità microbica.

Simulando condizioni neuropatiche come la neuropatia diabetica e la cheratite neurotrofica, questo approccio fornisce un nuovo quadro per lo studio delle interazioni neuroimmunitarie nelle infezioni oculari. Oltre ai modelli di infezione, questa strategia di iniezione sottocongiuntivale offre una piattaforma versatile per lo studio della farmacocinetica oculare dei farmaci, degli interventi neuroprotettivi e della modulazione immunitaria. Inoltre, può essere adattato per studi di modificazione genica, compresa la somministrazione sottocongiuntivale di costrutti CRISPR/Cas o vettori virali, ampliando le sue applicazioni nella ricerca oftalmica e terapeutica.

Introduzione

L'innervazione sensoriale corneale svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità della superficie oculare e dell'omeostasi immunitaria. La cornea è uno dei tessuti più densamente innervati del corpo, fornito prevalentemente dalla divisione oftalmica del nervo trigemino1. Questi nervi sensoriali non solo mediano la nocicezione e i riflessi dell'ammiccamento, ma regolano anche la proliferazione epiteliale, la guarigione delle ferite e la sorveglianza immunitaria 2,3. Qualsiasi interruzione dell'innervazione sensoriale può, quindi, compromettere la barriera corneale, alterando il microambiente della superficie oculare e aumentando la suscettibilità alle infezioni microbiche.

La disfunzione sensoriale corneale è associata a condizioni sistemiche come il diabete mellito e contribuisce a patologie oculari, tra cui la malattia dell'occhio secco, la cheratopatia diabetica, la cheratite neurotrofica e le complicanze post-chirurgiche 3,4,5,6,7,8,9,10 . La compromissione dei nervi sensoriali porta a una ridotta produzione di lacrime, assottigliamento epiteliale e guarigione ritardata delle ferite, che facilitano la colonizzazione batterica11,12. Tuttavia, il preciso legame meccanicistico tra la deplezione dei nervi sensoriali e l'adesione batterica rimane inadeguatamente compreso. Mentre gli studi hanno dimostrato un aumento dell'adesione batterica in seguito alla denervazione corneale, mancano modelli standardizzati che consentano un'indagine controllata di questa relazione.

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un modello mirato di deplezione del nervo sensoriale corneale utilizzando bupivacaina, un bloccante dei canali del sodio a lunga durata d'azione che imita la neuropatia clinica senza causare danni permanenti ai nervi 13,14,15. Questo approccio farmacologico fornisce un metodo controllato e riproducibile per studiare la deplezione del nervo corneale e i suoi effetti sulla superficie oculare15. Integrando questo modello con saggi di adesione batterica, possiamo valutare sistematicamente l'impatto della deplezione del nervo sensoriale sulla colonizzazione microbica, imitando aspetti chiave della cheratopatia diabetica e della cheratite neurotrofica.

L'adesione microbica è un evento precoce critico nelle infezioni corneali, influenzato dalla composizione del film lacrimale, dalle proprietà della superficie epiteliale e dalle risposte immunitarie dell'ospite. Tra i diversi patogeni in grado di colonizzare la superficie oculare, S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa rappresentano tre batteri clinicamente significativi con distinti meccanismi di adesione. P. aeruginosa, un batterio Gram-negativo altamente virulento, utilizza pili, flagelli e fattori di virulenza secreti per aderire rapidamente e invadere le cellule epiteliali corneali, portando spesso a grave cheratite ulcerosa16,17. Al contrario, S. epidermidis, un batterio commensale Gram-positivo, sfrutta prevalentemente le superfici epiteliali interrotte e le alterazioni del film lacrimale per stabilire biofilm, contribuendo a infezioni persistenti e spesso subcliniche18,19. Le differenze nelle strategie di adesione tra queste specie evidenziano la necessità di comprendere come la deplezione del nervo corneale alteri il microambiente oculare per favorire la colonizzazione batterica.

