Articolo metodologico

Smistamento cellulare basato su cerniera di leucina per la purificazione di cellule trasdotte a doppio vettore

DOI:

10.3791/68628

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24 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo per purificare selettivamente le cellule T a doppia trasduzione da una miscela di cellule T co-trasdotte. Questo approccio combina due vettori retrovirali che codificano ciascuno un componente di una metodologia di selezione cellulare accoppiata basata su cerniera di leucina che consente la purificazione immunomagnetica selettiva di cellule trasdotte a doppio vettore.

Abstract

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Le terapie con cellule T adottive, comprese le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR), hanno dimostrato un'attività clinica impressionante contro le neoplasie ematologiche e si stanno dimostrando promettenti nel trattamento delle neoplasie tumorali solide. Nonostante questi successi, sono stati identificati molteplici meccanismi di resistenza all'immunoterapia con cellule T che limitano il successo terapeutico, tra cui la perdita o la debole espressione di antigeni bersaglio, lo sviluppo di esaurimento delle cellule T e la presenza di un microambiente tumorale immunosoppressivo. Sono state sviluppate molteplici strategie di ingegneria cellulare per superare questi meccanismi di resistenza. Tuttavia, possono verificarsi contemporaneamente più meccanismi di resistenza, che richiedono una combinazione di più strategie ingegneristiche per ottimizzare l'attività antitumorale. I vincoli di impacchettamento dei vettori limitano la consegna di grandi quantità di informazioni genetiche alle cellule T e rappresentano una sfida nella co-espressione di più costrutti ingegnerizzati. Qui, descriviamo un protocollo per co-trasduzione di cellule T con due vettori per codificare più transgeni, aumentando così il numero di funzioni ingegnerizzate. Co-esprimendo una metodologia di smistamento cellulare basata su cerniera di leucina, denominata Zip-sort, dirigiamo la purificazione immunomagnetica selettiva di cellule a doppia trasduzione che hanno incorporato due vettori distinti.

Introduzione

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La terapia con cellule CAR T ha rivoluzionato il trattamento della leucemia a cellule B, del linfoma e del mieloma multiplo 1,2. Le cellule T CAR sono anche oggetto di studio per le neoplasie tumorali solide3. Tuttavia, sono stati identificati meccanismi ricorrenti per il fallimento della terapia con cellule T CAR, tra cui scarsa espressione o perdita della molecola dell'antigene bersaglio CAR, sviluppo di disfunzione delle cellule T (esaurimento), soppressione immunitaria attiva da parte del microambiente tumorale e traffico limitato di cellule T e persistenza nel microambiente tumorale 3,4,5,6 . Mentre sono state ideate soluzioni ingegneristiche individuali per tentare di superare ciascuno di questi meccanismi di resistenza delle cellule T CAR3, l'introduzione di più funzioni ingegneristiche in un prodotto di terapia cellulare per superare contemporaneamente più meccanismi di resistenza è impegnativa a causa della limitata capacità di impacchettamento genetico dei sistemi di vettori retrovirali e lentivirali7.

Per superare i limiti nella capacità di impacchettamento dei vettori, è stata utilizzata sempre più spesso la co-trasduzione di cellule T con più vettori. La co-trasduzione del vettore è stata utilizzata per studiare strategie di ingegneria delle cellule T logica-dipendenti e regolate da farmaci in studi preclinici 8,9,10 e in un recente studio clinico che ha valutato le cellule T CD19/CD22 dual-CAR per superare i limiti dell'impacchettamento del vettore11. Tuttavia, la co-trasduzione genera prodotti cellulari misti contenenti combinazioni di cellule T a trasduzione singola e doppia, che possono compromettere la funzionalità del prodotto se dipendono da componenti codificati da entrambi i vettori e possono anche portare alla competizione tra cellule T a trasduzione singola12.

Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato una metodologia chiamata Zip-sort, che utilizza cerniere di leucina eterodimerizzanti - ciascuna espressa da uno dei due vettori co-trasdotti - per dirigere la purificazione immunomagnetica in un unico passaggio di cellule a doppia trasduzione13. In questo protocollo, descriviamo i metodi per la costruzione di vettori retrovirali che incorporano la nostra metodologia Zip-sort, la produzione e la concentrazione di surnatanti retrovirali, l'attivazione e la co-trasduzione delle cellule T e la purificazione immunomagnetica di cellule a doppia trasduzione (Zip-sort).

