Articolo metodologico

Evidenziazione della transizione del citocromo C mitocondriale mediante microscopia elettronica a immunotrasmissione

DOI:

10.3791/68633

⸱

15 agosto 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo descrive i metodi per studiare i cambiamenti micromorfologici nei neuroni e la transizione del citocromo c mitocondriale mediante microscopia elettronica a immunotrasmissione.

Abstract

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I cambiamenti di localizzazione delle proteine nella microstruttura presentano spesso un preciso meccanismo di regolazione a livello degli organelli patologici. Il modo in cui catturare con precisione la posizione di questo trasferimento proteico dell'organello ha un significato e un valore positivi per la diagnosi e il trattamento delle malattie. I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella necrosi e nella via intrinseca dell'apoptosi. In condizioni normali, il citocromo c (Cyt c) esiste solo tra le membrane interne ed esterne dei mitocondri e nel nucleo. Quando le cellule subiscono l'apoptosi, la permeabilità della membrana interna mitocondriale viene alterata e Cyt c viene rilasciata dai mitocondri nel citoplasma. In questo studio, è stato stabilito un modello di ratto di danno da ischemia-riperfusione cerebrale e i cambiamenti micromorfologici dei neuroni sottoposti ad apoptosi sono stati mostrati mediante microscopia elettronica a trasmissione immunitaria. Inoltre, mostra la visione del trasferimento di Cyt c dalla matrice mitocondriale al citoplasma dopo un danno da ischemia-riperfusione cerebrale più precisamente. La tecnica di microscopia elettronica a immunotrasmissione presentata in questo protocollo è adatta per la dimostrazione di qualsiasi transizione di posizione proteica a livello microscopico.

Introduzione

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Secondo lo studio Global Burden of Disease del 2021, l'ictus è stata la 3a causa di morte e la4a causa di anni di vita aggiustati per disabilità. Ci sono stati 11,9 milioni di nuovi eventi di ictus, in cui l'ictus ischemico ha costituito il 65,3% (7,8 milioni)1. La morte neuronale si verifica dopo l'ischemia cerebrale, compresa la necrosi e l'apoptosi. Il tessuto cerebrale più gravemente colpito subisce successivamente la morte delle cellule necrotiche. I neuroni nella penombra ischemica o nella zona periinfartuale possono andare incontro ad apoptosi dopo diverse ore o giorni2. Oltre alle funzioni bioenergetiche e metaboliche, i mitocondri svolgono anche un ruolo centrale nella via intrinseca dell'apoptosi 3,4,5,6.

Cyt C è una proteina codificata dai geni nucleari. In condizioni normali, Cyt C esiste solo tra le membrane interne ed esterne dei mitocondri e nel nucleo. La via apoptotica mediata dal suo rilascio è associata al controllo regolatorio dei membri della famiglia Bcl-2. Dopo essere stati stimolati dall'apoptosi, gli oligomeri Bax/Bak si formano e si inseriscono nel poro esterno della membrana mitocondriale, con conseguenti cambiamenti nella pressione osmotica mitocondriale e perdita di potenziale transmembrana. Cyt C viene rilasciato dai mitocondri al citoplasma, dove si lega all'attivatore dell'apoptosi 1 per formare il complesso apoptotico e attivare la pro-caspasi-9. A loro volta, vengono attivate la caspasi-3 e la caspasi-7, che avvia la cascata della caspasi e induce l'apoptosi cellulare7.

