Articolo metodologico

Tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale minimamente invasiva ottimizzata nel topo

DOI:

10.3791/68631

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25 luglio 2025

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1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Le iniezioni sottoretiniche sono una tecnica indispensabile per lo sviluppo preclinico di terapie per le malattie dei fotorecettori e dell'EPR. Descriviamo una tecnica di iniezione sottoretinica transsclerale ottimizzata nei topi che migliora le percentuali di successo intraoperatorio e riduce al minimo il danno retinico.

Abstract

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Il metodo convenzionale di consegna del materiale nello spazio sottoretinico del topo prevede la doppia perforazione della retina neurale, che causa un esteso danno chirurgico. Ciò porta a variabilità nelle successive misure di esito della funzione visiva, come le registrazioni dell'elettroretinogramma (ERG) o i saggi di visione comportamentale, che confondono le valutazioni di efficacia delle terapie sperimentali. Per superare queste barriere, abbiamo ottimizzato una tecnica di iniezione sottoretinica minimamente invasiva transsclerale nei topi. In questa tecnica, si accede al fornice superiore utilizzando uno speculum palpebrale in filo di tungsteno su misura per eseguire la peritomia congiuntivale e la tenotomia. Una sclerotomia puntiforme viene eseguita utilizzando un coltello di diamante senza penetrare la retina, attraverso il quale viene inserito con cura un ago di vetro sottile con un angolo poco profondo. Il carico utile viene consegnato allo spazio sottoretinico utilizzando una pompa di microiniezione. La tomografia a coerenza ottica (OCT) viene utilizzata per valutare le dimensioni e la posizione della bolla sottoretinica immediatamente dopo l'iniezione. Abbiamo confrontato i risultati di questa tecnica con il metodo transretinico convenzionale eseguito utilizzando una siringa caricata a molla con una sclerotomia con ago 33G. Le registrazioni ERG hanno indicato un'eccellente conservazione della funzione retinica nei topi iniettati per via transscopica, paragonabile a quella dei topi di controllo non iniettati. Al contrario, è stata osservata una riduzione apprezzabile del segnale ERG nelle coorti iniettate in modo convenzionale. In sintesi, abbiamo ottimizzato una tecnica minimamente invasiva per l'iniezione sottoretinica nei topi. Dimostriamo che questa tecnica è un metodo robusto ed efficiente per la somministrazione di terapia genica che riduce al minimo il danno anatomico alla retina e ha un impatto minimo sulla funzione retinica. Questo metodo abbassa la soglia per lo sviluppo di terapie mirate sia all'epitelio pigmentato retinico che ai fotorecettori per il trattamento di un'ampia gamma di malattie retiniche e maculari.

Introduzione

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L'iniezione sottoretinica è una procedura chirurgica oculare in cui il materiale viene erogato nello spazio potenziale tra la retina e l'epitelio pigmentato retinico (RPE). Rispetto ad altri metodi di somministrazione di farmaci al segmento posteriore, come le iniezioni intravitreali o sopracoroideali, le iniezioni sottoretiniche raggiungono l'accesso più immediato sia ai fotorecettori che all'EPR. Per la somministrazione di particelle virali di terapia genica, l'iniezione sottoretinica raggiunge tassi molto più elevati di trasduzione dei fotorecettori e dell'RPE, il che consente di ridurre i titoli virali e il rischio di tossicità virale1. Inoltre, lo spazio sottoretinico è anatomicamente confinato, limitando la diffusione sistemica delle particelle virali e riducendo il rischio di risposte immunitarie2. Nell'uomo, il profilo di sicurezza delle iniezioni sottoretiniche è molto favorevole, con la struttura e la funzione retinica che si riprendono ai livelli basali entro 1 mese dall'iniezione 3,4. Le iniezioni sottoretiniche sono utilizzate in una serie di applicazioni, come il trapianto di cellule staminali e la somministrazione di farmaci a piccole molecole2, con il loro uso più comune nella somministrazione di vettori virali per trattamenti di terapia genica delle malattie della retina. I titoli virali relativamente bassi, la minima esposizione sistemica e l'alto tasso e specificità di trasduzione associati alle iniezioni sottoretiniche li hanno resi una tecnica indispensabile nel campo della retina. Le iniezioni sottoretiniche sono utilizzate con successo nei pazienti per il trattamento di disturbi retinici ereditari, tra cui la retinite pigmentosa e l'amaurosi congenita di Leber 5,6.