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Protocollo

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Gli studi sugli animali sono stati condotti nel City of Hope (COH) Parvin Animal Research Laboratory secondo il protocollo #23145 approvato dal COH Institutional Animal Care and Use Committee e nel vivaio del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) sotto il protocollo #99-07-025 come approvato dal MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee. Le cellule T umane sono state isolate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) de-identificate che sono state purificate con Ficoll-Paque da filtri di riduzione dei leucociti ottenuti dal City of Hope Blood Donor Center e utilizzati secondo il protocollo #24427 come approvato dal City of Hope Institutional Review Board. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con gli standard istituzionali di biosicurezza.

1. Design vettoriale zip-sort

  1. Selezionare il vettore di espressione di scelta per la modifica genetica delle cellule di interesse.
    NOTA: La metodologia zip-sort comprende cerniere secrete e cerniere di cattura, entrambe espresse da vettori diversi, e che si accoppiano intracellulare e traffico verso la superficie cellulare per consentire la purificazione selettiva delle cellule che incorporano entrambi i vettori (Figura 1A-D)13. Le cerniere secrete sono espresse dal vettore 1 e contengono un tag di affinità. Le cerniere di cattura sono espresse dal vettore 2 e mantengono la cerniera secreta sulla superficie della cellula. La modifica della cerniera di blocco è composta da una seconda cerniera legata in modo covalente, che blocca l'accoppiamento della cerniera extracellulare non specifica della cerniera secreta. La modifica della cerniera di blocco è necessaria per prevenire l'accoppiamento extracellulare quando si aggiunge una cerniera di cattura a proteine con domini extracellulari allungati (tipicamente domini extracellulari più grandi di un dominio a cerniera corta).
  2. Seleziona un set di cerniere secrete e di acquisizione dalla Tabella supplementare 1 e dal File supplementare 1 per testare e creare vettori.
  3. Clonare sequenze di zipper in vettori di espressione accoppiati utilizzando tecniche standard di biologia molecolare13- ciascuno dei due vettori codificherà la cerniera secreta dal tag di affinità o la cerniera di cattura (Figura 1D).
    1. Vedere la Tabella supplementare 1 e il File supplementare 1 per le sequenze di costruzione della cerniera. Le sequenze di cerniere sono state posizionate al 5' (N terminale) di un messaggio policistronico per migliorare la loro espressione e quindi aumentare la resa di selezione. Posizionare i transgeni successivi a valle, separati da peptidi 2A auto-scissi (Figura 1D). Tuttavia, esperimenti precedenti hanno avuto successo posizionando le cerniere in una configurazione di 3' se viene mantenuta un'elevata espressione.

