Clearing ottico transitorio utilizzando molecole assorbenti per l'imaging ex vivo e in vivo

Sommario

Le tecniche di chiarificazione ottica, come l'assorbimento di soluzioni molecolari, riducono temporaneamente la dispersione della luce per migliorare l'imaging biologico e offrire strategie di imaging in vivo biocompatibili e reversibili per organi profondamente incorporati. Questo protocollo presenta procedure sperimentali dettagliate e un'elaborazione avanzata delle immagini per ottenere immagini dinamiche di alta qualità per la dinamica in tempo reale negli animali vivi.

Abstract

L'imaging dinamico è uno strumento fondamentale in biologia e medicina, ma è limitato dalla diffusione della luce nei tessuti vivi causata da discrepanze dell'indice di rifrazione, che riduce la profondità di penetrazione e la risoluzione nei tessuti biologici. Il lavoro precedente ha introdotto un nuovo approccio per ottenere la trasparenza ottica negli animali vivi utilizzando molecole fortemente assorbenti. Quando queste molecole assorbenti, come la tartrazina, un colorante approvato dalla FDA comunemente usato negli alimenti, si dissolvono in acqua, modificano l'indice di rifrazione del mezzo acquoso attraverso le relazioni di Kramers-Kronig. Questa modulazione consente di ridurre il disallineamento dell'indice di rifrazione tra componenti separati in tessuti con indici di rifrazione distinti, mitigando così lo scattering. Questo articolo riporta la metodologia dettagliata della tecnica di chiarificazione tissutale utilizzando una soluzione acquosa a base di Tartrazina, applicata sia a campioni ex vivo che in vivo . Questo approccio rende in modo reversibile i corpi dei topi vivi trasparenti nello spettro visibile, consentendo immagini più chiare e profonde dei processi e delle strutture interne. È stato quindi utilizzato un algoritmo avanzato di elaborazione delle immagini per migliorare il contrasto e la segmentazione degli organi di interesse. Inoltre, è stata mostrata un'elevata trasparenza in campioni ex vivo , come il petto di pollo, trattati con una soluzione a base di tartrazina. Questo metodo offre un approccio versatile e accessibile per migliorare le capacità di imaging in varie modalità e apre la strada al progresso nella comprensione di sistemi biologici complessi.

Introduzione

L'imaging biologico è stato a lungo messo alla prova dalla dispersione della luce, che oscura le strutture di interesse¹. Le tecniche di pulizia ottica mirano a ridurre la dispersione della luce e migliorare la chiarezza visiva, consentendo la visualizzazione di strutture precedentemente nascoste². Lo sviluppo di queste tecniche ha portato a una vasta gamma di metodi progettati per migliorare l'imaging ottico di tessuti biologici ex vivo, anche di animali interi, senza dissezione fisica dei campioni³. Tuttavia, lo sviluppo di tecniche simili per applicazioni in vivo è stato impegnativo. Tecniche come CLARITY Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel), offrono imaging ad alta risoluzione ma mancano di reversibilità, il che le rende inadatte per studi su animali vivi⁴. Constantini et al. hanno mostrato un progresso più lento nell'imaging in vivo rispetto alla chiarezza dell'imaging ex vivo, il che è dovuto alla complessità di mantenere la vitalità dei tessuti evitando i livelli tossici degli agenti necessari per la trasparenza dei tessuti⁵. Genina sottolinea il futuro della pulizia ottica dei tessuti come dipendenza da metodi non invasivi e reversibili⁶. Recenti studi hanno dimostrato l'efficacia di coloranti assorbenti idrosolubili per la chiarificazione ottica in vivo. Ad esempio, Miller et al. hanno dimostrato che l'applicazione topica di Tartrazina ha migliorato significativamente la profondità di imaging sia nell'OCT che nella microscopia fotoacustica (PAM) della pelle di topo vivo, riducendo la dispersione e aumentando l'indice di rifrazione dei componenti del tessuto interstiziale⁷. Jia et al. hanno utilizzato una soluzione di tartrazina al 15% p/p per migliorare l'imaging PAM in vivo dell'orecchio del topo e del tessuto addominale, rivelando strutture microvascolari fini con risoluzione subcellulare che altrimenti sarebbero state oscurate⁸. Zuo et al. hanno inoltre dimostrato l'imaging cerebrale attraverso il cuoio capelluto e il cranio intatti in topi vivi utilizzando tartrazina 0,6 M, ottenendo un'intensità del segnale quattro volte superiore e una risoluzione 3,5 volte migliore rispetto al tessuto non trattato⁹. In un'altra applicazione, Narawane et al. hanno abilitato l'imaging OCT transsclerale profondo negli occhi suini applicando Tartrazina, ottenendo una chiara visualizzazione dello spazio sopracoroideale, che era precedentemente inaccessibile a causa del forte scattering sclerale¹⁰. Sebbene i metodi di chiarificazione tissutale ex vivo come CLARITY e iDISCO (Immunolabeling-enabled tridimensional-dimensional imaging of solvent-cleared organs) raggiungano un'elevata trasparenza ottica e risoluzione subcellulare attraverso la rimozione dei lipidi o la chiarificazione a base di solvente, spesso non sono adatti per l'imaging in vivo con animali vivi ^4,11,12. Questa limitazione influisce sull'imaging dinamico, che è fondamentale per l'imaging biomedico dei processi dinamici all'interno degli animali viventi, come lo sviluppo di malattie e le terapie.