Data la sua importanza nel campo, la capacità di eseguire iniezioni sottoretiniche nei topi è fondamentale per gli studi preclinici che indagano le terapie per le malattie retiniche ereditarie. Tuttavia, gli attuali metodi per le iniezioni sottoretiniche di topo hanno alti tassi di fallimento e spesso causano danni chirurgici alla retina, che possono limitare l'affidabilità e la coerenza delle misure di esito funzionale. Convenzionalmente, le iniezioni sottoretiniche nei roditori vengono eseguite per via transretinica, in modo tale che l'ago penetri nella retina anteriore, passi attraverso il cristallino ed entri nello spazio sottoretinico a seguito di una seconda penetrazione della retina 7,8 (Figura 1A). Sebbene relativamente facile da eseguire, questa procedura introduce una marcata incoerenza nei risultati sperimentali a causa dell'entità variabile del danno chirurgico. Ciò è particolarmente limitante per gli studi che utilizzano misure di esito della visione comportamentale e funzionale. Inoltre, il cristallino è sproporzionatamente grande nei topi rispetto agli esseri umani; Ciò aumenta significativamente il rischio di danni al cristallino durante l'iniezione transretinica, rendendo l'animale inutilizzabile per le valutazioni funzionali della vista4.

Un'opzione alternativa è la via di iniezione transsclerale, che evita questi problemi accedendo allo spazio sottoretinico utilizzando un approccio posteriore, dove l'ago penetra la sclera, la coroide, la membrana di Bruch e l'RPE 4,9 (Figura 1B). Questo approccio riduce al minimo il danno retinico evitando completamente la penetrazione retinica. È anche associato a un ridotto reflusso di materiale iniettato dallo spazio sottoretinico10, che consente di ottenere risultati più coerenti e coorti sperimentali più piccole. Sebbene la tecnica per l'iniezione sottoretinica transsclerale nei topi sia stata precedentemente descritta in letteratura, la sua adozione diffusa rimane limitata dalla sua difficoltà tecnica, che può ostacolare il tasso di successo4. Qui, descriviamo diversi miglioramenti alla procedura di iniezione transsclerale, che la rendono più facile e veloce da eseguire, riducono la variabilità sperimentale e migliorano le percentuali di successo dell'iniezione. Questi miglioramenti includono lo sviluppo di uno speculum palpebrale di topo, la somministrazione preoperatoria di atropina, la creazione di una sclerotomia puntiforme utilizzando un coltello diamantato e l'ottimizzazione delle dimensioni dell'ago e dell'approccio all'iniezione. Questa tecnica consente di ottenere un'eccellente copertura di trasduzione virale dei fotorecettori e dell'RPE, senza causare alcun impatto chirurgico rilevabile dall'ERG.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Duke University e la Dichiarazione dell'Associazione per la Ricerca sulla Visione e l'Oftalmologia per l'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e sulla Vista.

1. Preparazione degli animali

  1. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di 1 mg/kg di atropina (in un volume totale di 50 μL) 30 minuti prima di eseguire l'iniezione sottoretinica. Questo passaggio aumenta notevolmente le percentuali di successo prevenendo i riflessi oculocardiaci e oculorespiratori potenzialmente letali innescati da un aumento transitorio della pressione intraoculare durante l'iniezione11,12.
    NOTA: Il nostro dosaggio di atropina è ottimizzato per i topi C57BL/6 e potrebbe essere necessario adattarlo ad altri ceppi di topi. Non abbiamo osservato differenze apprezzabili di sesso o di età nel dosaggio dell'atropina.
  2. Durante l'intera procedura, tenere il mouse su una superficie calda per massimizzare il comfort dell'animale e ridurre lo sviluppo della cataratta fredda.
  3. Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano inalato al 2% in ossigeno (2 L/min) fino a quando non si osserva la decubito e l'animale non risponde più al pizzicamento delle dita. Applicare una goccia di proparacaina allo 0,5% sull'occhio per l'anestesia topica.
  4. Applicare una goccia della miscela di ciclopentolato allo 0,2% e fenilefrina all'1% sull'occhio per dilatare la pupilla per l'imaging postoperatorio della bolla sottoretinica mediante OCT. La fenilefrina serve anche a ridurre il sanguinamento intraoperatorio restringendo i vasi sanguigni superficiali13.