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è in grado di osservare chiaramente i cambiamenti nella struttura cellulare nelle diverse fasi dell'apoptosi. L'osservazione morfologica al microscopio elettronico è un metodo affidabile per determinare l'apoptosi8. Tuttavia, non può osservare cambiamenti in Cyt C nell'ultrastruttura. Esistono diverse tecniche per rilevare proteine specifiche nell'ultrastruttura: citometria a flusso, saggio di immunoassorbimento enzimatico, saggio di immunoassorbimento enzimatico, spettrofotometria e Western blotting. Tuttavia, non possono catturare con precisione i cambiamenti di posizione delle proteine nella microstruttura. L'oro colloidale ha particelle di diverse dimensioni e la densità elettronica dell'oro colloidale è elevata. La tecnologia Immunogold è particolarmente adatta per studi di localizzazione a marcatura singola o multipla di microscopia immunoelettronica. A causa della sua intrinseca colorazione rosso chiaro-scuro, l'oro colloidale è anche suscettibile di osservazione al microscopio ottico. Quando proteine specifiche sono marcate con Immunogold, i cambiamenti di posizione possono essere visualizzati per mezzo di un TEM a una risoluzione subcellulare9.

Questo protocollo descrive l'evidenziazione della transizione della Cyt C mitocondriale mediante microscopia elettronica a immunotrasmissione (IEM). L'obiettivo generale di questo metodo è quello di visualizzare la traslocazione subcellulare di Cyt C durante l'apoptosi indotta da ischemia utilizzando l'IEM. Il razionale per l'IEM è quello di marcare Cyt C con oro colloidale e visualizzare i suoi cambiamenti di localizzazione alla risoluzione subcellulare utilizzando TEM9. L'IEM è in grado di osservare i cambiamenti dinamici delle proteine a livello spaziale, fornendo un potente mezzo per spiegare le attività fisiologiche e patologiche10.

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Protocollo

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Il programma sugli animali è stato approvato dal Comitato Etico della SLAS (IACUC Issue No: SYST-2024-018). Qui, 6 ratti maschi SD privi di agenti patogeni (200-220 g) sono stati allevati in gabbie di ventilazione indipendenti, mantenendo l'ambiente di laboratorio a 22-25 °C e 45%-65% di umidità relativa. Tutti i ratti sono stati sottoposti a alimentazione adattativa per 1 settimana con acqua e dieta libere durante il periodo.

1. Istituzione del modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)

  1. Dividi casualmente i ratti nel gruppo MCAO e nel gruppo dell'operazione fittizia, con tre ratti in ogni gruppo. Vedere la Figura 1 per il diagramma di flusso sperimentale.
  2. Verificare le apparecchiature coinvolte in questo protocollo secondo l'elenco nella Figura 2.
  3. Per stabilire un modello di MCAO del danno da ischemia-riperfusione di ratto, utilizzare la procedura di sutura intraluminale.
  4. Digiunare i ratti per 12 ore prima dell'intervento chirurgico con acqua accessibile.
  5. Anestetizzare i ratti SD con isoflurano al 2% (vedi Tabella dei materiali) in una miscela aria-ossigeno a 0,6 L/min. Confermare la corretta anestesia tagliando la pelle degli arti con una pinza; I ratti non dovrebbero avere retrazione o riflesso alle gambe. Fissare i ratti completamente incoscienti sul tavolo operatorio e mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando un mantenitore di temperatura per animali. Chiudi gli occhi con del nastro adesivo durante l'intervento chirurgico per prevenire la secchezza.
  6. Rimuovere il pelo intorno al collo con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con betadine. Praticare un'incisione del collo sulla linea mediana di 1,5 cm con le forbici chirurgiche (vedi Tabella dei materiali), eseguire una dissezione smussata sul muscolo e sulla fascia perivascolare ed esporre la trachea per localizzare l'arteria carotide comune destra (CCA), l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA). Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati per prevenire l'infezione.
  7. Legare l'estremità distale dell'ECA con una sutura 6-0chirurgica e posizionare un'altra sutura chirurgica attorno all'estremità prossimale dell'ECA fino al punto di biforcazione. Fare attenzione a non danneggiare il nervo vagale.
  8. Agganciare il CCA e l'ICA con clip vascolari e praticare una piccola incisione nell'ECA tra due suture chirurgiche.
  9. Introdurre la sutura monofilamento nel lume ECA verso il basso verso il CCA, stringere la sutura chirurgica attorno al moncone ECA per fissare la sutura intraluminale e prevenire il sanguinamento. Assicurarsi che la sutura monofilamento corrisponda al peso dell'animale per ridurre al minimo i danni e raggiungere un volume di infarto target del 40% nell'emisfero omolaterale.
  10. Tagliare la parte rimanente dell'ECA per liberare il moncone e posizionare il moncone ECA al di sotto del punto di biforcazione in modo che sia all'incirca in linea con l'ICA.
  11. Rimuovere la clip microvascolare dall'ICA, continuare ad avanzare la sutura fino a quando non si avverte una lieve resistenza, che indica l'occlusione dell'arteria cerebrale media; Questa lunghezza è in genere di circa 2 cm. Legare saldamente la sutura attorno al monofilamento. Rimuovere l'altra clip microvascolare dal CCA.
  12. Chiudere l'incisione con sutura chirurgica e mettere il ratto in una gabbia di recupero, prendersi cura dell'animale fino a 2 ore dopo l'ischemia.