2. Produzione di retrovirus

  1. Preparare le cellule Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, virus del tropico del topo) o le cellule Phoenix-Eco ɑ-V β-313 (aggiunta di ɑ-V β-3 progettate per migliorare l'adesione di Phoenix-Eco) o 293Vec-RD11414 (virus umano-tropico) o 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 (aggiunta di ɑ-V β-3 progettata per migliorare l'adesione di 293Vec-RD114) 1 giorno prima della trasfezione.
    NOTA: Questo protocollo non richiede la modifica delle linee di confezionamento con integrine ɑ-V β-3, ma questa modifica migliora l'adesione di questa linea cellulare ai fiaschi di coltura tissutale e facilita la raccolta del surnatante retrovirale.
    1. Tripsinizzare le cellule in un pallone T175 contenente celle Phoenix o 293Vec-RD114 alla confluenza ~80% con lo 0,25% di tripsina-EDTA.
      1. Rimuovere i terreni, lavare le cellule aderenti con 10 mL di PBS, mantenendo le cellule indisturbate per rimuovere i componenti sierici che inibiscono la tripsina, aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
      2. Dissociare e raccogliere le cellule in 5 mL di DMEM integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di GlutaMAX (indicato come DMEM completo).
      3. Pellettare le cellule in una provetta conica da 15 mL centrifugando a 340 x g per 5 minuti a 4 °C. Decantare i supporti.
    2. Risospendere le cellule pellettate da centrifuga in 10 mL di DMEM completo e la piastra su una piastra di coltura tissutale da 10 cm circa 1,5 x 10 6 cellule Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 o 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 cellule contate con un ematocitometro.
    3. Agitare delicatamente o agitare la piastra per distribuire uniformemente le cellule e incubare per una notte a 37 °C per consentire alle cellule di aderire alla piastra.
  2. Circa 18-24 ore dopo, verificare che le cellule siano confluenti al 60%-70%, con cellule sane e aderenti che mostrano proiezioni dendritiche.
  3. Trasfettare stabilmente le cellule Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 o 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 con costrutti retrovirali del vettore LZRS (Addgene Plasmid #31601, trasfezione stabile episomiale basata su EBNA) o costrutti PB-vector13 (integrazione stabile genomica basata sul trasposone piggyBac, File supplementare 1) utilizzando il kit di trasfezione (Tabella dei materiali) come descritto di seguito.
    1. Combinare 2 μg di DNA vettore LZRS o DNA vettore PB e 16 μL di reagente potenziatore in 300 μL di tampone EC in una provetta da microcentrifuga per ogni reazione di trasfezione.
    2. Per un'integrazione stabile dei costrutti del vettore PB, aggiungere anche 1 μg del vettore iperattivo piggyBac trasposasi pCMV-hyPBase15 (Sanger Institute).
    3. Agitare delicatamente per 5 s e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 20 μl di reagente di trasfezione, agitare per 10 s e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per generare complessi micellari di DNA.
    4. Aggiungere 300 μl di DMEM completo alla provetta, pipettare più volte per miscelare accuratamente e aggiungere la sospensione micellare goccia a goccia alle celle della linea di confezionamento piastrata utilizzando una pipetta da 1 mL.
    5. Agitare delicatamente per garantire una deposizione uniforme delle micelle. Dopo 24 ore, tripsinizzare le cellule trasfettate e valutare l'espressione iniziale del costrutto codificato retrovirale mediante citometria a flusso.
    6. Trasferire le cellule tripsinizzate in un pallone T75 con 20 mL di DMEM completo e aggiungere 2 μg/mL di puromicina o 10 μg/mL di blasticidina, a seconda dei geni di resistenza agli antibiotici, per selezionare le cellule trasfettate. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza del 70%-75%, tripsinizzare e trasferire in un pallone T175 con 40 mL di DMEM completo. Mantenere la selezione di antibiotici nei terreni durante l'espansione della linea di confezionamento.
    7. Quando le cellule sono confluenti all'80%-85%, tripsinizzare nuovamente e confermare l'espressione del costrutto mediante citometria a flusso. Congelare un'aliquota di cellule utilizzando un terreno di congelamento (50% DMEM completo, 40% FBS, 10% DMSO) e far passare le celle in due matracci T175 (rapporto di divisione 1:10-1:12) con 40 mL di DMEM completo.
  4. Raccogliere e concentrare il surnatante retrovirale da linee di confezionamento stabili completamente selezionate, coltivate in fiasche T175 quando le cellule raggiungono l'80%-85% di confluenza.
    1. Rimuovere gli antibiotici dal terreno prima del primo prelievo sostituendo il terreno in T175 con 40 mL di DMEM fresco e completo 24 ore prima della prima raccolta prevista.
    2. Raccogliere e filtrare i surnatanti 24 ore dopo la sostituzione del terreno facendo passare il surnatante raccolto attraverso siringhe da 50 ml dotate di filtri per siringhe (0,45 μm, fluoruro di polivinilidene). Raccogliere in una provetta conica da 50 mL.
    3. Aggiungere 5 soluzioni concentrate di polietilenglicole (PEG) (40% (wt/vol) PEG 8.000 MW contenenti il 2,4% (wt/vol) di NaCl) surnatante filtrato e capovolgere la provetta più volte per miscelare accuratamente (fase di precipitazione PEG).
    4. Aggiungere 40 mL di DMEM completo al pallone T175 originariamente raccolto, incubare per altre 24 ore e raccogliere il surnatante virale ogni giorno per altri 2 giorni consecutivi in totale.
    5. Far precipitare il virus per 1-2 giorni a 4 °C. Il virus precipitato apparirà come materiale flocculante, galleggiante o sedimentato.
    6. Centrifugare la sospensione virale precipitata con PEG a 2.100 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante non precipitato.
    7. Risospendere ogni pellet virale precipitato con PEG in 500 μL di RPMI integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina, l'1% di GlutaMAX, l'1% di piruvato di sodio, l'1% di aminoacidi non essenziali e lo 0,1% di β-mercaptoetanolo (indicato come RPMI completo).
    8. Utilizzare immediatamente il virus risospeso per la trasduzione o trasferirlo in una provetta da microcentrifuga e conservarlo a -80 °C.