2. Sclerotomia

  1. Prima di iniziare la procedura, caricare un microago di vetro con il volume di soluzione desiderato da iniettare. Collegare l'ago al microiniettore, con la pressione di compensazione impostata a 5 ettopascal (hPa) per contrastare l'azione capillare. In genere utilizziamo volumi di 1 μL per le iniezioni sottoretiniche.
  2. Posizionare il mouse sotto uno stereomicroscopio da dissezione. Utilizzare l'ingrandimento 20x per i passi 2.3-2.6 e l'ingrandimento 50x per i passi 2.7-3.5.
  3. Per i topi giovani, eseguire la cantotomia laterale prima della procedura, al fine di fornire un ampio accesso e visualizzazione del sito chirurgico.
  4. Esporre il fornice superiore con l'aiuto di uno speculum a filo metallico in miniatura su misura (Figura 1C). Immobilizzare lo speculum per consentire la retrazione della palpebra superiore a mani libere.
  5. Utilizzando le forbici di Vannas angolate, eseguire un'incisione paralimbare (~1 mm posteriormente al limbus) nella congiuntiva superiore e nella capsula di Tenone per esporre le 3-4 ore di orologio superiori della sclera. Fare attenzione a non perforare il seno venoso retro-orbitale. Rimuovere con attenzione ma accuratamente eventuali residui della capsula di Tenone sovrastante il sito di iniezione previsto.
  6. Afferrare il bordo anteriore della peritomia congiuntivale e della tenotomia con una pinza dentata bloccante e inferodurre delicatamente il globo per esporre la sclera superiore. Immobilizzare la pinza bloccata per consentire l'inferoduzione a mani libere.
  7. Applicare immediatamente una goccia di soluzione salina tamponata bilanciata (BSS) sull'occhio per evitare che la sclera nuda si secchi. Troviamo utile anche l'ingrandimento ottico prodotto dalla gocciolina BSS.
  8. Usando un coltello diamantato, esegui una sclerotomia puntiforme a ~12 ore e ~1-2 mm dal limbus. Posizionare la lama su un piano tangenziale rispetto alla sclera per assicurarsi che la sclerotomia sia il più piccola e superficiale possibile.
    NOTA: Questo viene fatto per due motivi: (1) una piccola sclerotomia consente un adattamento stretto dell'ago di vetro, riducendo così il reflusso durante la fase di iniezione, e (2) una sclerotomia superficiale è fondamentale per evitare di penetrare nella retina. Si noti che una piccola quantità di sangue coroideale può apparire nel sito della sclerotomia, il che non connota alcuna implicazione negativa per l'esito della procedura.