Una sfida chiave nello studio dell'adesione batterica è la scelta di un modello di inoculazione appropriato. Il modello convenzionale di lesione da graffio, frequentemente utilizzato negli studi sulle infezioni, crea difetti epiteliali per facilitare l'aderenza batterica. Sebbene efficace nella simulazione di infezioni indotte da traumi, questo approccio introduce significative variabili confondenti, tra cui un eccessivo danno tissutale e una risposta infiammatoria esagerata, che non rappresentano accuratamente le prime fasi della colonizzazione batterica nelle cornee neuropatiche. Inoltre, la variabilità delle lesioni meccaniche rende difficile ottenere risultati riproducibili. Per superare queste limitazioni, è necessario un metodo di inoculazione batterica più controllato e fisiologicamente rilevante.

La tecnica di blotting con salviette da laboratorio offre un approccio standardizzato alla deposizione batterica, garantendo un'aderenza batterica uniforme senza interrompere la barriera epiteliale20. Questo metodo imita da vicino gli scenari di suscettibilità del mondo reale, in cui l'adesione batterica si verifica in assenza di traumi meccanici evidenti ma in condizioni di composizione lacrimale alterata e omeostasi epiteliale. Eliminando la variabilità associata alle lesioni meccaniche, il metodo di wipe blotting di laboratorio fornisce una valutazione più accurata delle dinamiche di adesione microbica nelle cornee neuropatiche. Inoltre, consente la valutazione controllata dei contributi del film lacrimale alla colonizzazione batterica, che è particolarmente rilevante nei casi di disfunzione sensoriale corneale in cui la secrezione lacrimale è compromessa.

Dato il ruolo critico dei nervi sensoriali corneali nella regolazione della produzione lacrimale e dell'omeostasi epiteliale, è essenziale stabilire un modello riproducibile per studiare le conseguenze della deplezione del nervo sensoriale sull'adesione microbica. Questo studio mira a perfezionare un protocollo per la deplezione mirata del nervo sensoriale corneale utilizzando la bupivacaina, un anestetico locale a lunga durata d'azione, per valutarne gli effetti sulla secrezione lacrimale e sull'adesione batterica. Utilizzando una combinazione di applicazione di bupivacaina sottocongiuntivale e topica, questo approccio garantisce una deplezione sensoriale localizzata e sostenuta in un punto temporale definito di massima efficacia. Utilizzando questo modello, studiamo come la denervazione sensoriale altera le dinamiche di adesione di S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa, fornendo preziose informazioni sulla relazione tra deplezione nervosa, alterazioni del film lacrimale e suscettibilità microbica. Questi risultati hanno implicazioni più ampie per la comprensione della suscettibilità alle infezioni in condizioni neuropatiche come la cheratopatia diabetica e la cheratite neurotrofica e offrono una base per studi futuri sulle interazioni neuroimmuni oculari e sugli interventi terapeutici.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state eseguite in conformità con gli standard stabiliti dall'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il New England College of Optometry e hanno aderito alla politica PHS sulla cura e l'uso umano degli animali da laboratorio. Topi maschi e femmine di sei-otto settimane C57BL/6J (Wild-Type; ceppo n. 000664) sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory, e i topi sono stati allevati secondo normali ritmi circadiani (un ciclo luce/buio di 12 ore) e sono stati forniti cibo e acqua. Mantenere la tecnica sterile durante tutte le procedure.

1. Preparazione animale per iniezione sottocongiuntivale

  1. Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 2-3% in ossigeno tramite un vaporizzatore calibrato. Monitorare la profondità dell'anestesia verificando l'assenza di risposta riflessiva a un leggero pizzicamento delle dita.
  2. Osservare continuamente l'animale per eventuali segni di grave disagio o angoscia.
  3. Se si osserva angoscia, indurre un'anestesia profonda con isoflurano al 5% e confermare l'inrisposta.
  4. Eseguire la lussazione cervicale per garantire l'eutanasia.
  5. In caso contrario, eseguire immediatamente l'enucleazione utilizzando una pinza per enucleazione curva per le analisi a valle.