Le molecole assorbenti con un'elevata solubilità acquosa e forme distinte delle bande di assorbimento, come la tartrazina, un colorante per uso alimentare, offrono vantaggi promettenti per ottenere la trasparenza ottica negli animali vivi¹³. Introducendo specificamente la tartrazina, il tessuto assorbe selettivamente le lunghezze d'onda ultraviolette e blu grazie alle caratteristiche spettrali uniche del colorante, ottenendo un profilo dell'indice di rifrazione modificato che riduce la dispersione a lunghezze d'onda più lunghe. Questa tecnica ottica controintuitiva di pulizia dei tessuti è ottimizzata per l'imaging in vivo e le relazioni di Kramers-Kronig forniscono una base scientifica per la trasparenza osservata quando si utilizzano molecole fortemente assorbenti come la tartrazina^14,15. Per l'imaging in vivo, la tartrazina è combinata con particelle di agarosio riscaldate e acqua per creare una soluzione coesiva che aderisce meglio alla pelle. La natura idrosolubile della tartrazina facilita anche la facile rimozione della soluzione a base di colorante da animali vivi, riducendo i potenziali effetti di un'esposizione prolungata alle soluzioni coloranti. Inoltre, il metodo è stato adattato per varie applicazioni biomediche per migliorare la profondità, la risoluzione e la sensibilità dell'imaging, tra cui la tomografia a coerenza ottica ^7,16 e l'imaging fotoacustico ^7,9, dimostrando il suo potenziale per la più ampia comunità di imaging biomedico.

Con il crescente interesse per l'applicazione di molecole assorbenti nell'imaging biomedico^17,18, il protocollo presenta una procedura dettagliata di utilizzo di coloranti alimentari per applicazioni ex vivo e in vivo, insieme all'elaborazione delle immagini e all'imaging reversibile in vivo. Questo protocollo viene applicato al tessuto del petto di pollo per dimostrare la trasparenza ex vivo e viene quindi modificato per l'imaging in vivo della testa e dell'addome dei topi, mostrando la reversibilità. Una soluzione applicata sulla pelle del topo in vivo crea una trasparenza temporanea e reversibile senza danneggiare la pelle o l'integrità dei tessuti. Questa tecnica può essere integrata con una pipeline di elaborazione delle immagini, incluso il denoising, per creare un protocollo di imaging ottimizzato per l'imaging ottico in vivo degli organi interni. Se combinate, queste tecniche consentono un migliore imaging longitudinale non invasivo per osservazioni in tempo reale dei processi biologici. L'uso di agenti più sicuri che dimostrano la reversibilità supera i limiti precedenti e fornisce un metodo più adatto per l'imaging biologico dinamico.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali condotti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas a Dallas in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali. Il codice per l'elaborazione delle immagini è disponibile su Github: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. Preparazione della soluzione di tartrazina

1. Per campioni ex vivo
   1. Per preparare le soluzioni coloranti, calcolare la massa necessaria di polvere colorante (Tartrazina) per preparare il volume desiderato della soluzione. Usa la formula:
      Massa (g) = Molarità (M) × Peso molecolare (g/mol) × Volume (L)
      NOTA: Per calibrare la molarità effettiva, misurare l'assorbanza delle soluzioni preparate utilizzando uno spettrometro UV-VIS e applicare la legge di Beer-Lambert¹⁹.
      ATTENZIONE: Utilizzare una bilancia analitica per pesare la quantità precisa di polvere. Indossare DPI (dispositivi di protezione individuale) adeguati, tra cui camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi, quando si lavora con le polveri coloranti. Evitare l'inalazione o il contatto con la pelle.
   2. Trasferire la polvere di colorante in una fiala di vetro pulita e aggiungere il volume richiesto di acqua deionizzata (DI) utilizzando una pipetta volumetrica per garantire la precisione volumetrica.
   3. Se la polvere non si dissolve completamente a temperatura ambiente, porre la fiala di vetro in un forno da laboratorio o in una fornace preriscaldata a 40 °C e riscaldare per 10 minuti o fino a quando la polvere non si è completamente sciolta (Figura 1A).
      NOTA: Le soluzioni a bassa molarità sono completamente solubili a temperatura ambiente e rimangono in forma liquida, mentre le soluzioni ad alta concentrazione (>0,37 M) richiedono riscaldamento.
      ATTENZIONE: Un riscaldamento eccessivo farà evaporare l'acqua e altererà la concentrazione effettiva della soluzione.
   4. Agitare sul miscelatore a vortice per 30 s a 1 minuto per garantire la completa dissoluzione.
   5. Per preparare una soluzione 0,65 M, sciogliere 427,5 mg di polvere di tartrazina in 1 ml di acqua deionizzata¹⁹. Per altre concentrazioni, fare riferimento alla Tabella 1.
      NOTA: Smaltire le soluzioni coloranti inutilizzate e i materiali contaminati secondo le procedure standard di smaltimento dei rifiuti chimici.
2. Per campioni in vivo
   1. Calcolare la massa richiesta di microparticelle di agarosio a bassa temperatura di fusione e tartrazina per preparare una concentrazione di 0,65 M con una soluzione di idrogel di agarosio allo 0,4% (4 mg/mL).
      NOTA: Seguire le precauzioni di sicurezza standard descritte al punto 1.1.1 quando si maneggiano tutti i reagenti.
   2. Trasferire le polveri pesate in una fiala di vetro pulita. Aggiungere l'acqua deionizzata utilizzando una pipetta volumetrica.
   3. Porre la fiala in un forno da laboratorio o in una fornace preriscaldata a 75 °C per circa 10-15 minuti o fino a quando le particelle di agarosio non sono completamente disciolte.
   4. Mescolare occasionalmente utilizzando un miscelatore a vortice durante il processo di riscaldamento per una dissoluzione uniforme.
   5. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso. Se si solidifica in forma di gel, utilizzare il miscelatore a vortice per 30 s per liquefarlo nuovamente.
   6. Per preparare una soluzione di idrogel 0,65 M, sciogliere 427,5 mg di polvere di tartrazina e 4 mg di agarosio in 1 ml di acqua deionizzata. Per preparare soluzioni di altre concentrazioni, mantenere la concentrazione di agarosio allo 0,4% (4 mg/mL) e fare riferimento alla Tabella 1 per la corrispondente massa di Tartrazina¹⁷.

