Method Article

Microscopia multiarmonica simultanea ad autofluorescenza senza marcatura

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta una guida passo passo per la tecnica microscopica SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), inclusi dettagli su come generare la sorgente di luce laser, preparare un campione di tessuto, condurre l'imaging e analizzare i dati. SLAM fa progredire la microscopia non lineare misurando quattro contrasti complementari privi di marcatura per studiare il microambiente tissutale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia ottica non lineare visualizza campioni biologici rilevando i segnali derivanti dall'interazione non lineare di impulsi laser ultracorti con molecole endogene. Questo metodo consente una rapida identificazione chimica e strutturale a risoluzione subcellulare in modo non distruttivo e senza marcature, consentendo così un approccio potente per studiare cellule e tessuti. Questi contrasti non lineari distintivi includono l'autofluorescenza eccitata da multifotoni e la generazione armonica. Poiché ciascuno di questi contrasti offre vantaggi e limitazioni unici, la loro combinazione e la loro co-registrazione spazio-temporale forniscono una tavolozza di contrasto complementare che migliora le capacità analitiche della microscopia ottica non lineare. Pertanto, il nostro gruppo ha sviluppato la microscopia SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), una tecnica di imaging che misura quattro o più segnali ottici non lineari generati contemporaneamente, con l'obiettivo di identificare caratteristiche morfologiche, metaboliche e funzionali distinte in campioni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging SLAM dei tessuti, concentrandosi sui componenti essenziali della tecnica, tra cui la sorgente laser, la compressione degli impulsi e il microscopio. Inoltre, discutiamo la preparazione dei campioni e delineiamo la pipeline di elaborazione dei dati per i dati SLAM. Il flusso di lavoro presentato è adatto per studiare lo stato metabolico, l'arrangiamento, le risposte cellulari e la composizione di tessuti umani e animali senza fare affidamento su etichette esogene.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia ottica non lineare sfrutta la risposta di un campione a un'intensa radiazione ottica (luce con campi elettrici superiori a 3 × 103 V/cm) per derivare il contrasto dell'immagine, dove la polarizzazione indotta (e quindi il segnale generato) dipende in modo non lineare dall'intensità incidente 1,2,3. Poiché questi contrasti multipli sono mediati da diverse interazioni luce-materia, la microscopia non lineare fornisce l'accesso simultaneo a informazioni uniche riguardanti sia la morfologia che il paesaggio chimico di un campione 1,2,3. Mentre le tecniche di microscopia tradizionali che prevedono un'interazione lineare con la luce di illuminazione consentono anche l'imaging quantitativo, la microscopia non lineare consente un approccio più multimodale, spesso con una migliore profondità di imaging e sezionamento ottico, causando anche meno fotodanni al campione4. Nel contesto delle applicazioni biomediche, come la valutazione intraoperatoria di tipo istologia del tessuto 5,6, questa tecnica consente il sondaggio diretto di biomolecole native, facilitando indagini senza soluzione di continuità di cellule viventi senza la necessità di marcatori esterni o modifiche. Questo approccio evita l'uso di tag, etichette7, molecole esogene, proteine fluorescenti geneticamente espresse o nanoparticelle, che non solo richiedono un lavoro esteso, ma hanno anche il potenziale di interrompere la biochimica nativa del campione e avere un impatto negativo sulle cellule o sui tessuti bersaglio 8,9,10. Pertanto, il microscopio non lineare funge da strumento analitico potente e genuino che fornisce immagini continue di strutture microscopiche senza alterare l'integrità chimica e strutturale del campione. Questa capacità apre un'ampia gamma di applicazioni, che vanno dalla diagnosi e dalla scoperta di farmaci alla segnalazione cellulare e alla biologia dei sistemi.

I contrasti multifotone come l'autofluorescenza a due fotoni (2PAF), l'autofluorescenza a tre fotoni (3PAF), la generazione di seconda armonica (SHG) e la generazione di terza armonica (THG) conferiscono vantaggi analitici nella caratterizzazione dei campioni. Il 2PAF è generato da flavine endogene, con la flavina adenosina dinucleotide (FAD) che è la più abbondante nei sistemi biologici11. Il 3PAF sfrutta l'eccitazione nel vicino infrarosso per visualizzare cromofori intrinseci come il NAD(P)H e consente l'imaging metabolico eludendo i problemi di fototossicità e attenuazione legati ai raggi UV12. L'SHG rivela specificamente strutture molecolari non centrosimmetriche come il collagene fibrillare (tipi I, II e III) e gli array proteici 13,14,15,16,17, fornendo informazioni strutturali 1. Infine, THG, sensibile alle interfacce e alle piccole caratteristiche strutturali, eccelle nell'imaging delle distribuzioni lipidiche e delle vescicole extracellulari 18,19,20,21,22.