2. Blocco del nervo corneale mediante iniezione sottocongiuntivale

NOTA: Implementare un protocollo in due fasi che coinvolge l'iniezione sottocongiuntivale e l'applicazione topica di bupivacaina per ottenere una deplezione mirata del nervo sensoriale corneale. Completare le iniezioni sottocongiuntivali e le applicazioni topiche entro 15 minuti per ridurre al minimo l'esposizione sistemica all'anestetico.

  1. Preparazione del sito e incisione
    1. Creare una piccola incisione (~0,5 mm) nella regione limbare superotemporale utilizzando un ago da 30 G. Evita i vasi sanguigni e riduci al minimo il trauma tissutale. Utilizzare l'incisione per accedere allo spazio sottocongiuntivale per la somministrazione controllata del farmaco.
  2. Iniezione di bupivacaina
    1. Preparare una soluzione di bupivacaina cloridrato allo 0,5% in condizioni sterili.
    2. Caricare 5 μl di soluzione in una siringa Hamilton da 10 μl dotata di un ago smussato a mozzo piccolo da 33 G (tipo di punta 3).
    3. Iniettare la soluzione nello spazio sottocongiuntivale con un angolo di 15-20° per ridurre al minimo il reflusso e garantire una distribuzione uniforme.
    4. Osservare la formazione di bolle nel sito di iniezione; Lasciarlo persistere per 5-10 s e disperderlo all'interno della tasca sottocongiuntivale fino a completo assorbimento.
  3. Rinforzo topico della desensibilizzazione corneale
    1. Applicare altri 5 μl di bupivacaina allo 0,5% direttamente sulla cornea centrale subito dopo l'iniezione sottocongiuntivale.
      NOTA: Utilizzare questo passaggio per migliorare la desensibilizzazione dei nervi superficiali e prolungare l'effetto dell'anestetico locale.
  4. Gruppo di controllo
    1. Somministrare 5 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tramite iniezione sottocongiuntivale e applicazione topica in momenti identici per gli animali di controllo. Abbinare le fasi procedurali e il volume per tenere conto degli effetti correlati all'iniezione.
  5. Analisi della durata del trattamento e dell'end point
    1. Somministrare il trattamento con bupivacaina a giorni alterni per 15 giorni per ottenere una deplezione prolungata dei nervi sensoriali riducendo al minimo la tossicità.
    2. Il giorno 15, sopprimere i topi 4 ore dopo il trattamento finale con bupivacaina utilizzando isoflurano al 5% in ossigeno tramite un vaporizzatore calibrato, seguito da lussazione cervicale.
    3. Prelevare immediatamente le cornee da un gruppo di topi (vedere il passaggio 5.5.) per valutare le alterazioni della densità nervosa utilizzando l'immunoistochimica (vedere la Figura 1 e la Sezione 6 del protocollo) e da un altro gruppo per l'analisi dell'adesione batterica (vedere la Figura 1 e la Sezione 5 del protocollo).

3. Preparazione animale per l'inoculazione batterica

  1. Somministrare ketamina intraperitoneale (80-100 mg/kg) e dexmedetomidina (0,25-0,5 mg/kg) per anestetizzare i topi quattro ore dopo l'iniezione finale di bupivacaina e l'applicazione topica il giorno 15.
  2. Confermare l'anestesia profonda verificando l'assenza di risposte riflesse al pizzicamento delle dita dei piedi.
  3. Sciacquare la superficie oculare 3 volte utilizzando una pipetta con 5 μl di PBS sterile per rimuovere il liquido lacrimale residuo e i detriti, garantendo una superficie corneale pulita per gli studi di adesione batterica (vedi Figura 1)
  4. Nel gruppo sperimentale designato, utilizzare un panno privo di lanugine da laboratorio per tamponare la superficie corneale in modo standardizzato.
    1. Piega la carta velina per garantire una presa sicura.
    2. Strofinare delicatamente la cornea del topo anestetizzato 4 volte, iniziando dalla cornea centrale e utilizzando un movimento rotatorio a destra e a sinistra per includere le regioni periferiche20.
      NOTA: Applicare una pressione minima per evitare lesioni meccaniche e rimuovere efficacemente il liquido lacrimale per facilitare l'adesione batterica.