2. Pulizia ottica di tessuti ex vivo

1. Preparazione del campione
   1. Per preparare il tessuto ex vivo , affettare il tessuto di petto di pollo allo spessore desiderato parallelamente alle fibre di collagene.
   2. Pulire delicatamente il fazzoletto affettato con acqua.
   3. Misurare lo spessore posizionando il tessuto tra due vetrini da microscopio puliti. Premere delicatamente i vetrini insieme e utilizzare un calibro a corsoio per misurare la distanza tra i vetrini al centro del tessuto.
   4. Immergere il tessuto nella soluzione colorante.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che il volume della soluzione sia superiore al volume del campione e che il tessuto sia completamente sommerso.
   5. Posizionare il contenitore su un agitatore orbitale e agitare a 100 giri al minuto per 10 minuti.
   6. Lasciare riposare il tessuto nella soluzione per 60 minuti a temperatura ambiente per concentrazioni basse ≤0,4 M e a 40 °C per concentrazioni superiori >0,4 M.
2. Imaging
   1. Rimuovere il fazzoletto dalla soluzione colorante utilizzando una pinza pulita.
   2. Posizionare il campione tra due vetrini trasparenti e acquisire le immagini utilizzando una fotocamera digitale o scientifica con impostazioni di risoluzione e ingrandimento appropriate.
   3. Condurre il processo di imaging in un ambiente a luce controllata per ridurre al minimo l'interferenza della luce esterna.
   4. Ripetere il processo di imaging per campioni di tessuto con diversi spessori e concentrazioni di soluzione colorante (Figura 2B).
      NOTA: Utilizzare una sorgente luminosa a LED per la retroilluminazione. Tuttavia, funziona esattamente allo stesso modo anche per una sorgente luminosa di illuminazione superiore.
3. Misure di trasmissione ottica
   1. Per misurare la trasmissione ottica, inserire il tessuto di pollo tra due vetrini trasparenti e misurare la trasmissione utilizzando uno spettrometro UV-Visibile-NIR (Figura 2C).
   2. Assicurarsi che il sistema sia posizionato correttamente e che il raggio di luce passi attraverso la stessa regione del tessuto prima e dopo il trattamento con soluzioni coloranti per mantenere la coerenza.
      NOTA: Registrare gli spettri di trasmissione in un intervallo di lunghezze d'onda da 400 nm a 2000 nm, utilizzando una velocità di scansione media e un intervallo dati di 1,0 nm. La scansione spettrale completa richiede circa 5 minuti per campione.