2. Ripristino del flusso sanguigno dell'arteria cerebrale media

  1. Prima di ri-anestesia, controllare il neuroscore con la Longa Score Scale per valutare il successo dell'intervento chirurgico come descritto nel passaggio 3.
  2. Anestetizzare il ratto come sopra e riaprire l'incisione. Posizionare una clip microvascolare sul CCA, estrarre la sutura occlusiva parzialmente dall'ICA fino a quando l'estremità della sutura non è visibile attraverso l'ICA.
  3. Posizionare un'altra micro clip sull'ICA sopra la posizione della sutura intraluminale, rimuovere completamente la sutura occlusiva e legare il moncone ECA. Riperfusione per 24h.
  4. Rimuovere le clip dal CCA e dall'ICA. Chiudere l'incisione con una sutura chirurgica. Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg; vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea.
  5. Rimetti il topo nella gabbia, fornisci acqua e cibo schiacciato e prenditi cura finché non riprende conoscenza. Mantenere la temperatura corporea dei ratti a 37± 0,5 °C durante l'intera procedura sperimentale.

3. Valutazione del neuroscore

  1. Valutare i deficit neurologici dopo l'operazione e 24 ore dopo la riperfusione utilizzando la scala di punteggio Longa11: (0) nessun deficit; (1) mancata estensione completa della zampa anteriore sinistra (lato paralizzato); (2) girare a sinistra (lato paralizzato); (3) caduta a sinistra (lato paralizzato); (4) nessuna deambulazione spontanea e diminuzione della coscienza; (5) morto.
    NOTA: Tre operatori sono stati valutati secondo gli standard di cui sopra.

4. Raccolta del tessuto cerebrale

  1. Raccogliere i tessuti cerebrali 24 ore dopo la riperfusione dopo che i deficit neurologici sono stati valutati e valutati.
  2. Anestetizzare il ratto come descritto sopra. Tagliare la pelle per esporre la testa e il collo e tagliare il cordone cervicale dal rachide cervicale con le forbici chirurgiche (vedi Tabella dei materiali).
  3. Separare e rimuovere i muscoli posteriori del collo. Rimuovere con cautela il cranio con una pinza curva (vedi Tabella dei materiali). Prestare attenzione alla dura madre quando si separa il cranio per evitare di graffiare i tessuti cerebrali. Rimuovere completamente i tessuti cerebrali.
  4. Porre i tessuti cerebrali nel fissativo TEM e IEM preraffreddato a 4 °C e conservare in frigorifero a 4 °C.