Ciascuno di questi segnali di contrasto è stato esplorato in modo indipendente da gruppi di ricerca, stabilendo la nicchia per la microscopia non lineare multifotone come strumento affidabile e versatile per applicazioni biologiche 23,24,25,26. Questi sforzi sono stati guidati dagli inventori del microscopio 2PAF, che hanno sfruttato la loro tecnologia innovativa per ottenere nuove intuizioni sulla morfologia dei tessuti, sul metabolismo cellulare e persino sulle caratteristiche morfofunzionali di patologie come il morbo di Alzheimer e il cancro23. Il loro lavoro ha infine portato ad applicazioni rivoluzionarie nelle neuroscienze27,28. Negli anni successivi, diversi ricercatori hanno evidenziato la sensibilità dell'SHG ai cambiamenti nella matrice extracellulare, l'impalcatura che fornisce supporto strutturale alle cellule e che subisce sostanziali alterazioni durante la patogenesi del cancro29. In particolare, Campagnola et al.14,24,30,31 hanno dimostrato che la microscopia SHG consente la visualizzazione di assemblaggi macromolecolari e supramolecolari, rivelando dettagli come la disposizione, la concentrazione e il tipo di collagene che non sono rilevabili con le tecniche convenzionali basate sulla fluorescenza. Questi risultati hanno sottolineato il potenziale della microscopia SHG come strumento diagnostico praticabile in ambito clinico. Infine, la microscopia THG è stata applicata con successo per visualizzare gli strati retinici nei roditori alla risoluzione subcellulare25, mappare le strutture cerebrali32 e catturare la topografia multi-interfacciale dell'invasione delle cellule di melanoma33.

Queste implementazioni storiche della microscopia non lineare generalmente coinvolgevano un laser a femtosecondi (fs) accoppiato a un obiettivo ad alta apertura numerica (NA) per generare e raccogliere i segnali non lineari, che venivano poi diretti con uno specchio dicroico a un filtro passa-banda e raccolti con un tubo fotomoltiplicatore (PMT)34. Nonostante implementazioni simili, la maggior parte delle applicazioni si è concentrata sull'acquisizione di uno o al massimo due contrasti, trascurando gli altri. Per realizzare appieno il potenziale del microscopio multifotone, Boppart et al. hanno prima implementato l'acquisizione sequenziale di contrasti multipli non lineari 21,35,36,37, seguita dalla loro rilevazione simultanea 4,22,38,39,40,41. La tecnica risultante, nota come microscopia SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), co-registra spazialmente e temporalmente i segnali non lineari 2PAF, 3PAF, SHG e THG attraverso l'eccitazione single-shot e il rilevamento multiplex, ottenendo così una potenza analitica superiore. La co-localizzazione spazio-temporale di questi quattro canali fornisce dati altamente classificati e ricchi di funzionalità42, offrendo vantaggi rispetto ai dati acquisiti in sequenza, eliminando gli artefatti di movimento e garantendo una migliore registrazione delle immagini. Di conseguenza, la SLAM consente la generazione di caratteristiche composite, come i rapporti ottici di riduzione-ossidazione, che caratterizzano efficacemente le proprietà metaboliche 43,44,45. Inoltre, l'analisi combinata dei segnali tra le modalità facilita l'ingegnerizzazione di funzionalità aggiuntive basate sulla correlazione e la colocalizzazione dei canali. Ad esempio, Shi et al. hanno dimostrato l'importanza delle caratteristiche di colocalizzazione della microscopia SLAM nella classificazione accurata delle cellule ovariche di criceto cinese (CHO) utilizzate nella produzione farmaceutica42. In questo modo, SLAM getta le basi per quello che oggi è considerato lo stato dell'arte della microscopia multifotone, aprendo la strada a futuri progressi nel campo46.

In questo protocollo, descriviamo i componenti chiave di un microscopio SLAM (Figura 1) e descriviamo una metodologia passo dopo passo per la sua implementazione. Ciò include la generazione e la modellazione degli impulsi di eccitazione, la preparazione del campione di tessuto rappresentativo, le procedure di imaging e l'elaborazione, nonché la visualizzazione dei dati risultanti. Utilizzando la tecnologia standard e le tecniche consolidate, questo protocollo è universale, trasferibile e può essere facilmente riprodotto utilizzando sistemi ottici simili in diversi laboratori.