4. Preparazione dell'inoculo batterico e inoculazione corneale

  1. Coltura batterica e preparazione
    1. Coltura di S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 e P. aeruginosa O1 su agar di soia triptica (TSA) e incubazione a 37 °C con acqua sterile posta nell'incubatore per mantenere l'umidità.
    2. Raccogliere singole colonie e sospenderle in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Centrifugare la sospensione a 5.000 × g per 5 minuti una volta per rimuovere le cellule morte e i sottoprodotti metabolici.
    3. Risospendere il pellet batterico in PBS e regolare la concentrazione a ~10¹¹ CFU/mL per garantire un'elevata carica batterica per gli studi di adesione.
  2. Protocollo di inoculazione corneale
    1. Applicare un'aliquota di 5 μl della sospensione batterica preparata sulla superficie corneale una volta ogni ora per 4 ore in anestesia prolungata.
    2. Posizionare i topi con una leggera inclinazione per evitare il deflusso e garantire un'esposizione costante all'inoculo.
    3. Ripetere l'inoculazione a intervalli di un'ora per imitare l'esposizione batterica persistente rilevante per gli scenari clinici di infezione.
  3. Eutanasia post-inoculazione e valutazione dell'adesione batterica
    1. Dopo 4 ore, somministrare un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) per garantire un'anestesia profonda.
    2. Eseguire la lussazione cervicale per sopprimere i topi in modo umano.
    3. Enucleare gli occhi utilizzando una pinza sterile a punta curva, mantenendo rigorose condizioni asettiche per prevenire la contaminazione.
    4. Sciacquare la superficie oculare 5-6 volte con 2 ml sterili di PBS in una capsula di Petri agitando delicatamente per rimuovere accuratamente i batteri non aderenti.
    5. Omogeneizzare gli occhi enucleati in 1 mL di PBS sterile utilizzando un omogeneizzatore tissutale meccanico per garantire un recupero batterico costante e mantenere condizioni asettiche per prevenire la contaminazione.
    6. Eseguire diluizioni seriali di sei volte dell'omogenato in PBS sterile.
    7. Aliquotare su piastre TSA e incubare per una notte a 37 °C per consentire la crescita delle colonie.
    8. Contare le unità formanti colonie (CFU) ed esprimere i risultati come CFU logaritmiche per cornea per il confronto quantitativo.