5. Operazione fittizia

  1. Per le operazioni fittizie, eseguire tutte le procedure come sopra, tranne che l'occlusione non viene eseguita.

6. Preparazione e imaging di sezioni ultrasottili

  1. Preparazione della sezione ultrasottile TEM
    1. Fissaggio: determinare il sito di campionamento del tessuto fresco per ridurre al minimo i danni meccanici come trazione, contusione ed estrusione e assicurarsi che lo spessore del tessuto non superi i 2 mm. Assicurarsi che il volume del tessuto non superi 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Fissare con fissativo TEM a 4 °C per 24 h. Lavare 3 volte per 15 minuti ciascuna in tampone fosfato 0,1 M PB (pH 7,4; vedere la tabella dei materiali).
    3. Post fissaggio: Aggiungere l'1% di acido osmico·0,1 M PB (vedi Tabella dei materiali) per 2 ore a temperatura ambiente (25 °C).
    4. Disidratazione: disidratare il tessuto successivamente in etanolo al 30% per 10 minuti, etanolo al 50% per 10 minuti, etanolo al 70% per 15 minuti, etanolo al 90% per 15 minuti, etanolo assoluto per 15 minuti e acetone al 100% per 15 minuti.
    5. Immersione della gomma: Immergere successivamente i tessuti nella soluzione di resina epossidica SPI-Pon 812: acetone=1:3 per 30 minuti, soluzione SPI-Pon 812: acetone = 1:1 per 30 minuti e soluzione SPI-Pon 812: acetone = 3:1 per 1 ora (vedi Tabella dei materiali).
    6. Polimerizzazione e inclusione: Immergere il campione in SPI-Pon 812 puro per una notte a 37 °C, passare a SPI-Pon 812 fresco per 8 ore e polimerizzare a 60 °C per 48 ore (vedere la Tabella dei materiali).
    7. Sezionamento: Affettare il blocco incorporato in modo semi-sottile a 0,8 μm di spessore con un coltello diamantato, colorare con blu di aminotoluene a 25 °C per 5 minuti. Individua e seleziona le aree con neuroni densamente impacchettati con un microscopio ottico per l'osservazione ad alto ingrandimento. Realizzare sezioni ultrasottili con un microtomo a 90 nm di spessore. Mettere i campioni su griglie di rame rivestite di formvar a 200 maglie (vedi Tabella dei materiali).
    8. Post-colorazione: Colorazione delle griglie in acetato di uranile a 25 °C per 15 min, quindi colorazione delle griglie in citrato di piombo a 25 °C per 5 min.
  2. Preparazione della sezione ultrasottile IEM
    1. Eseguire i passaggi 6.1.1-6.1.4.
    2. Immersione della gomma: Immergere successivamente i tessuti in soluzione L. R. Resina bianca: Etanolo = 1: 3 per 2 ore, soluzione L. R. Resina bianca: Etanolo =1: 1 per 2 ore e soluzione L. R. Resina bianca: Etanolo = 3: 1 per 2 ore.
    3. Polimerizzazione e inclusione: Immergere il campione in resina bianca L. R. pura per una notte a 4 °C, passare alla resina bianca L. R. fresca per 4 ore a 25 °C e polimerizzare a 55 °C per 78 ore.
    4. Sezionamento (come fatto al punto 6.1.7): Affettare i blocchi incorporati in modo semi-sottile a 0,8 μm di spessore, colorare con blu aminotoluene a 25 °C per 5 minuti. Individuare e selezionare le aree con neuroni densamente impacchettati con un microscopio ottico. Realizza sezioni ultrasottili a 90 nm di spessore. Mettere i campioni su griglie di rame.

7. Etichettatura Immunogold

  1. Sciacquare 2 volte con PBS e 1 volta con tampone glicina a 25 °C per 5 minuti ciascuno, quindi aggiungere il 2% di tampone fosfato di albumina sierica bovina (PBS-BSA) e incubare per 30 minuti.
  2. Incubare nella soluzione di anticorpo primario (anticorpo policlonale di coniglio contro il citocromo C) a 37 °C per 2 ore. L'anticorpo primario viene diluito con PBS-BSA in un rapporto di 1:50.
  3. Risciacquare con PBS a 25 °C per 5 volte per 5 minuti ciascuno. Incubare nella soluzione di anticorpi secondari marcati con oro colloidale (IgG anti-coniglio di capra coniugata con oro) a 25 °C per 1 ora. L'anticorpo secondario viene diluito con PBS-BSA in rapporto di 1:20 (vedere la Tabella dei materiali).
  4. Risciacquare con PBS a 25 °C per 5 volte per 5 minuti ciascuno. Sciacquare con acqua distillata a 25 °C per 5 volte per 5 minuti ciascuno (vedi Tabella dei materiali).
  5. Post-colorazione: Scolorare le griglie in acetato di uranile a 25 °C per 10 min, quindi colorare le griglie in citrato di piombo a 25 °C per 2 min (vedi Tabella dei Materiali).
  6. Immagina la sezione ultrasottile e scatta foto con un microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.

