Articolo metodologico

Modello di resezione tumorale rilevante per traduzione per modelli preclinici di murina di carcinoma squamoso orale

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DOI:

10.3791/68621

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3 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Katz Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, School of Dentistry, 2Department of Head and Neck Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Bioengineering, Rice University

In questo articolo

Sommario

Qui viene mostrato un metodo unico per resezionare chirurgicamente tumori carcinoma squamoso orale stabiliti nella cavità orale.

Abstract

Attualmente, il trattamento di prima linea per la forma più comune di carcinoma a cellule squamose di testa e collo (HNSCC), il carcinoma a cellule squamose orali (OSCC), è la resezione chirurgica, seguita da trattamenti adattati al rischio, come la chemioradioterapia. Tuttavia, con l'attuale standard di cura e persino l'emergere di nuovi trattamenti, come il blocco dei checkpoint, la sopravvivenza complessiva per malattie avanzate e ricorrenti rimane elevata, e si prevede che la prevalenza del cancro alla testa e al collo continuerà ad aumentare nei prossimi anni. Pertanto, è necessaria un'indagine più approfondita sulle attuali modalità standard di cura, oltre a nuove terapie, per trasmettere opzioni terapeutiche potenziali e promettenti ai pazienti con HNSCC. I modelli preclinici vengono utilizzati per valutare la sicurezza e l'efficacia dei potenziali interventi terapeutici. Purtroppo, i modelli preclinici attuali non riescono a rappresentare pienamente la procedura chirurgica che molti pazienti ricevono, poiché riguardano principalmente modalità di trattamento non chirurgiche, come radioterapia, chemioterapia o immunoterapia. Inoltre, i modelli chirurgici esistenti sono limitati da reagenti aggiuntivi necessari per supportare l'insediamento di tumori nei siti ortotopici e la necessità di microchirurgia per la rimozione del tumore. Ciò richiede la generazione di modelli preclinici migliorati e semplificati per indagare le terapie e ottenere informazioni sulla ricaduta tumorale locoregionale e sulla resistenza al trattamento. Questo articolo descrive un nuovo modello di resezione subtotale murina ortotopica clinicamente rilevante e sintegenea che riproduce lo standard di cura nell'OSCC. Questo modello semplifica i modelli esistenti e porta a una recidiva misurabile dopo la resezione chirurgica dei tumori mucosari bucali. L'uso di questo modello potrebbe portare a preziose informazioni sulla recidiva tumorale e sulla resistenza al trattamento nei pazienti con OSCC. L'istituzione di questo modello preclinico apre la strada a ulteriori studi su come l'OSCC risponda alle terapie adiuvanti post-resezione, catturando lo stato tumorale nella finestra clinicamente rilevante in cui i pazienti generalmente iniziano tali trattamenti successivi.

Introduzione

Le neoplasie maligne che si originano nella laringe, faringe, ipofaringe, cavità nasale, ghiandole salivali e cavità orale sono classificate come tumori della testa e del collo. Il carcinoma a cellule squamose di testa e collo (HNSCC), che rappresenta oltre il 90% di questi casi, si sviluppa dalle cellule epiteliali squamose che rivestono questi sitianatomici 1. Più specificamente, il carcinoma squamoso della cavità orale (OSCC) è una malignità confinata alla regione orale. Nel 2022, il cancro alla testa e al collo era il sesto cancro più diffuso a livello mondiale, con una stima di 947.000 nuovi casi registrati e 482.000 decessiannuali 2.

La resezione chirurgica è generalmente la modalità di trattamento di prima linea per i tumori alla testa e al collo, inclusi gli OSCC, spesso seguita dalla chemioradioterapia 1,3,4. Sebbene queste terapie standard di cura siano potenzialmente curative nei casi localmente limitati o in fase iniziale, rimane un alto tasso di recidiva locoregionale e distante nei pazienti con OSCC. Infatti, meno di due terzi dei pazienti con OSCC sopravvivono oltre cinque anni e subiscono effetti collateralisignificativi 5,6,7. Ci sono sempre più evidenze che lo stress traumatico subito durante l'intervento chirurgico innescano i processi fisiologici coinvolti nel danno ai tessuti e nella guarigionedelle ferite 8,9. Inoltre, studi hanno anche riportato che la resezione chirurgica contribuisce a disfunzioni immunologiche che a loro volta possono contribuire al potenziale direcidiva 10.