5. Immunoistochimica

  1. Eutanasia dei topi tramite lussazione cervicale il giorno 15 dopo il trattamento.
  2. Enucleare accuratamente gli occhi e risciacquare una volta con PBS a temperatura ambiente con una leggera rotazione.
  3. Fissare gli occhi enucleati in paraformaldeide al 2% (PFA) per 1 ora per preservare l'integrità strutturale
  4. Lavare gli occhi fissi 3 x 10 min in 1 mL di PBS con una leggera rotazione a temperatura ambiente.
  5. Seguire il protocollo di dissezione corneale precedentemente descritto 21,22
    1. Sezionare le cornee all'interno di una piastra di Petri larga 35 mm riempita con una quantità minima di PBS.
    2. Usa una pinza a lama dritta per stabilizzare l'occhio enucleato e forbici chirurgiche per creare una piccola incisione nella parte posteriore del globo.
    3. Utilizzare il piccolo punto di incisione per tagliare con cura lungo l'aspetto posteriore a 360°.
    4. Scartare la retina murina, il nervo ottico, il cristallino, il pigmento dell'iride e qualsiasi altra struttura tissutale che non sia la cornea.
    5. Rimuovere il tessuto in eccesso utilizzando una pinza a lama dritta o incidendo accuratamente con le forbici chirurgiche mantenendo intatta la cornea.
    6. Lavare le cornee sezionate 3 x 10 minuti in 1 mL di PBS poste in provette da microcentrifuga a rotazione delicata a temperatura ambiente.
  6. Incubare le cornee in 1 mL di soluzione bloccante (3% BSA + Triton X-100 in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente con rotazione continua.
  7. Migliorare la permeabilizzazione dei tessuti incubando le cornee in 1 mL di EDTA al 20% per un'ora aggiuntiva nelle stesse condizioni.
  8. Incubare le cornee per una notte a 4 °C con l'anticorpo primario anti-β-tubulina III di coniglio mediante rotazione delicata a temperatura ambiente.
  9. Il giorno seguente, incubare i tessuti con l'anticorpo secondario IgG di capra coniugato Alexa Fluor 488 e DAPI per la colorazione nucleare per 2-3 ore a 4 °C al buio.
  10. Lavare le cornee 3 x 10 minuti con PBS sotto leggera rotazione.
  11. Seguire il protocollo di montaggio piatto corneale descritto in precedenza 21,22
    1. Montare in piano le cornee colorate su vetrini posizionando la cornea sul bordo del vetrino per rimuovere il liquido in eccesso.
    2. Riposizionare la cornea al centro del vetrino da microscopio con il lato epiteliale rivolto verso il basso, a contatto con la superficie del vetrino.
    3. Praticare quattro incisioni diritte (1-2 mm di lunghezza) dal bordo periferico verso il centro utilizzando una lama chirurgica per creare semiquadranti.
    4. Applicare 20 μl di montante e posizionare un vetrino coprioggetti da 8 mm sulla cornea.
    5. Premere delicatamente sul vetrino coprioggetti per rimuovere eventuali bolle d'aria e prevenire la formazione di rughe della cornea.
    6. Conservare il campione a temperatura ambiente al buio per l'essiccazione.
    7. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con una protezione trasparente per le unghie per evitare che si secchino all'aria e conservare i vetrini al buio fino al momento dell'imaging.

6. Imaging

  1. Eseguire la microscopia confocale utilizzando un microscopio confocale verticale a due fotoni con un obiettivo a immersione in acqua 20x/1,00 NA.
  2. Posizionare i campioni montati in piano sul tavolino del microscopio e impostare la lente dell'obiettivo a immersione in acqua 20x/1,00 NA.
  3. Abbassare le luci della stanza e coprire il microscopio con un panno nero opaco per ridurre al minimo l'interferenza della luce esterna durante l'imaging.
  4. Visualizza i nervi corneali utilizzando il canale laser Alexa Fluor a 488 nm e rileva i nuclei cellulari utilizzando il canale laser DAPI a 405 nm.
  5. Impostate le dimensioni del fotogramma su 1.536 x 1.536, il foro stenopeico su 1 unità Airy (AU) e la velocità di scansione su 1,02 μs. Abilita la scansione bidirezionale e applica la media 2x.
  6. Regola il guadagno master (~750 V) e riduci al minimo l'intensità della potenza del laser per prevenire il fotobleaching e la fototossicità, garantendo al contempo un'acquisizione nitida dell'immagine.
  7. Esegui l'imaging Z-stack per acquisire l'intero spessore corneale. Impostare il primo piano focale in corrispondenza dell'aspetto più anteriore e l'ultimo in corrispondenza dell'aspetto più posteriore del campione.
  8. Acquisizione di stack Z a intervalli di 0,8 μm o 1,0 μm, acquisendo circa 60 - 80 stack totali per campione.
  9. Valutazione della densità del nervo corneale
    1. Analizza la densità dei nervi corneali utilizzando il software Imaris.
    2. Confermare l'intero spessore dell'immagine controllando le dimensioni del volume.
    3. Abilita l'opzione di rendering del volume per generare una ricostruzione 3D.
    4. Crea una proiezione di intensità massima per convertire lo Z-stack in una vista 2D per la visualizzazione e la quantificazione.
    5. Classificare la densità del nervo corneale su una scala da 0 a 10 da valutatori in cieco per garantire una valutazione obiettiva.