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Risultati

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La valutazione del neuroscore conferma il successo di MCAO, secondo la Longa Score Scale, i ratti nel gruppo MCAO presentavano almeno un cerchio a sinistra (neuroscore 2). I ratti del gruppo con operazione fittizia non hanno mostrato alcuna disfunzione neurologica evidente (neuroscore 0). Non è stata osservata mortalità durante il giorno dell'intervento. Il neuroscore degli animali è elencato nella Tabella 1.

L'analisi IEM del gruppo MCAO ha rivelato neuroni con nuclei rimpicc...

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Discussione

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L'obiettivo principale della terapia di riperfusione nell'ictus ischemico acuto è ripristinare la perfusione sanguigna nella regione ischemica. Ora possiamo raggiungere questo obiettivo attraverso la trombolisi endovenosa, il trattamento endovascolare e la terapia antitrombotica. Tuttavia, il ripristino della perfusione sanguigna porta a danno da ischemia-riperfusione, aggrava la necrosi neuronale e l'apoptosi, portando a compromissione neurologica. Durante l'ischemia-riperfusione, la pe...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto di Ricerca Scientifica Speciale sulla Medicina Tradizionale Cinese dell'Amministrazione Provinciale della Medicina Tradizionale Cinese del Sichuan (2021MS414).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,9% soluzione salina normaleSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 Mesh formvar rivestite griglie di rameZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g MCAO MonofilamentiPechino Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Etanolo assolutoChengdu Kelong  Chimico  Co., Ltd.
acetoneChengdu Kelong  Chimico  Co., Ltd.
Sistema per anestesia animaleRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Mantenitore di temperatura per animaliRayward Life Technology Co., Ltd.69020
Tavolo da fornoShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
cesoia osseaFine Science Tools16102-11
stampi per inclusione capsulareZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
CentrifugaSCILOGEXD3024R
Microscopia ottica convenzionale a campo chiaroZeiss (Germania)Primo Star
Pinze oftalmiche curve (10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Coltello diamantatoDiatome (Svizzera)DU4530
Pinza da dissezioneRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Pinze da dissezioneRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Forno elettrico per l'essiccazione di rapidaShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
Rasoio elettricoYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Fluido di fissazioneSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.SC0001
vetrinoNantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Capra coniugata in oro anti-coniglio lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Pinze emostatiche (12,5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Pinza emostatica (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluranoRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. Resina biancaTianjin Tainuo Scienza e tecnologia Co., Ltd.
Citrato di piomboSPI (US)GA10701
Porta aghi Jiachi Medical Technology Co., Ltd.
Tetrossido di osmioTED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
Anticorpo policlonale di coniglio contro il citocromo  Affinità Bioscienze, Ltd.AF0146
RattiPechino Huafukang Biotecnologia Co., Ltd.
SPI-Pon 812 kit di resina per inclusioneSPI (US)GS02660
StereomicroscopioSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
Forbici a testa dritta (10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Pinze oftalmiche diritte (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Forbici chirurgicheRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Microscopia elettronica a trasmissioneHitachi (Giappone), Ltd.HT7800
ultramicrotomoLeica (Germania)UC7
Acetato di uranioSPI (USA)GS02624
H2008340020231012012023120501211001220518001D111094 Fornitore verificato - 2024071201AGR1281AFornitore verificato - 10044036898028110322241102187881211001