3. Giorno 0: Arricchimento e attivazione delle cellule T di topo

  1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti trattata con coltura tissutale con 1,5 mL di PBS per pozzetto contenente 2 μg/mL di anti-CD3 (clone 145-2C11) e 2 μg/mL di anti-CD28 (clone 37.51). Incubare per 2 ore a 37 °C.
  2. Prelevare la milza dal topo donatore, dissociare le cellule attraverso un filtro da 40 μm e raccogliere gli splenociti in RPMI completo. Pellet gli splenociti mediante centrifugazione a 340 x g per 5 min a 4 °C.
    NOTA: In questo studio sono stati utilizzati topi femmina BALB/cJ di età compresa tra 6 e 8 settimane come topi donatori.
  3. Scartare il surnatante, agitare delicatamente il pellet, aggiungere 1 mL di tampone di lisi RBC, pipettare 3x-5x per mescolare, incubare a temperatura ambiente per 1 minuto, spegnere con 10 mL di RPMI completo e centrifugare le celle centrifugando a 340 x g per 5 minuti a 4 °C.
  4. Scartare il surnatante, aggiungere 800 μl di PBS con BSA allo 0,5% e 2 mM di EDTA (indicato come tampone MACS) e aggiungere 200 μl di microsfere di topo-CD19. Pipettare per miscelare e incubare per 15 minuti a 4 °C.
  5. Preparare 1 colonna LD per milza di topo. Fissare la colonna LD a un separatore MACS. Posizionare una provetta conica da 15 mL sotto per raccogliere gli splenociti depleti di CD19. Inumidire la colonna con 2 mL di tampone MACS.
  6. Dopo l'incubazione con microsfere CD19, lavare le cellule con 5 mL di tampone MACS freddo, le cellule pellet centrifugando a 340 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il surnatante. Risospendere in 1 mL di tampone MACS e aggiungere le celle alla colonna LD. Attendere il passaggio della sospensione prima di lavare con 1 mL e poi 2 mL di tampone MACS.
  7. Raccogliere il flusso degli splenociti impoveriti di CD19 da utilizzare a valle. Scartare la colonna LD, ridurre gli splenociti depleti di CD19 centrifugando a 340 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante e risospendere in 18 mL di RPMI completo. Aggiungere IL-2 umana ricombinante (rhIL-2) a una concentrazione finale di 50 UI/mL.
  8. Eliminare la soluzione di anticorpi dalla piastra a 6 pozzetti rivestita di anticorpi. Aggiungere 3 mL di splenociti depleti di cellule B risospese a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti rivestita di anticorpi.

4. Giorno 1: Trasduzione retrovirale delle cellule T di topo

  1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti non trattata con coltura tissutale con 1,5 mL di PBS per pozzetto contenente 2 μg/mL di anti-CD3 (clone 145-2C11), 2 μg/mL di anti-CD28 (clone 37,51) e 20 μg/mL di retroNectina.
    NOTA: Le piastre non per coltura tissutale vengono utilizzate durante il rivestimento con RetroNectina secondo le raccomandazioni del produttore.
  2. Incubare per 2 ore a 37 °C. Scartare la soluzione di rivestimento o conservarla per il riutilizzo (può essere riutilizzata una volta). Bloccare la piastra con 1 mL di PBS con il 2% di BSA per pozzetto, incubare per 10 minuti a 37 °C ed eliminare la soluzione bloccante.
  3. Nel frattempo, scongelare il surnatante virale precipitato con PEG in un bagno d'acqua a 37 °C.
    NOTA: 500 μl di ciascun retrovirus concentrato di PEG co-trasdotto generato da un pallone T175 dovrebbero essere sufficienti per la doppia trasduzione di un massimo di 2 x 106 cellule T attivate per pozzetto con >'efficienza di doppia trasduzione del 20%.
  4. Aggiungere i surnatanti virali di co-trasduzione al pozzetto della piastra a 6 pozzetti in base alle condizioni desiderate, portare il volume finale ad almeno 2 mL con RPMI completo e 50 UI/mL di rhIL-2 e centrifugare per 1 ora a 2.100 x g e 32 °C.
  5. Aggiungere 0,5-2 x 106 cellule T attivate per pozzetto e centrifugare la piastra a 340 x g per 10 minuti a 32 °C. Se le cellule non aderiscono, ripetere la centrifuga a 340 x g per altri 10-20 minuti a 32 °C. Incubare a 37 °C per una notte.