3. Trasparenza ottica negli animali vivi

1. Preparazione degli animali
   1. Prima dell'esperimento, misurare il peso dell'animale e annotare il livello di attività generale per stabilire una linea di base fisiologica.
   2. Utilizzare un termoforo con la temperatura impostata a 37 °C per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'esperimento.
      ATTENZIONE: Monitorare continuamente l'animale per evitare il surriscaldamento.
   3. Somministrare l'anestesia (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) per l'imaging ottico di animali vivi basato su siti di imaging. Per l'imaging addominale, utilizzare anestetici per inalazione per un rapido recupero e anestesia iniettabile per l'imaging cerebrale.
   4. Per l'anestesia per inalazione, indurre con isoflurano all'1,5%-3% e portata 0,8 L/min per circa 5 minuti prima dell'esperimento di imaging e mantenerla all'1%-2% per tutta la durata dell'esperimento.
      ATTENZIONE: Monitorare continuamente il modello di respirazione e la profondità dell'animale. Utilizzare un'area ben ventilata per ridurre al minimo l'esposizione all'anestesia da parte del personale.
   5. Per l'anestesia iniettabile, preparare un cocktail contenente ketamina HCL (16 mg/mL) e dexmedetomidina HCL 0,2 mg/mL. Dose in base al peso dell'animale e ai protocolli istituzionali approvati.
   6. Taglia la pelliccia usando un tagliaunghie per piccoli animali dall'area di imaging desiderata.
   7. Applicare la crema depilatoria sulla zona della pelle tagliata per meno di 60 s per rimuovere i peli residui. Rimuovere immediatamente la crema e pulire la pelle con salviettine imbevute di alcol per evitare irritazioni cutanee.
   8. Utilizzare l'atipamezolo come farmaco di inversione per l'anestesia iniettabile dopo l'esperimento. Monitora l'animale durante il recupero e assicurati che torni alla normale respirazione e mobilità prima di tornare nella gabbia di casa.
2. Procedura per rendere trasparente il tessuto
   1. Preparare la configurazione di imaging posizionando un termoforo impostato a 37 °C sotto l'animale per prevenire l'ipotermia. Allineare la sorgente luminosa e la fotocamera per acquisire le immagini.
   2. Utilizzare una soluzione di idrogel di tartrazina 0,65 M miscelata con gel di agarosio allo 0,3%-0,4% per l'applicazione (passaggio 1.2).
   3. Applicare la soluzione sulla pelle (pancia o testa, a seconda della natura dell'esperimento) utilizzando un contagocce e lasciarla riposare per alcuni secondi per avviare l'assorbimento (Figura 3A).
   4. Strofinare delicatamente l'area con un batuffolo di cotone per una distribuzione uniforme della soluzione colorante e facilitare l'assorbimento dermico.
   5. Massaggiare delicatamente l'area con un batuffolo di cotone pulito e applicare altra soluzione fino a quando la pelle inizia a mostrare trasparenza e gli organi interni sono visibili. Durante l'assorbimento, la pelle mostrerà prima la comparsa di punti rosso-arancio, che gradualmente si fondono in un colore uniforme. Questo cambiamento di colore è un indicatore visivo chiave di un'adeguata penetrazione del colorante e dell'inizio della pulizia ottica.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che la soluzione non cristallizzi sull'area di applicazione: la cristallizzazione può ostruire i passaggi cutanei, ostacolando l'assorbimento delle molecole di colorante nella pelle, che è fondamentale per ottenere la trasparenza. Un sufficiente assorbimento delle molecole di colorante trasforma il colore della pelle in rosso-arancio.
   6. Continua a massaggiare delicatamente l'area fino a quando la pelle inizia a mostrare trasparenza e gli organi interni diventano visibili. Questo processo richiede in genere circa 3-5 minuti di massaggio per una piccola area, ma la durata può variare a seconda delle dimensioni dell'animale e dello spessore della pelle.
   7. Acquisisci immagini utilizzando la fotocamera allineata. Regola la messa a fuoco, l'esposizione e il bilanciamento del bianco per ottimizzare la qualità dell'immagine.
   8. Posizionare delicatamente un vetrino o un vetrino sulla pelle per ridurre al minimo la lucentezza e ridurre i riflessi per immagini di migliore qualità.
      ATTENZIONE: Maneggiare tutte le soluzioni chimiche con adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi) e smaltire i materiali usati in conformità con i protocolli di smaltimento dei rifiuti chimici dell'istituto.

4. Aumentare la visibilità degli organi con l'elaborazione delle immagini

1. Fasi di elaborazione delle immagini
   1. Python con OpenCV viene utilizzato per l'elaborazione delle immagini. Importa OpenCV, numpy, matplotlib e PyWavelets.
   2. Carica e normalizza l'immagine originale. Caricare l'immagine originale .tif ad alta profondità di bit. Se un valore di pixel supera 255, normalizzare tutti i pixel nell'intervallo [0, 255].
   3. Ritaglia la regione di interesse (ROI). Richiama il selettore ROI di OpenCV per disegnare un riquadro di delimitazione attorno all'area dell'organo. Procedi utilizzando solo la versione ritagliata per tutti i passaggi successivi.
      NOTA: Assicurarsi che il riquadro di delimitazione racchiuda saldamente l'area di destinazione senza tagliare alcuna struttura pertinente.
   4. Dividi in canali LAB. Converti l'immagine a colori ritagliata in spazio colore LAB e dividila nei canali L (luminosità), A e B.
      NOTA: le immagini vengono elaborate a colori, quindi è stato utilizzato lo spazio colore di laboratorio con tecniche di elaborazione delle immagini applicate solo al canale L, dove si trovano le intensità dei pixel.
   5. Analizza la distribuzione dell'intensità dei pixel. Traccia un istogramma del canale L per valutare il contrasto e la diffusione dell'intensità.
      NOTA: Utilizzare l'istogramma per verificare se è necessario un miglioramento del contrasto e per guidare la selezione dei parametri per il miglioramento del contrasto. Vuoi che il tuo istogramma sia distribuito su [0, 255].
   6. Applicare CLAHE (Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization) per migliorare il contrasto locale. Crea un oggetto CLAHE con clipLimit = 5.0 e tileGridSize = (16,16). Eseguire CLAHE sul canale L e unire il canale L potenziato da CLAHE con i canali A e B originali. Converti CLAHE da LAB a RGB per la visualizzazione, se necessario.
      NOTA: se l'istogramma mostra un rumore sovraamplificato (picchi), regolare 'clipLimit' o 'tileGridSize' e riapplicare per ottenere un contrasto locale bilanciato.
   7. Riduci il rumore dell'immagine con contrasto migliorato. Eseguire una decomposizione wavelet discreta a 2 livelli sul canale CLAHE L normalizzato (scalato [0, 1]) con una soglia morbida di 0,1. Ricostruire il canale L denoizzato, ridimensionarlo a [0, 255] e unire il canale L denoised con i canali A e B originali. Visualizza l'immagine a colori ritagliata originale rispetto al risultato dell'eliminazione del rumore wavelet.
      NOTA: La riduzione del rumore wavelet riduce le piccole fluttuazioni che potrebbero essere interpretate erroneamente come primo piano nelle regioni uniformi.
   8. Segmentare gli organi di interesse tramite l'Adaptive Thresholding di Otsu. Calcola la soglia di Otsu sul canale L denoizzato. Sottrai un bias di 15 dalla soglia per includere le regioni degli organi a bassa intensità.
      1. Applicare una soglia binaria con il valore di polarizzazione per ottenere una maschera dei pixel dell'organo. Unisci la maschera con i canali A e B originali e convertila in RGB per la visualizzazione.
         NOTA: L'aggiustamento del bias forza l'inclusione di regioni d'organo sotto i vasi. Se necessario, risintonizzare il bias per un set di dati diverso.
   9. Procedere all'analisi come desiderato.