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2021 Nervous System Disorders Collaborators. Global, regional, and national burden of disorders affecting the nervous system, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet Neurol. 23 (4), 344-381 (2024).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (3), 231-341 (2008).
  3. Li, G. R., et al. Albiflorin: a promising natural monoterpene glycoside with potential therapeutic benefits for multiple physiological systems. Food Med Homol. , (2025).
  4. Ye, X. S., et al. The food and medicine homologous Chinese Medicine from Leguminosae species: A comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2 (2), 9420033(2025).
  5. Mubeen, M., Sakarwala, A. S., Bijarani, A. I., Kamal, M. T. Enhancing heart health: expanding the use of SGLT2 inhibitors in cardiovascular disease. Med Adv. 3 (2), 122-126 (2025).
  6. Zhang, Y. C., et al. Comprehensive analyses of nuclear mitochondria-related genes in the molecular features, immune infiltration, and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma. Med Adv. 2 (3), 238-253 (2024).
  7. Broughton, B. R., Reutens, D. C., Sobey, C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40 (5), e331-e339 (2009).
  8. Guo, M. J., Lu, B., Gan, J. L., Wang, S. C., Jiang, X. J., Li, H. H. Apoptosis detection: a purpose-dependent approach selection. Cell cycle. 20 (11), 1033-1040 (2021).
  9. Squarzoni, S. Immunoelectron Microscopy Methods. Methods Mol Biol. 2655, 201-210 (2023).
  10. Liu, Y., Ohgaki, R., Okanishi, H., Xu, M., Kanai, Y. Amino acid transporter LAT1 is expressed on cancer cell-derived exosomes with potential as a diagnostic and prognostic biomarker. Sci Rep. 14 (1), 28458(2024).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  12. Sanderson, T. H., Reynolds, C. A., Kumar, R., Przyklenk, K., Hüttemann, M. Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain: pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation. Mol Neurobiol. 47 (1), 9-23 (2013).
  13. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Tandler, B., Hoppel, C. L. Mitochondrial Dysfunction and Myocardial Ischemia-Reperfusion: Implications for Novel Therapies. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 57, 535-565 (2017).
  14. Hetz, C., et al. channel inhibitors prevent mitochondrion-mediated apoptosis and protect neurons in a model of global brain ischemia. J Biol Chem. 280 (52), 42960-42970 (2005).
  15. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. J Neurochem. 106 (3), 1248-1258 (2008).
  16. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labelling for scanning electron microscopy. Methods Mol Biol. 657, 297-313 (2010).
  17. Sachse, M., de Castro, I. F., Fournier, G., Naffakh, N., Risco, C. Metal-Tagging Transmission Electron Microscopy and Immunogold Labeling on Tokuyasu Cryosections to Image Influenza A Virus Ribonucleoprotein Transport and Packaging. Methods Mol Biol. 1836, 281-301 (2018).
  18. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  19. Veeramachaneni, R., Gu, X., Herrera, G. A. Atypical amyloidosis: diagnostic challenges and the role of immunoelectron microscopy in diagnosis. Ultrastruct Pathol. 28 (2), 75-82 (2004).
  20. Fossmark, R., et al. Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS. 113 (7-8), 506-512 (2005).
  21. Page, L. J., et al. Secretion of amyloidogenic gelsolin progressively compromises protein homeostasis leading to the intracellular aggregation of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (27), 11125-11130 (2009).
  22. Vainer, B., Sørensen, S., Nielsen, O. H., Horn, T. Subcellular localization of intercellular adhesion molecule-1 in colonic mucosa in ulcerative colitis. Ultrastruct Pathol. 26 (2), 113-121 (2002).
  23. Cheng, X. T., et al. Revisiting LAMP1 as a marker for degradative autophagy-lysosomal organelles in the nervous system. Autophagy. 14 (8), 1472-1474 (2018).
  24. Karreman, M. A., van Donselaar, E. G., Gerritsen, H. C., Verrips, C. T., Verkleij, A. J. VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic. 12 (7), 806-814 (2011).
  25. Wang, X. B., et al. Mechanistic Insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 Cells. J Vis Exp. (218), e66923(2025).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

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