Nonostante la maggior parte dei pazienti sia sottoposta a resezione chirurgica come terapia di prima linea per l'OSCC, attualmente rimane la necessità di modelli preclinici rilevanti di resezione ortotopica per l'OSCC che standardizzino l'instaurazione dei tumori e la resezione subtotale e preservino i meccanismi immunologici associati alla recidiva tumorale al fine di fornire un contesto critico per la ricerca in questoambito 11, 12,13. Studi precedenti che riportano modelli di resezione animale includono un modello di resezione del tumore mammario 4T1 utilizzato per studiare gli effetti immunosoppressivi dell'interventochirurgico 14. Per gli studi sull'OSCC, è stato segnalato l'uso di un modello eterotopico di resezione subtotale tumorale MOC1-OVA nel fianco murino15. Nei siti ortotopici, l'uso della linea cellulare orofaringea dell'HPV, mEERL95, è stato impiegato per stabilire tumori submentali per la modellazione della resezione e recidiva, mentre si trasferiva chirurgicamente linfonodi drenanti a topi naïvi per ulteriori studi16. Sono stati inoltre riportati studi ortotopici rilevanti che indagano la recidiva utilizzando topiimmunodeficienti 13.

Qui si trova un protocollo di recente istituzione per un modello immunocompetente, singeneico e ortotopico OSCC di chirurgia standard di cura per la sopravvivenza e recidiva della resezione tumorale, osservato entro una settimana dalla resezione. Questa procedura semplifica ulteriormente i modelli esistenti eseguendo la rimozione del tumore senza microchirurgia e utilizzando la linea cellulare del tumore orale murino (MOC2), che non richiede l'aggiunta di matrice cellulare o di membrana basale per stabilire i tumori.

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Protocollo

La seguente procedura, così come l'alloggio e la manutenzione degli animali, è stata condotta presso il Center for Laboratory Animal Medicine and Care presso il University of Texas Health Science Center a Houston (UTHealth), in coordinamento con il Comitato per il Benessere Animale dell'istituzione. Il protocollo associato è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ed è conforme ai principi e alle linee guida etiche delineate nella politica del Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti sulla cura e l'uso umano degli animali da laboratorio. Si prega di assicurarsi che tutte le politiche stabilite dall'IACUC locale vengano rispettate e che sia in vigore un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'IACUC (o equivalente) prima di procedere con le seguenti sezioni. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Stabilimento dei tumori ortotopici della mucosa bucale orale

NOTA: Per questo protocollo specifico, sono state utilizzate cellule MOC2 per stabilire itumori 17. Tuttavia, possono essere utilizzate anche altre linee o tipi cellulari. La quantità di cellule tumorali necessarie per stabilire tumori in vivo dipende dalla linea cellulare e deve essere ottimizzata prima dell'inoculazione per l'intervento chirurgico.