Risultati

Dimostrazione della trasparenza ottica nel tessuto di petto di pollo ex vivo
Per studiare la propagazione della luce attraverso il tessuto ex vivo , abbiamo utilizzato pezzi affettati di petto di pollo crudo disossato con spessori di 1,5 mm, 2,5 mm e 3,5 mm (Figura 2B). I tessuti sono stati tagliati parallelamente alle fibre di collagene, garantendo un orientamento costante delle fibre muscolari. Le immagini sono state scattate utilizzando sia un modello a griglia a rete che il logo "UT Dallas" sotto il tessuto prima e dopo il trattamento con diverse concentrazioni di soluzione (Figura 2B). Per catturare le immagini, è stata utilizzata una fotocamera CMOS abbinata a un obiettivo con una lunghezza focale di 3,5 mm e un'apertura f/1,4 ed è stata utilizzata una sorgente luminosa a LED per la retroilluminazione del campione. I dati di trasmissione corrispondenti per ciascun tessuto sono stati quindi misurati utilizzando uno spettrometro UV-VIS-NIR (Figura 2C).

La trasparenza ottica del tessuto può essere visualizzata ad occhio nudo e quantificata con misure spettrometriche. Per i tessuti di pollo non trattati, i modelli sottostanti sono completamente invisibili e i valori di trasmissione nella regione visibile sono circa il 2,4%, 1,7% e 1% per spessori di tessuto di 1,5 mm, 2,5 mm e 3,5 mm, rispettivamente. Alla lunghezza d'onda di 1064 nm, i valori di trasmissione sono 8%, 5% e 1,8% per gli stessi spessori. Le soluzioni sono state preparate sciogliendo la polvere di tartrazina in acqua deionizzata. Dopo che i tessuti sono stati immersi in soluzioni di Tartrazina a concentrazioni crescenti, le molecole di colorante si sono diffuse in tutta la matrice extracellulare e nei compartimenti cellulari, alterando l'indice di rifrazione del mezzo interstiziale¹³. Questa corrispondenza dell'indice di rifrazione riduce sostanzialmente la dispersione della luce all'interno dei tessuti, con conseguente miglioramento dell'imaging dinamico e maggiore trasmissione nelle misurazioni spettroscopiche. All'aumentare della concentrazione di tartrazina da 0 a 0,65 M, l'indice di rifrazione delle soluzioni coloranti è aumentato e la trasparenza del tessuto è migliorata sostanzialmente. Per la soluzione colorante 0,65 M, il motivo a griglia e il logo UT Dallas sotto i tessuti diventano chiaramente visibili e la trasmissione è aumentata al 38,7%, 25% e 21,7% nello spettro visibile per spessori rispettivamente di 1,5 mm, 2,5 mm e 3,5 mm. Alla lunghezza d'onda di 1064 nm, i valori di trasmissione erano del 50%, 36,8% e 37,5% per gli stessi campioni.

Dimostrazione della trasparenza ottica negli animali vivi
Per l'imaging dinamico in animali vivi, è stata preparata una soluzione colorante con una concentrazione di 0,65 M ed è stato aggiunto agarosio a basso punto di fusione allo 0,4% per regolare la viscosità della soluzione e migliorare l'aderenza alla pelle. Durante l'imaging intestinale, l'animale è stato anestetizzato utilizzando l'anestesia per inalazione e la temperatura corporea è stata mantenuta a 37 °C utilizzando un termoforo a controllo digitale. Il pelo addominale è stato rimosso mediante rasatura e applicazione di una crema depilatoria sulla pelle, seguendo il processo mostrato nella Figura 3B, quindi l'applicazione topica di una soluzione colorante 0,65 M. La soluzione di Tartrazina è stata applicata sulla pelle per 2 minuti e poi massaggiata delicatamente. Immediatamente, nel giro di pochi minuti, le molecole di colorante si diffondono nella matrice extracellulare e negli strati dermici superficiali. La diffusione delle molecole del colorante riduce la discrepanza dell'indice di rifrazione tra il liquido interstiziale acquoso a basso indice e le strutture ricche di lipidi ad alto indice, con conseguente riduzione della dispersione della luce incidente alle interfacce tissutali e ai confini cellulari. Di conseguenza, la pelle diventa visibilmente trasparente nello spettro visibile per lunghezze d'onda superiori a 550 nm, rendendo possibile visualizzare gli organi profondi senza rimuovere chirurgicamente la pelle (Figura 3B-E). Per l'imaging ottico dei vasi cerebrali, il topo è stato anestetizzato utilizzando anestesia iniettabile e la pelliccia è stata rimossa prima dell'applicazione della soluzione colorante. I risultati dimostrano la trasparenza del cuoio capelluto e la visualizzazione dei vasi sanguigni cerebrali, convalidando l'efficacia di questa tecnica per l'imaging cerebrale (Figura 3F, G).