5. Giorno 2: Valutazione dell'espressione vettoriale e ri-trasduzione facoltativa

  1. Interrompere 100-200 μL di cellule aderenti per condizione dalla piastra di trasduzione per la citometria a flusso. L'utente deve identificare un marcatore rilevabile con citometria a flusso per ogni singolo vettore e tag di affinità e utilizzarli per valutare l'efficienza di trasduzione del vettore singolo, l'efficienza di trasduzione del doppio vettore e la presentazione del tag di affinità utilizzando la citometria a flusso.
  2. Eseguire la citometria a flusso su cellule co-trasdotte come descritto di seguito.
    1. Impostare gli assi dei parametri di acquisizione per visualizzare i reporter vettoriali per il vettore 1 e il vettore 2 (Figura 1C).
    2. Tracciare gli istogrammi per la colorazione con cerniera del tag di affinità (ad esempio, FLAG o CD34) per ciascuno dei quattro quadranti di espressione del vettore 1 e del vettore 2 per garantire che la colorazione del tag di affinità sia limitata alle cellule che co-esprimono i reporter di trasduzione del vettore 1 e del vettore 2.
  3. Se le cellule sono sufficientemente a doppia trasduzione da garantire un numero sufficiente di cellule per gli esperimenti a valle (generalmente il 20% o più di doppia trasduzione), eseguire i seguenti passaggi.
    1. Rivestire il doppio del numero dei pozzetti iniziali utilizzati per trasdurre ciascuna linea di cellule T con PBS contenente 2 μg/mL di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 per mantenere la stimolazione delle cellule T. Incubare per 2 ore a 37 °C.
    2. Trasferimento di cellule in nuovi pozzetti con RPMI completo con 50 UI/mL di rhIL-2 (mantiene la stimolazione delle cellule T).
  4. Se le cellule non sono sufficientemente bidotte per garantire un numero sufficiente di cellule per gli esperimenti a valle (generalmente < 20% di doppia trasduzione), eseguire i seguenti passaggi.
    1. Ritrasdurre utilizzando lo stesso protocollo del Giorno 1, ma aumentando fino a raddoppiare il numero di pozzetti inizialmente utilizzati per tenere conto dell'espansione delle cellule T.
    2. Incubare a 37 °C per una notte. Ripetere la citometria a flusso 24 ore dopo.
      NOTA: I costrutti codificati con vettori, incluso il tag di affinità zipper, mostrano la massima espressione 2 giorni dopo la trasduzione iniziale.

6. Giorno 3: Selezione immunomagnetica delle cellule T (Zip-sort)

  1. Pozzetti di raggruppamento delle cellule generate utilizzando le stesse condizioni di co-trasduzione in una provetta conica da 15 mL.
  2. Centrifugare le celle a 340 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante e incubare le cellule in 500 μL di tampone MACS contenente 30 μL di microsfere (DYKDDDDK (FLAG) o CD34 umano) per 1 x 107 cellule per 30 minuti a 4 °C.
  3. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5 mL di tampone MACS freddo. Centrifugare le celle a 340 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone MACS.
  4. Selezionare positivamente le cellule T trasdotte utilizzando una colonna LS come descritto di seguito.
    1. Inumidire la colonna con 2 mL di tampone MACS. Applicare la sospensione cellulare alla colonna LS nel supporto magnetico.
    2. Lavare in sequenza con tampone MACS (1 mL, 2 mL, 3 mL). Eluire le cellule trattenute dalla colonna rimuovendo la colonna dal supporto magnetico, aggiungendo 5 mL di RPMI completo alla colonna e inserendo lo stantuffo delle celle.
    3. Catturare le cellule in una provetta conica da 15 mL o direttamente in un matraccio T25. Equilibrare le cellule a 0,5 x 106 cellule/mL in RPMI completo con 50 UI/mL di rhIL-2.
    4. Se si parte da < doppia trasduzione del 20%, eluire facoltativamente le cellule su una seconda colonna LS per una selezione positiva sequenziale per aumentare la purezza post-selezione.
  5. Coltura di cellule CAR T in fiasche T25 o T75 a circa 0,5 x 10,6 cellule/mL di RPMI completo e 50 UI/mL di rhIL-2.
  6. Opzionale: se le cellule T verranno utilizzate per esperimenti in vivo, considerare la coltura in 1 μM di dasatinib per attenuare la disfunzione del segnale tonico delle cellule T CAR riscontrata durante il periodo di coltura iniziale13,16.
  7. Eseguire la citometria a flusso come indicato nei passaggi 2.1 e 2.2 di cui sopra per le cellule T pre-selezionate e post-selezionate per valutare la resa e la purezza post-Zip-sort (% a doppia trasduzione).
    Resa = 100 x totale di cellule a doppia trasduzione recuperate / totale di cellule a doppia trasduzione presenti nella popolazione pre-selezione)

7. Giorno 4: Coltura continua di cellule T

  1. Aggiungere RPMI completo fresco e 50 UI/mL di rhIL-2 per l'intero volume di coltura per mantenere la concentrazione di cellule T a 0,5-1 x 106 cellule/mL.
  2. Facoltativo: se le cellule T verranno utilizzate per esperimenti in vivo , aggiungere 1 μM di dasatinib fresco.