  1. Quando la coltura cellulare tumorale raggiunge circa l'80% di confluenza, si prelevano le cellule aspirando e scartando il materiale di coltura.
  2. Per rimuovere il siero residuo, lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza magnesio e calcio, in volume sufficiente a coprire completamente la superficie del vaso (ad esempio, la fiaschetta) con le cellule attaccate.
  3. Aggiungere lo 0,05% di tripsina alla fiaschetta di coltura per coprire sufficientemente il fondo. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per circa 5 minuti per il distacco cellulare.
    NOTA: Il periodo di incubazione richiesto (2-15 minuti) per staccare le cellule può variare a seconda delle cellule (cioè la linea cellulare) utilizzate. Tuttavia, un'esposizione prolungata alla tripsina può danneggiare le cellule. Se è necessario tempo aggiuntivo per un adeguato distacco cellulare, monitorare le cellule periodicamente e da vicino.
  4. Dopo aver osservato il distacco cellulare, tempre con almeno 2 volte il volume di tripsina usato con un mezzo intero (ad esempio, per 5 mL di tripsina, temprare con almeno 10 mL di mezzo completo).
  5. Centrifugare la sospensione della cella a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il soprandante.
  6. Risospendi in cold PBS e prendi un'aliquota per il conto. Ripeti i passaggi 1.5-1.6 per un lavaggio aggiuntivo e rimuovere eventuali residui di materiale.
  7. Utilizzando PBS aggiuntivo, si regola alla concentrazione ottimizzata delle cellule per l'inoculazione (cioè 3 x 10cellule da 4 MOC2 per volume di 30 μL). Tieni la sospensione delle celle sul ghiaccio fino a quando non sei pronta all'uso.
  8. Anestetizzare il topo usando isoflurano 1%-3%, integrato con 1,5 L/min di ossigeno in una camera per piccoli animali.
    NOTA: La depilazione non è necessaria ma è raccomandata in questa fase per aiutare a visualizzare il sito di inoculazione e migliorare la consistenza dell'inoculazione. Se rimuovi in questa fase, segui le istruzioni dei passaggi 3.3-3.5.
  9. Mescola accuratamente la sospensione cellulare per garantire una distribuzione uniforme delle cellule e raccogli in una siringa di insulina da 0,3 mL.
  10. Immobilizzare il topo sedato spalmando la parte posteriore del collo con una mano in modo che il lato anteriore murino sia rivolto verso il conduttore e la testa verso l'alto per permettere alla bocca di essere aperta e accessibile.
  11. Inserire con attenzione la siringa nella bocca aperta, inclinandosi verso il basso verso il vestibolo mandibolare inferiore sinistro. Continua a inserire l'ago attraverso la mucosa buccale inferiore.
  12. Somministrare 30 μL di sospensione cellulare in questa regione e rimuovere con cura la siringa, mantenere questa posizione per 5 secondi, poi ritirare lentamente la siringa per evitare di inseguire ulteriori sospensioni cellulari al momento della rimozione.
  13. Assicurarsi che il topo sia in condizioni fisiche e comportamentali normali dopo l'inoculazione.
  14. Monitorare il peso del mouse e la crescita tumorale con un bilanciere e un calibro digitale, rispettivamente. Monitorare regolarmente lo sviluppo del tumore, 2 volte a settimana o secondo il protocollo specificato.

2. Configurazione dei materiali per l'intervento chirurgico

NOTA: È fortemente raccomandato che almeno un altro chirurgo o assistente chirurgico sia presente per assistere nell'allestimento e nell'organizzazione durante tutta la procedura per garantire il mantenimento della sterilità.

  1. Scegli una sala procedura pulita, con una porta chiudibile e traffico limitato.
  2. Preriscalda una nuova gabbia, con biancheria pulita e asciutta e un nido di carta assorbente, posandola parzialmente sopra uno scaldabaglie elettrico.
  3. Riscalda uno sterilizzatore a perline fino alla temperatura di funzionamento (250-265 °C).
  4. Installare la camera di induzione con isoflurano e il dispositivo portatile di anestesia, con il cono nasale appropriato, e collegarsi all'isoflurano, all'ossigeno e al relativo sistema di recupero della zona.
    NOTA: Quando si utilizza la camera di induzione, anestetizzare i topi con una regolazione di circa il 3% di isoflurano. Quando si utilizza il cono nasale, anestetizzare i topi con isoflurano dall'1%-2%.
  5. Accendi il tampone chirurgico riscaldato ad acqua a 38,9 °C e fissa la fonte di isoflurano sulla testa del tampone.
  6. Sterilizza la superficie di lavoro prevista e il pad chirurgico con un disinfettante e copri lo spazio di lavoro con un pad da banco pulito.

figure-protocol-1
Figura 1: Strumenti chirurgici selezionati e materiali per la resezione tumorale. (1) Guanti chirurgici, (2) drappeggio, (3) garza, (4) siringa di insulina da 0,3 mL, (5) drappeggio con asciugamano, (6) tampone con alcool isopropilico, (7) lama del bisturi, (8) bisturi senza lama, (9) emostato Hartman, (10) pinza emostatica a zanzanzare, (11) forbici microdisseccanti, (12) pinze microdisseccanti, (13) pinze Brown-Adson, (14) pinze microdisseccanti, (15) applicatori con punta di cotone, (16) tagliadori, (17) sutura di vicryl rivestita 4-0, (18) bupivacaina al 0,25% e (19) unguento lubrificante per gli occhi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico

  1. Pesare il topo 24 ore prima della procedura per determinare il dosaggio appropriato di anestesia e antidolorifico, secondo il protocollo specificato.
  2. Anestetizzare il topo nella camera di induzione per circa 2 minuti, poi somministrare analgesici almeno 30 minuti prima dell'intervento. Questo dovrebbe essere iniettato sottocutaneamente alla nuca del collo murino.
  3. Se non è stato fatto in precedenza al momento dell'inoculazione o se i peli già ripuliti hanno iniziato a ricrescere, aggiungere una piccola quantità di crema depilatoria utilizzando un applicatore a punta di cotone direttamente sul pelo nel sito della resezione tumorale, con margini sufficienti per tenere i peli fuori dallo spazio dell'incisione durante la procedura.
  4. Lascia riposare la crema per circa 10 secondi e asciuga i capelli con una garza asciutta e pulita.
  5. Rimuovi eventuali residui di crema dal sito con garze inumidite con soluzione salina o acqua, poi asciuga l'area con una garza asciutta e pulita.
    NOTA: La depilazione tramite un depilatore elettronico è un metodo alternativo accettabile ma meno preferito, poiché la pelle intorno a testa e collo può essere sottile e delicata. Se usi un tagliacapelli, assicurati di evitare le zone sensibili, come gli occhi, e tieni la pelle flaccida tesa per evitare infortuni indesiderati al topo.
  6. Somministrare analgesico sistemico sottocutaneo e analgesico locale nel sito dell'incisione.
  7. Posiziona il topo anestetizzato sul cuscinetto riscaldante, sdraiato sulla schiena con il lato anteriore rivolto verso l'alto. Il suo muso dovrebbe essere appena dentro il coperchio del cono nasale.
  8. Applicare una piccola quantità (cioè sufficiente a coprire l'occhio) di unguento lubrificante sterile su ciascun occhio del topo per evitare la secchezza degli occhi durante la procedura.
  9. Utilizzando un applicatore pulito a punta di cotone, tampona il sito della resezione con alcol isopropilico al 70% seguito da iodio al 10% 3 volte, assicurandoti di rimuovere lo iodio dopo l'ultima passata con alcol isopropilico al 70%.
  10. Indossando guanti sterili e attrezzature di protezione individuale appropriate (accappatoio, copricapelli), preparare il campo sterile di almeno 18"L x 26"L e disporre tutti gli strumenti e materiali appropriati (garza di cotone sterile, cotton fioc sterili, soluzione salina sterile, applicatori di alcol isopropilico, strumenti chirurgici) (Figura 1).
  11. Copri il topo con un drappo sterile e fai un foro di accesso immediatamente sopra il sito della resezione usando forbici sterili.

4. Resezione chirurgica di tumori orali consolidati

NOTA: Durante tutta la procedura, il chirurgo o l'assistente dovrebbe controllare la respirazione e il riflesso del topo per garantire un'ossigenazione adeguata mentre è sotto anestesia. Regolare l'isoflurano in conformità con le linee guida veterinarie e le politiche istituzionali secondo necessità.