Per dimostrare la riproducibilità del protocollo, i risultati di trasparenza ottenuti per tre diversi topi sono presentati nella Figura 3. Per l'imaging addominale vengono utilizzati giovani topi femmina adulta (3-4 settimane di età, circa 10-12 g), comprese due diverse linee di topi, C57BL/6J (Figura 3C, F) e Chat-Cre x tdTomato (Figura 3E). I risultati ottenuti per tutti e tre i topi mostrano una maggiore trasparenza della pelle e la visualizzazione degli organi interni dopo il trattamento con soluzione colorante, convalidando questo approccio di pulizia dei tessuti. I risultati di mouse-1 vengono visualizzati in dettaglio su più punti temporali e rivelano una trasparenza graduale nel tempo di applicazione della soluzione in gel, evidenziando al contempo la progressione temporale e l'efficacia del metodo (Figura 3B, C). Vale la pena notare che anche per i topi dello stesso sesso e di età simile, le disposizioni e l'aspetto visivo degli organi interni possono variare da individuo a individuo, evidenziando il vantaggio unico dell'imaging cronico dello stesso animale per gli studi sullo sviluppo.

Reversibilità
L'approccio ottico di pulizia dei tessuti utilizzato in questo protocollo è reversibile, il che conferisce a questo approccio un vantaggio significativo per le applicazioni in vivo . La trasparenza ottica del tessuto può essere invertita semplicemente risciacquando e massaggiando delicatamente la pelle con acqua. In questo caso, l'effetto di trasparenza scompare immediatamente e la colorazione gialla del colorante svanisce in pochi minuti. Se il fazzoletto non viene risciacquato, il colore scompare gradualmente nel corso di alcune ore a causa della diffusione passiva. L'immagine mostrata nella Figura 3B, catturata dopo 2 ore di esperimento addominale, indica che la trasparenza è temporanea e può essere completamente invertita. Dopo l'inversione, la pelle mantiene un aspetto normale e i topi mostrano un'attività tipica e i peli sulla pelle trattata ricrescono entro diversi giorni (Figura 3C). Ciò conferma ulteriormente la sicurezza e l'efficacia di questo approccio per l'imaging dinamico in animali vivi, in particolare per potenziali applicazioni di imaging cronico degli stessi animali (Figura 4 e Tabella 2).

Figura 1: Illustrazione schematica della pulizia ottica in vivo (A) ed ex vivo (B) dei tessuti utilizzando soluzioni molecolari assorbenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Procedura per la pulizia ottica di tessuti ex vivo. (A) Fotografie dei processi di preparazione e chiarificazione delle soluzioni del tessuto ex vivo. (B) Immagini ottiche del tessuto del petto di pollo con diversi spessori posizionate sopra un modello. (C) Spettri di trasmittanza ottica del tessuto del petto di pollo con diversi spessori. Barre della scala: 5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedura per la pulizia ottica e l'imaging degli animali. (A) Schemi che illustrano l'applicazione delle molecole assorbenti sul ventre del topo. (B) Le serie di immagini temporali illustrano che il tessuto diventa trasparente e ritorna all'opacità dopo l'esperimento. (C) Monitoraggio a lungo termine del tessuto dei topi che illustra il recupero della pancia dei topi. (D,E) L'imaging ottico è il risultato di due animali diversi. (F) Schemi che illustrano l'applicazione delle molecole assorbenti sulla testa del topo. (G) Immagini che mostrano il cambiamento di trasparenza del tessuto per visualizzare i vasi sulla superficie del cervello. Barre della scala: 5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Elaborazione delle immagini per una migliore visualizzazione degli organi. (A) Flusso di lavoro che mostra le fasi di elaborazione delle immagini da un'immagine grezza a immagini di organi segmentate. (B) Immagini rappresentative che mostrino ogni fase dopo l'elaborazione dell'immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Massa di tartrazina (mg) disciolta in 1 mL di acqua	Percentuale relativa di tartrazina in soluzione	Concentrazione molecolare calibrata (M)
106.9	9.70%	0.18
213.7	17.60%	0.37
320.8	24.30%	0.53
426.6	29.90%	0.65

Tabella 1: Ricetta di preparazione di soluzioni di Tartrazina di diverse concentrazioni.