8. Giorno 5: Caratterizzazione delle cellule T Zip-sorted

  1. Opzionale: preparare 100-200 μl di sospensione di cellule T per condizione colorata con anticorpi per rilevare CAR o altri prodotti proteici codificati dai vettori Zip-sort utilizzando la citometria a flusso.
  2. Eseguire esperimenti in vitro o in vivo con cellule CAR T.
  3. Opzionale: se le cellule T verranno utilizzate per esperimenti in vivo , lavare le cellule per rimuovere il dasatinib. Risospendere le cellule alla concentrazione richiesta per l'iniezione retro-orbitale o della vena di coda secondo le linee guida istituzionali.

9. Giorno 0: Purificazione e stimolazione delle cellule T umane

  1. Scongelare rapidamente una fiala di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) crioconservate in un bagno d'acqua (o utilizzare PBMC appena isolate). Aggiungere le PBMC scongelate a una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di tampone MACS, preparare un'aliquota per il conteggio e le celle in pellet centrifugando a 340 x g per 5 minuti a 4 °C.
  2. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel tampone MACS (utilizzare 40 μl di tampone per 1 x 107 cellule totali). Procedere con l'isolamento delle cellule T utilizzando il kit di isolamento delle cellule Pan T, umano, secondo le istruzioni del produttore.
    1. In breve, aggiungere 10 μl di cocktail di biotina-anticorpi a cellule Pan T per 1 x 107 cellule totali. Incubare per 5 minuti a 4 °C.
    2. Aggiungere 30 μl di tampone MACS per 1 x 107 celle totali. Aggiungere 20 μl di Pan T Cell MicroBead Cocktail per 1 x 107 celle totali.
    3. Incubare per 10 minuti a 4 °C. Riempire il volume della sospensione cellulare utilizzando il tampone MACS ad almeno 500 μL.
    4. Procedere alla separazione magnetica delle cellule utilizzando una colonna LS e raccogliere il flusso attraverso le cellule T arricchite (non toccate).
  3. Contare la resa delle cellule T e le celle a pellet centrifugando a 340 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule T umane in RPMI completo a 1 x 106 cellule/mL con rhIL-2 a 50 UI/mL.
  4. A una provetta conica da 15 mL contenente 2 mL di PBS, aggiungere il volume necessario di Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 per l'espansione e l'attivazione delle cellule T (25 μl di perle per 1 x 106 cellule, utilizzando un rapporto 1:1 tra perle e cellule T) e centrifugare a 340 x g per 5 minuti a 4 °C per lavare le microsfere. Scartare il surnatante.
  5. Mescolare le cellule T risospese con perle lavate e trasferirle in un pallone T25 per la coltura.

10. Giorno 3: Trasduzione retrovirale delle cellule T umane

  1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti non per coltura tissutale con 1,5 mL di PBS per pozzetto contenente 20 μg/mL di RetroNectina.
  2. Incubare per 2 ore a 37 °C. Scartare la soluzione di rivestimento o conservarla per il riutilizzo (può essere riutilizzata una volta).
  3. Nel frattempo, scongelare i surnatanti virali precipitati con PEG per la co-trasduzione in un bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Aggiungere il surnatante virale di co-trasduzione ai pozzetti della piastra a 6 pozzetti rivestita di retroNectina in base alle condizioni di trasduzione desiderate, contare e aggiungere la quantità desiderata di cellule T (generalmente 0,5 - 2 x 106 cellule T/pozzetto), portare il volume fino a 3 mL con RPMI completo contenente rhIL-2 e centrifugare per 45 minuti a 340 x g a 32 °C.
  5. Dopo 24 ore, mantenere le cellule T a 1 x 106 cellule/mL in RPMI completo con 50 UI/mL di rhIL-2.
  6. Trasferire le celle dalla piastra a 6 pozzetti al pallone T25 se il volume necessario per mantenere la concentrazione desiderata di cellule T supera la capacità di volume della piastra a 6 pozzetti.