  1. Utilizzando un nuovo bisturi chirurgico, si crea un'incisione submandibolare appena sotto il tumore e lungo la linea della mascella sinistra, occupando tutta la lunghezza del tumore (Figura 2A,B).
  2. Usa con attenzione gli emostati di Hartman per allargare l'apertura verso il tumore. Se necessario, tampona il sangue con una garza sterile.
  3. Individua il tumore e usa le pinze per tenerlo fermo (Figura 2B).
    NOTA: Un assistente può aiutare a questo punto nell'uso delle pinze per mantenere l'accesso al sito tumorale (cioè per rimuovere la pelle).
  4. Utilizzando forbici chirurgiche, taglia intorno alla base del tumore per resezionare tutte le porzioni visibili (Figura 2C). Riposizionare la pelle sopra il sito tumorale resezionato e chiudere l'incisione con da quattro a sei suture interrotte, utilizzando suture vicryl 4-0 a lunga durata (Figura 2D).
    NOTA: Fai attenzione a non fissare le suture troppo strette per preservare la pelle senza danneggiare ulteriormente i topi, oltre a prevenire potenziali lesioni in caso di rimozione successiva delle suture.
  5. Per proseguire con ulteriori interventi, pulisci le superfici degli strumenti chirurgici con alcol isopropilico al 70% e inseriscili nello sterilizzatore a perline riscaldate per 10-15 secondi prima di ogni ulteriore utilizzo. Lo stesso set di strumenti può essere utilizzato per eseguire interventi chirurgici fino a 5 topi o, come specificato dalle linee guida e dalle pratiche istituzionali.
    NOTA: I tumori resezionati possono essere scartati o prelevati per l'elaborazione e ulteriori analisi (cioè, fissazione per istologia e imaging; dissociazione tissutale e colorazione immunitaria per l'analisi fenotipica della citometria a flusso, secondo i piani sperimentali specificidello studio di ricerca 18,19 (Figura 2E).

figure-protocol-2
Figura 2: I tumori orali, sviluppati transoralmente attraverso la mucosa buccale inferiore, possono essere resezionati tramite approccio submandibolare senza complicazioni di guarigione. (A) Tumore stabilito (freccia rossa) nella cavità orale. (B) Incisione submandibolare che espone il tumore. (C) Il tumore resezionato. (D) Chiusura della ferita con più suture vicryle interrotte. (E) Tumore espulso. (F) Schema riassuntivo per l'inoculazione transorale. Immagine creata in BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Cura post-resezione

  1. Dopo aver chiuso l'incisione, interrompere il flusso anestesico allo 0% e continuare solo O2 a 1,5 L/min finché il topo non inizia a riprendere conoscenza (meno di 5 minuti). Se il topo rimane immobile e non reattivo dopo diversi minuti, si rivolge alle politiche istituzionali sull'intervento veterinario.
  2. Trasferisci delicatamente il topo nella gabbia già riscaldata. Continuare a monitorare il topo per la coscienza e la mobilità post-operatorie. Dovrebbe ritrovare piena coscienza e mobilità entro 10 minuti.
  3. Effettuare il monitoraggio post-operatorio giornaliero in conformità con il protocollo approvato e le politiche istituzionali.
  4. Subito dopo l'intervento, fornisci cibo "morbido" al topo inserendo pellet immersi in acqua in un contenitore accessibile (cioè una pesatrice di plastica) direttamente nella gabbia. Se non si verificano complicazioni, il topo può riprendere a mangiare cibo solido normale al poppata di routine successiva.
  5. Monitorare i topi due volte al giorno per le prime 48 ore (2 giorni) e una volta al giorno per un minimo di 96 ore (4 giorni) dopo l'operazione. Successivamente, riprendi un normale programma di monitoraggio (cioè 2 volte a settimana).
  6. Al settimo giorno post-intervento, rimuovere i punti sotto anestesia, facendo attenzione a non tagliare o ferire i topi.
  7. Continuare a monitorare i topi e, una volta raggiunto il loro punto di riferimento umano, sopprimere gli animali in modo umano secondo i criteri di eutanasia approvati e l'American Veterinary Medical Association.
    NOTA: L'analisi statistica della cinetica della crescita tumorale e della sopravvivenza animale sono metriche rilevanti per questa metodologia. Per le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier, sono state effettuate analisi statistiche utilizzando il log rank/test di Mantel-Cox tramite software di analisi statistica. Per le curve di crescita tumorali, il test di confronto multiplo di Šídák tramite un'analisi ANOVA bidirezionale è stato utilizzato per confrontare le dimensioni tumorali tra gruppi non sezionati e resezionati. I valori p inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.