Fase di elaborazione delle immagini	Biblioteca	Funzione (codice)
Importazione di librerie	OpenCV, numpy, matplotlib, PyWavelets	Importa CV2 Importa numpy come NP Importa Matplotlib.pyplot come PLT Importa pywt Importa sistema operativo
Caricamento dell'originale . Immagine TIF	CV2	color_image = cv2.imread(image_path, cv2. IMREAD_UNCHANGED)
Normalizzazione se i valori dei pixel superano 255	Numpy e CV2	se color_image.max() > 255: color_image = (color_image / color_image.max()) * 255 color_image = color_image.astype(np.uint8)
Visualizza immagine a colori	matplotlib.pyplot & cv2	plt.imshow(cv2.cvtColor(color_image, cv2. COLOR_BGR2RGB)) plt.axis("disattivato") plt.show()
Ritaglio (selezione interattiva del ROI)	CV2	roi = cv2.selectROI("Seleziona regione", color_image, fromCenter=False, showCrosshair=True) x, y, w, h = ROI cropped_color = color_image[y:y+h, x:x+w] cv2.destroyAllWindows()
Dividi i canali LAB	CV2	lab_color = cv2.cvtColor(cropped_color, cv2. COLOR_BGR2LAB) l_channel, a_channel, b_channel = cv2.split(lab_color)
Analisi della distribuzione dei pixel (istogramma delle intensità)	matplotlib.pyplot	plt.figure(figsize=(8,6)) plt.hist(l_channel.ravel(), bins=256, range=[0,255], color='black', alpha=0.7) plt.title("Distribuzione dell'intensità dei pixel") plt.xlabel("Valore di intensità") plt.ylabel("Conteggio pixel") plt.grid() plt.show()
Applicazione di CLAHE per diffondere l'intensità dei pixel	CV2	clahe = cv2.createCLAHE(clipLimit=5.0, tileGridSize=(16,16)) l_channel_clahe = clahe.apply(l_channel) lab_clahe = cv2.merge((l_channel_clahe, a_channel, b_channel)) cropped_color_clahe = cv2.cvtColor(lab_clahe, cv2. COLOR_LAB2RGB)
Traccia l'immagine e l'istogramma migliorati da CLHE	matplotlib.pyplot	plt.figure(figsize=(15,5)) plt.sottotrama(1,2,1) plt.title("Immagine migliorata CLAHE") plt.imshow(cropped_color_clahe) plt.axis("disattivato") plt.sottotrama(1,2,2) plt.hist(l_channel_clahe.ravel(), bins=256, range=[0,255], color='black', alpha=0.7) plt.title("Distribuzione dei pixel dopo CLAHE") plt.xlabel("Valore di intensità") plt.ylabel("Conteggio pixel") plt.grid() plt.show()
Applicazione del denoising wavelet all'immagine	PYWT, Numpy e CV2	Coeffs = pywt.wavedec2(np.float32(l_channel_clahe)/255.0, 'db1', livello=2) coeffs_thresh = list(coeffs) per i in range(1, len(coeffs_thresh)): coeffs_thresh[i] = tuple(pywt.threshold(sottobanda, 0.1, mode='soft') per sottobanda in coeffs_thresh[i]) l_wavelet = np.uint8(pywt.waverec2(coeffs_thresh, 'db1') * 255) lab_wavelet_denoised = cv2.merge((l_wavelet, a_channel, b_channel)) color_wavelet_denoised = cv2.cvtColor(lab_wavelet_denoised, cv2. COLOR_LAB2RGB)
Visualizza l'immagine originale e l'immagine con rumore wavelet	matplotlib.pyplot & cv2	plt.figure(figsize=(12,6)) plt.sottotrama(1,2,1) plt.imshow(cv2.cvtColor(cropped_color, cv2. COLOR_BGR2RGB)) plt.title("Immagine originale a colori") plt.axis("disattivato") plt.sottotrama(1,2,2) plt.imshow(color_wavelet_denoised) plt.title("Immagine denoised wavelet") plt.axis("disattivato") plt.show()
Soglia per la segmentazione degli organi (metodo di Otsu)	CV2	otsu_val, _ = cv2.threshold(l_wavelet, 0, 255, cv2. THRESH_BINARY_INV + cv2. THRESH_OTSU) bias_val = otsu_val - 15 _, otsu_adjusted = cv2.threshold(l_wavelet, bias_val, 255, cv2. THRESH_BINARY) otsu_segmented = cv2.cvtColor(cv2.merge((otsu_adjusted, a_channel, b_channel)), cv2. COLOR_LAB2RGB) plt.imshow(otsu_segmented) plt.axis("disattivato") plt.show()

Tabella 2: Fasi di elaborazione delle immagini, librerie e script.

Discussione

Questo lavoro presenta un metodo di protocollo completo e riproducibile per ottenere la trasparenza ottica nei tessuti biologici utilizzando molecole assorbenti, in particolare il colorante alimentare Tartrazina approvato dalla FDA (approvato per l'uso nei prodotti alimentari, non nelle applicazioni mediche). Questo metodo riduce efficacemente la dispersione intrinseca nei tessuti alterando l'indice di rifrazione all'interno del microambiente del tessuto, migliorando la trasparenza ottica. Questo studio ha dimostrato l'efficacia di questo metodo sia attraverso l'imaging ex vivo che in vivo . Per l'imaging ex vivo , l'effetto di diverse concentrazioni di Tartrazina sul tessuto del petto di pollo è stato studiato con diversi spessori dei campioni biologici. I risultati indicano che una concentrazione ottimale di tartrazina può rendere i tessuti del petto di pollo trasparenti ad occhio nudo. Le misurazioni spettroscopiche della trasmissione rivelano inoltre che, sebbene la luce incidente sia quasi completamente assorbita al di sotto di 550 nm, la trasmissione della luce attraverso il tessuto aumenta significativamente per lunghezze d'onda più lunghe dello spettro visibile e nella regione del vicino infrarosso. Queste lunghezze d'onda sono comunemente utilizzate nell'imaging dei tessuti profondi, rendendo questo approccio altamente compatibile con varie modalità di imaging. Un parametro critico per il successo della chiarificazione ex vivo è la concentrazione del colorante, che deve bilanciare la massimizzazione della trasparenza ottica evitando la saturazione o la cristallizzazione. L'attuale protocollo si basa sulla diffusione passiva di molecole di colorante nel tessuto, che limita le applicazioni a campioni più grandi, poiché il tempo di diffusione richiesto è proporzionale al quadrato dello spessore dei campioni².