11. Giorno 6: Smistamento delle cellule CAR T umane

  1. Rimuovere le Dynabeads dalle cellule T prima della purificazione immunomagnetica basata su tag di affinità (Zip-sort) per evitare possibili ritenzioni associate a Dynabeads nella colonna magnetica e prima della citometria a flusso per evitare potenziali interferenze con l'analisi citofluorimetrica.
  2. Agitare brevemente per dissociare i Dynabeads e trasferire le cellule T in una provetta conica da 15 mL e inserirle nel magnete Dynabead. Capovolgere il tubo alcune volte e attendere 5 minuti fino a quando i Dynabeads sono legati al magnete.
  3. Trasferire con cautela la sospensione cellulare senza Dynabeads in una nuova provetta conica da 15 mL aspirando con una pipetta. Conta la concentrazione di cellule recuperate e usa il volume per calcolare la resa totale delle cellule.
  4. Valutare l'espressione di CAR utilizzando la citometria a flusso secondo il protocollo di trasduzione murino di cui sopra.
  5. Centrifugare le cellule a 340 x g per 5 minuti a 4 °C e incubare in 500 μL di tampone MACS contenente 30 μL di microsfere (DYKDDDDK (FLAG) o CD34 umano) per 1 x 107 cellule.
  6. Seguire i passaggi 6.3-6.5 per ottenere cellule CAR T umane selezionate con Zip.
  7. Valutare la vitalità post-selezione mediante il controllo della vitalità dell'ematocitometro utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Si prevede che la vitalità pre-selezione sarà > l'80%. Questo può scendere al di sotto dell'80% dopo lo smistamento zip, ma si riprende in 4-5 giorni.
  8. Espandere le cellule T umane in RPMI completo con 50 UI/mL di rhIL-2 e mantenere la concentrazione di cellule T a circa 1 x 106 cellule/mL. L'espansione e la manutenzione delle cellule T post-smistamento possono essere adattate in base ai protocolli di espansione e utilizzo standard dell'utente.
  9. Eseguire test sperimentali a valle come saggi di uccisione, produzione di citochine, analisi in vivo utilizzando cellule T generalmente dopo il giorno 8.

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Risultati

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In questo protocollo, dimostriamo la co-trasduzione e la selezione immunomagnetica in un unico passaggio di cellule T doppiamente trasdotte con due distinti vettori retrovirali (denominati Zip-sort, Figura 1)13. Ogni vettore codifica una parte di una coppia di cerniere di leucina eterodimerizzante che viene visualizzata selettivamente sulla superficie delle cellule T a doppia trasduzione (Figura 1A). Una cerniera secreta da un tag di affi...

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Discussione

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Qui, abbiamo descritto un protocollo per la generazione di set di vettori Zip-sort, la produzione di retrovirus, cellule T di topo e umane co-trasdutrici e la purificazione immunomagnetica di cellule a doppia trasduzione (Zip-sort). Il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per vettori retrovirali e per cellule T umane e di topo. Sebbene la metodologia Zip-sort non sia stata valutata con altri sistemi vettoriali, in linea di principio, è probabile che altri sistemi vettoriali siano ...

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Dichiarazioni

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A.R., S.C., S.E.J. e M.v.d.B. sono co-inventori delle domande di brevetto relative alla tecnologia Zip-sort. A.P.B. fornisce consulenza per Abbvie e Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. ha ricevuto supporto alla ricerca da Seres Therapeutics e stock option da Seres Therapeutics e ThymoFox; ha ricevuto royalties da Wolters Kluwer; ha fornito consulenze, ricevuto onorari o partecipato a comitati consultivi per Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (coniuge), Synthekine (coniuge), Beigene (coniuge), Kite (coniuge), MustangBio (coniuge) e Cellectar (coniuge); ha licenze IP con Seres Therapeutics e Juno Therapeutics; ricopre un ruolo fiduciario nel Consiglio di Fondazione di DKMS (organizzazione senza scopo di lucro); ed è il presidente del comitato consultivo scientifico di Smart Immune.