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Risultati

Osservazioni della mucosa buccale murina MOC2
Utilizzando la linea cellulare MOC2, sono stati stabiliti tumori nella mucosa bucale murina della cavità orale (Figura 2A-F). I tumori primari consolidati sono stati resezionati con una dimensione tumorale di 25-36mm2. Al momento della resezione, i topi di solito hanno recuperato la mobilità completa entro 5-10 minuti. I topi sono stati successivame...

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Discussione

In questo articolo, questo articolo descrive una procedura semplice per l'instauramento e la resezione subtotale dei tumori nella mucosa buccale della cavità orale nei topi. Studi precedenti hanno dimostrato analogamente la fattibilità di stabilire tumori tramite la lingua murina, la mucosa buccale o il pavimento della bocca per l'analisi a valle dei tumori resezionati, nonché per indagare la successiva recidiva locale e la metastasi regionale e distante, ciascuna con le proprie

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Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da 1R21DE034543 (NIH-NIDCR). Riconosciamo inoltre il personale amministrativo, veterinario e di manutenzione del UTHealth Center for Laboratory Animal Medicine and Care per il loro supporto e la loro cura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% tripsinaCorning25-052-Cl0,53 mM EDTA, 1 X bicarbonato di sodio  
Iniezione di Bupivacaina HCl allo 0,25%McKesson10772802,5mg/kg-1mg/kg, ID/SC 20-30uL
0,9% cloruro di sodio, USPMcKesson1617365 mL/kg, SC, IV 1,5 mL
Ago da 23 gBecton, Dickinson e Compagnia [McKesson]402
Vicryl rivestito 4-0McKesson100700
Tubi conici da 50 mLThermo Scientific33965
Cuscinetti assorbenti per pancaVWR115-0684
Tampone d'alcol Alcool isopropilico 70%Becton, Dickinson e Compagnia [VWR]326895
Sacchetto Autochiave Auto-Sigillante 5 & frac14; ” x 10"  McKesson960944
BilanciamentoOhaus [VWR]30253019
Bioclave MiniBenchmark ScientificB4000-M
Pinza Brown-AdsonROBOZ [VWR]RS-5231
Applicatore con punta di cotone sterile 6 inMcKesson999736
Fosfato di Dulbecco Soluzione Salina Tamponata / ModificataCytivaSH30028.02[-] calcio, magnesio
Ethiqa XRÒ*Salute Animale FidelisNDC 86084-100-303,25 mg/kg SC
Drappe a uso generaleMcKesson68107
Sterilizzatore per perline di vetroVWR75999-324
Perline di vetroVWR75999-332
Emostati di HartmanStrumenti scientifici di qualità [VWR]13003-10
Dispositivo anestesico portatile di alta qualitàVeterinaria Patterson07-8915662
Isoflurano, USPMcKesson8032504-5% Induzione, 1-3% Manutenzione
MedLED & Ograve; Chrome (Faro)KLS MartinML-MC7-HT-HK-X21
Pinze microdissecantiROBOZ [VWR]RS-5174
Forbici micro-dissezionaliROBOZ [VWR]RS-5914
Siringhe di insulina monojectCardinal Health [McKesson]8881600145
Pinza emostatica per zanzaraROBOZ [VWR]RS-7100
Crema per il corpo Nair SparatorioChiesa & Dwight Co., Inc.
PortaagoROBOZ [VWR]RS-7154
Soluzione di preparazione PVP 10% Povidone IodioMcKesson911740
BisturiROBOZ [VWR]RS-9843
Lame per bisturi in acciaio al carbonio n. 10McKesson862685
Tappetino riscaldante per piccoli animaliK& Prodotti H Pet [Amazon]9 x 12in 20W
Piccola Camera del TopoVeterinaria Patterson07-893338
Cono naso piccoloVeterinaria Patterson78909681
Steri-DrapeMcKesson5713
Cuscinetti di garza sterili 2" x2" – 12 PLYDukal Corporation [Amazon]RIFEZIONE: 1212
Unguento Lubrificante Sterile per OcchiMcKesson730979
Guanti chirurgiciMcKesson20-2070N
Siringa 1ccMcKesson1065984
Pinze digitali in fibra di carbonio tracciabiliMarchio Fischer15-077-957
Kit TagliacapelliWAHL [Amazzonia]BravMini

Riferimenti

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