Per l'imaging in vivo , abbiamo dimostrato questo approccio per l'imaging addominale e cerebrale in animali vivi. I tempi di applicazione e la durata del massaggio sono passaggi cruciali, un massaggio delicato per 3-5 minuti garantisce una distribuzione uniforme e un'adeguata penetrazione. Un segnale visivo, come la pelle che diventa rosso-arancio, funge da punto di controllo intermedio che indica un assorbimento sufficiente. Questa innovativa tecnica di chiarificazione ottica transitoria ha portato a una nuova strategia per la ricerca sulla biologia integrativa, consentendo l'imaging ad alta risoluzione e in tempo reale di processi anatomici e funzionali dinamici, come la rigenerazione degli organi e il movimento interno, all'interno di tessuti vivi intatti. La reversibilità è un altro vantaggio chiave del protocollo. Una volta rimossa la soluzione colorante, l'effetto di trasparenza si inverte immediatamente dopo il lavaggio e la pelle torna all'aspetto normale in poche ore. Se non lavato, il colorante si diffonde passivamente nell'arco di poche ore. Non sono stati osservati danni o irritazioni dopo l'applicazione e i peli sono ricresciuti normalmente sulle aree trattate in pochi giorni. Questo metodo è compatibile con le modalità di imaging ottico e gli agenti di contrasto esistenti, non invasivo e consente l'imaging in qualsiasi posizione all'interno del corpo animale senza limitare il comportamento dell'animale. In combinazione con altre tecniche di imaging ottico come la microscopia multifotone²⁰ e l'imaging nel vicino infrarosso²¹, può fornire informazioni dettagliate sulla caratterizzazione strutturale, sul microambiente e sui fenotipi cellulari, facilitando gli studi sui processi fisiologici dinamici e sulla prevenzione delle malattie. Questo protocollo fornisce un'alternativa efficiente in termini di tempo, accessibile e facilmente adottabile alle tecniche di pulizia ottica invasiva o terminale esistenti. La sua semplicità, reversibilità e compatibilità con gli strumenti di imaging esistenti lo rendono un metodo potente per studi in vivo ad alta risoluzione in vari domini di ricerca, tra cui biologia dello sviluppo, neuroscienze, oncologia e medicina rigenerativa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bilancia analitica	HZK	FA220S
Macchina per anestesia animale	RWD scienze della vita co	TAIJI-IE	Anestetici per inalazione
Atipamezolo HCL iniettabile 5 mg/mL	Covertus	82124	Anestesia iniettabile
Fotocamera CMOS	Laboratori Thor	CS165CU/M, Zelux
Dexmedetomidina HCL iniettabile 5 mg/10 ml	Covertus	72960	Anestesia iniettabile
Illuminatore a fibra ottica	RWD scienze della vita co	76301	Sorgente luminosa per l'illuminazione superiore
Vetrini	CravitySci	0303-2122	Vetrini per microscopio di qualità eccellente
Coperta Omeotermica	RWD scienze della vita co	69027	Regolatore di temperatura per animali
Elaborazione di immagini	OpenCV	Pitone	Software
Siringa da insulina 0,5 mL 29 g	Punto di comfort	26028	Anestesia iniettabile
Isoflurano	Covertus	Codice SKU 029405	Anestetici per inalazione
Ketmina HCL iniezione 100 mg/mL	Dechra	20042240	Anestesia iniettabile
Fonte luminosa a LED	GGE corp	TLB-01	Sorgente luminosa per l'illuminazione superiore
Lente	Laboratori Thor	MVL4WA	Lunghezza focale di 3,5 mm e apertura f/1,4
Nair	Chiesa & Dwight	L 1224	Crema depilatoria
PBS ph 7,4 (1x)	Gibco	2902869	Anestesia iniettabile
Cotton fioc	Azienda di prodotti medici puritani	806-WC Ospedale
SeaPlaque Agarosio	Lonza	50101	Chimico
Tartrazina	MilliporeSigma	Numero CAS: 1934-21-0	Chimico
Pipetta di trasferimento	Fisherbrand	13-711-9AMMD
Spettrofotometro UV-VIS-NIR	Shimadzu	SolidSpec-3700i	Strumento
Flaconcini	Distretto di Qorpak	242633
Pipette volumetriche	Eppendorf research plus	3123000063	100-1000µ L
Sistema di purificazione dell'acqua	Scienza dell'avidità	SOLO S	Strumento