7. Analisi statistica

  1. Valutare la distribuzione dei dati utilizzando i test di Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov.
  2. Se la maggior parte dei dati segue una distribuzione normale, presentare i risultati come media ± deviazione standard (SD).
  3. Per i confronti tra due gruppi, applicare il test t di Student e utilizzare l'ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Tukey per le analisi che coinvolgono tre o più gruppi.
  4. Considera un valore p < 0,05 statisticamente significativo.

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Risultati

Se non diversamente specificato, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in modo indipendente in triplicato, con ogni replica che includeva 3-4 topi per gruppo.

Riduzione significativa della densità del nervo corneale dopo il trattamento con bupivacaina
Per valutare sistematicamente l'impatto della deplezione mirata del nervo sensoriale corneale, la densità del nervo corneale è stata valutata utilizzando l'immunomarcatura e la microscopia confocale. I topi hanno ricevuto ...

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Discussione

I nervi sensoriali corneali svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità della superficie oculare, nella regolazione dell'omeostasi epiteliale e nella modulazione delle risposte immunitarie. La neurite corneale, caratterizzata da degenerazione e infiammazione dei nervi, è comunemente osservata in condizioni sistemiche come il diabete mellito, dove l'iperglicemia cronica contribuisce alla neuropatia periferica, inclusa la perdita del nervo corneale. Gli studi hanno dimos...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di bupivacaina cloridrato allo 0,5% Pfizer INC. Stati UnitiNDC 00409-1162-01
Ferri da 30 gProduttore: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA305106
33 G ago smussato con mozzo piccolo (tipo a punta 3) Hamilton Company, Reno, NV, Stati Uniti7803-05
4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridratoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati UnitiD1306
Albumina sierica bovinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiCodice: A7906
C57BL/6J (Wild-Type) topiLaboratorio Jackson. 000664
Rotatore cantrifugoIl deposito del laboratorio, Inc. (Dawsonville, GA, Stati Uniti)Anno 2020
Protettore per unghie trasparenteUmido e selvaggioN/A
Microscopio da dissezione (SMZ-160-TLED Microscopio stereo (da dissezione) con porta trinoculare)Stellar Scientific (Baltimora, MD, Stati Uniti)1.1002E+12
Acido etilendiamminatetraaceticoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiE6511
Capra anti-Coniglio IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati UnitiA-11008
Hamilton 10-μ L siringaHamilton Company, Reno, NV, Stati Uniti7635-01
Micro forbici da dissezione ad alta precisioneThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti08-953-1B
IsofluranoVeterinario di Patterson, Stati Uniti07-890-8115
Vaporizzatore di isofluranoKent Scientific, Stati UnitiVETFLO1205S
Cloridrato di ketaminaProdotti veterinari Dechra, Overland Park, KS, Stati UnitiDP00050
Carta velina Kimwipe senza lanugineKimberly-Clark Professional, Roswell, GA, Stati Uniti34155
Pinza per micro-dissezione anteriore curva (per enucleazione)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiF4142-1EA
Pinza per micro-dissezione dritta davantiSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiF4017
Piastre di Petri (100 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti263991
Piastre di Petri (35 mm)Avantor, tramite VWR International (Radnor, PA, USA).25373-041
Soluzione salina tamponata con fosfati Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, Stati UnitiC987D24
ProLong Montante Oro AntisbiadimentoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati UnitiP36930
Coniglio anti-beta;-Tubulina IIISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) T2200
Vetrino di copertura rotondo in vetro tedesco (8 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti50-949-314
Manici per bisturiSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) S2896-1EA
Vetrini per microscopioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) S8902-1PAK
Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione con tappo a scattoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti3453
Sorvall Instruments RT6000B Centrifuga da bancoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti3367898
Lame per piume chirurgicheWorld Precision Instruments (Sarasota, FL, USA)504169 
Agar di soia tripticoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 22091
Xilazina Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti1236-20-8

Riferimenti

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