3. Iniezione sottoretinica transsclerale

  1. In preparazione all'iniezione, utilizzare una spugna chirurgica per rimuovere delicatamente tutta la BSS dalla superficie dell'occhio.
  2. Tenere l'ago smussato verso il basso con un angolo poco profondo rispetto alla sclera e introdurre la punta lentamente e con attenzione nella sclerotomia per accedere allo spazio sottoretinico. Per evitare di penetrare nella retina, farlo con un angolo relativamente basso e abbastanza profondo da liberare l'apertura della sclerotomia di 0,5-1 mm.
    NOTA: Lo smusso dell'ago è posizionato verso il basso per ridurre al minimo la possibilità di rilascio coroideale e per ridurre la probabilità di perforare la retina con la punta dell'ago che avanza.
  3. Tenendo l'ago in posizione stabile, iniziare l'iniezione a 500 hPa utilizzando un pedale e mantenere una pressione ininterrotta per 15 s.
  4. Per terminare l'iniezione, mantenere la pressione di iniezione fino a quando l'ago non è completamente rimosso dalla sclerotomia. Se la pressione viene interrotta prematuramente mentre l'ago è ancora nello spazio sottoretinico, gran parte del carico utile iniettato può uscire rapidamente dall'occhio e rientrare nell'ago per azione capillare.
  5. Una volta estratto l'ago, notare un reflusso parziale della soluzione iniettata attraverso il sito della sclerotomia. Questo è previsto, dato che il volume di 1 μL supera la capacità dello spazio sottoretinico anche nei topi adulti. L'assenza di reflusso può indicare un fallimento dell'iniezione a causa di un parto coroideale o intravitreale involontario.
  6. Rimuovere la pinza di bloccaggio e lo speculum palpebrale dall'occhio. Fare attenzione a evitare di esercitare pressione sul globo, poiché potrebbe causare un ulteriore reflusso della soluzione iniettata.
  7. Immediatamente dopo l'iniezione, applicare un abbondante unguento lubrificante sull'occhio per consentire la visualizzazione della bolla sottoretinica entro il14 ottobre.
  8. Applicare l'unguento topico all'eritromicina sull'occhio e fornire cure post-operatorie generali all'animale.

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Risultati

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Un'iniezione riuscita con questa tecnica transsclerale genera una bolla sottoretinica osservabile sull'OCT immediatamente dopo la procedura di iniezione (Figura 2A). Data la sfida tecnica di questa tecnica, la fase di imaging è indispensabile per identificare con successo gli animali iniettati. Per i ricercatori che intendono utilizzare questa tecnica per esperimenti di terapia genica, si consiglia di eseguire iniezioni pratiche con particelle di virus adeno-associati (AAV) che trasportano u...

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Discussione

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La tecnica qui descritta introduce diversi miglioramenti all'approccio di iniezione transsclerale4 precedentemente descritto, che migliorano l'affidabilità della procedura e riducono ulteriormente il danno chirurgico all'occhio. Uno di questi miglioramenti è l'uso di uno speculum per ritrarre la palpebra superiore, consentendo un accesso stabile, libero e a mani libere all'occhio. Gli speculum commerciali sono spesso scarsamente ottimizzati, anche per i topi adult...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo John Flannery (Università della California, Berkeley) per averci fornito il virus AAV1-Best1-GFP. Finanziamenti ricevuti: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (alla Duke University); Premio FFB Free Family AMD (CBR); sovvenzione illimitata da parte della Ricerca per la prevenzione della cecità (Duke Eye Center); Programma di accelerazione della ricerca traslazionale FFB TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Premio Strong Start (OA) per il medico-scienziato della Duke University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USPHospiraPAA130066
Soluzione oftalmica di atropina solfato all'1%, USPAkornNDC 17478-215-05
30 gradi; coltello diamantatoAlessiaK2-6560
AmScope 6W LED doppio illuminatore a collo d'ocaAmScopeLED-11CR
Forbici Vannas angolateRobozRS-5618
Soluzione di irrigazione sterile BSSAlcon289010-0902
Ciclomydril collirio dilatanteAlcon0065-0359-020,2% ciclopentolato, 1% fenilefrina
Puntali per pipette epT.I.P.S. MicroloaderTMEppendorf5242 956.003
Microiniettore FemtoJet 4iEppendorfE5252000021Prodotto fuori produzione
GenTeal Tears unguento lubrificante per gli occhiAlcon16027802
Aghi per microiniezione in vetroClunbury ScientificoB100-58-5030 gradi; smussatura. Diametro: 50 & micro; m esterno, 29 & micro; m interno
Soluzione di isofluranoCovetrus29405
Microscopio per imaging retinico MICRON IV con OCT guidato da immaginiFeniceN/A
Stereomicroscopio SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Pinza dentata di bloccaggio Stern-CastroviejoAlessiaK5-2552
Pinze dentateRobozRS-5172
Fili di pulizia al tungsteno per aghi calibro 23sHamilton18306
Ultracell PVA Eye SpearsBVI Medico40400-8
Siringhe da insulina Ultra-Fine2015 BD3284383/10 mL, 8 mm (5/16"), 31G

Riferimenti

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