Ringraziamenti

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S.C. ha ricevuto il sostegno della Fondazione tedesca per la ricerca (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. riceve il sostegno di un premio per lo sviluppo della carriera dell'NCI (numero di premio K08-CA252157). S.E.J. ha anche ricevuto il sostegno dell'American Society for Clinical Oncology (premio Young Investigator), del National Marrow Donor Program (premio Amy Program) e del Parker Institute for Cancer Immunotherapy (premio Bridge Scholar). La ricerca nel laboratorio van den Brink è supportata dai premi del National Cancer Institute P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; Il National Heart, Lung, and Blood Institute assegna il premio R01-HL164902 e il National Institute of Aging P01-AG052359. Questa ricerca è supportata in parte dalla dotazione Deana e Steve Campbell Chief Physician Executive Distinguished Chair.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Correlato alla linea cellulare tumorale
C1498ATCCTIB-49
BM185-CD19Rif. 13
BM185-CD20Rif. 13
Unità centrale 4D-NucleofectorLonzaCodice AAF-1003B
Unità X 4D-NucleofectorLonzaCodice AAF-1003X
Kit tampone Lonza SF
Produzione di virus
Piatto di coltura cellulare trattato con coltura tissutale (TC) da 10 cmCorning353003
Provetta conica da 50 mLTermo Scientifico339652
EffecteneQiagen301425
plasmide pENTR1aAddgene17398
LZRS-RFAAddgene31601
PB MMLV puro (vettore virale per cellule T di topo)Rif. 13
PB SFG blastR (vettore virale per cellule T umane)Rif. 13
pCMV-hyPBasiIstituto Sanger
Phoenix-EcoATCCCodice CRL-3214
Phoenix-Eco alfa V beta 3Rif. 13Phoenix-Eco modificato per aderire a fiasche di coltura con maggiore avidità
PB-EF1a introne WPRE mCD4 P2A MCS integrina beta 3Rif. 13Opzionale per migliorare l'adesione delle cellule della linea di confezionamento ai palloni di coltura
PB-EF1a introne WPRE hCD8a 2A integrina alfa VRif. 13Opzionale per migliorare l'adesione delle cellule della linea di confezionamento ai palloni di coltura
Biovec-RD113Biovec Pharma
Biovec-RD113 alfa V beta 3Biovec PharmaQuesto studio, trasfettato con vettori alfa V beta 3
Filtri per siringhe Millex-HV (0,45 μ m)MilliporeSLHVR33RRS
Polietilenglicole 8000 (PEG)Fisher ScientificoBP233-1
Cloruro di sodioFisher ScientificoEpisodio 271-500
PuromicinaSanta Cruz Biotechsc-108071B
BlasticidinaSanta Cruz BiotechSC-204655
Palloni trattati TC T175 Corning353112
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloGibco25200056
Mezzi cellulari
2-mercaptoetanoloGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBSSigmaF2442
GlutamaxGibco35050061
Aminoacidi non essenziali MEMGibco11140050
Penicillina-streptomicinaGibco15140-163
Piruvato di sodioGibco11360070
stimolazione/trasduzione delle cellule T
Provetta conica da 15 mLTermo Scientifico339650
Piastra non TC a 6 pozzettiGibco351146
Piastra TC a 6 pozzettiGibco353046
microsfere anti-CD19 Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anti-topo CD28 (Clone 37.51)BioXCellBE0015-1
InVivoPlus anti-topo CD3ε (Clone 145-2C11)BioXCellBE0001-1
Albumina sierica bovinaSigma AldrichA4737-1G
DasatinibCayman Chimica11498
Dynabeads Attivatore T Umano CD3/CD28GibcoCodice 11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, senza RNasiInvitrogenAM9260G
Tampone di lisi dei globuli rossi HybriMaxSigmaR7757-100ML
Colonna LDMiltenyi Biotec130-042-901
Kit di isolamento delle cellule Pan T, umanoMiltenyi Biotec130-096-535
Magnete Dynamag-15InvitrogenCodice 12301D
Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)Corning21040CV
RetronicinaTakaraT100B
rhIL-2Proleuchina (aldesleuchina)
Pallone per colture cellulari T25Corning353109
Zip-sort
µ Kit di isolamento MACS DYKDDDDKMiltenyi Biotec130-101-591
Kit CD34 MicroBeads, umanoMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Colonna LSMiltenyi Biotec130-042-401
Citometria a flusso e monitoraggio cellulare
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (Clone OX-7)BD BioscienzeGatto# 561409; RRID:AB_10683163
Anticorpo tag Anti-V5, (Clone 4C12E11) iFluor 488Script GenScriptGatto# A01803, RRID:AB_2925231
Myc PETecnologia di segnalazione cellulareGatto# 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Tecnologia di segnalazione cellulareGatto# 2233; RRID:AB_823474
APC anti-DYKDDDK Tag (Clone L5)BioLeggendaGatto# 637307; RRID:AB_2561496
Anticorpo Anti CD34 del Topo, Alexa Fluor 647, (Clone QBEnd/10)Novus BiologicalsGatto# NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
Streptag FITCScript GenScriptGatto# A01736; RRID:AB_2622221
Incucita SX5Sartorius
Citometro a flusso PenteonAgilent

Riferimenti

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