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Figura 1: Il design ottico di un microscopio multiarmonico ad autofluorescenza senza marcatura (SLAM) simultaneo. Il laser a femtosecondi emette luce a 1040 nm in impulsi di 370 fs a una frequenza di ripetizione di 10 MHz. L'intensità e la polarizzazione del laser vengono attentamente controllate prima di pompare un cristallo fotonico per generare un supercontinuum. Gli impulsi vengono quindi compressi da un modellatore di impulsi e diretti in un microscopio a scansione laser personalizzato (dashed box). Gli specchi dicroici e i filtri passa-banda isolano i segnali non lineari generati dal campione prima che vengano rilevati da rivelatori di fotoni ad alta sensibilità come i tubi fotomoltiplicatori (PMT) o i fotorivelatori ibridi (HPD). Il design ottico si basa su un sistema41 precedentemente descritto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo il protocollo UIUC#23031 approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Illinois e hanno seguito rigorosamente tutte le linee guida e i regolamenti pertinenti.

1. Scissione e allineamento della fibra di cristallo fotonico (PCF)

  1. Utilizzando tronchesi per fibre o tronchesi, tagliare una sezione di fibra di cristallo fotonico (PCF, Table of Materials) a una lunghezza di poco superiore a 15 cm.
    NOTA: Lunghezze di almeno 1,5 cm verranno tagliate da ciascuna estremità del PCF poiché questa lunghezza è necessaria per bloccare saldamente il PCF durante la scissione. La lunghezza finale del PCF (12 cm) utilizzata in questo studio è stata determinata sulla base di una precedente simulazione utilizzando l'equazione di Schrödinger non lineare generalizzata47 e test empirici. In generale, la lunghezza migliore del PCF può variare a seconda del tipo di PCF, dell'ingresso laser della pompa e del supercontinuum desiderato.
    ATTENZIONE: Durante il taglio del PCF, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) per proteggere gli occhi e la pelle dello sperimentatore. Smaltire immediatamente gli scarti di fibra nel contenitore per lo smaltimento degli oggetti taglienti.
  2. Togliere circa 3 cm di rivestimento in plastica da ciascuna estremità del PCF utilizzando uno sverniciatore di fibre (Tabella dei materiali) o una lama di rasoio e pulire eventuali residui di plastica con carta velina (Tabella dei materiali) e metanolo al 100%.
  3. Posizionare un'estremità del PCF nel supporto su una mannaia di precisione per fibre ottiche (Tabella dei materiali) e allineare la lama a 1,5 cm dall'estremità del PCF. Chiudere con cautela i morsetti e premere il pulsante di taglio .
    NOTA: Seguire attentamente il manuale utente della mannaia per fibre, comprese le linee guida specifiche per la scissione dei PCF. Le impostazioni, come la tensione della fibra, possono richiedere una messa a punto per fendenti coerenti e di alta qualità per ogni tipo di PCF.
  4. Ispezionare la faccia e il lato tagliati del PCF utilizzando il microscopio integrato (ingrandimento 10×) su una stazione di lavoro per la lavorazione della fibra di vetro (Tabella dei materiali), assicurandosi che la fessura sia di buona qualità (Figure 2A, C). Tagliare nuovamente se sono presenti detriti (Figura 2D), graffi (Figura 2E) o se la superficie tagliata non è piana e perpendicolare alla lunghezza del PCF (Figura 2B).
    NOTA: Prestare la massima attenzione in questo passaggio e nei passaggi successivi per evitare di toccare le estremità tagliate del PCF su qualsiasi superficie per evitare di causare danni.
  5. Tagliare la seconda estremità del PCF, assicurandosi della lunghezza finale desiderata.
    NOTA: Il PCF utilizzato in questo protocollo è tagliato a 12 cm.
  6. Come per i passaggi precedenti, ispezionare l'estremità appena tagliata del PCF (fare riferimento al passaggio 1.4). Se il taglio appare difettoso o incoerente, eliminare il PCF corrente e ripetere il processo con uno nuovo.
  7. Clamp l'estremità di ingresso del PCF su un tavolino a 3 assi (Tabella dei materiali) a circa la lunghezza focale della lente di accoppiamento in fibra misurata con un righello. Sostenere saldamente l'altra estremità del PCF con un palo o un supporto temporaneo.
    NOTA: Non clamp ancora l'uscita per evitare di rompere il PCF durante la regolazione grossolana.
    ATTENZIONE: Per ridurre il rischio di esposizione al laser è necessario sostenere l'estremità di uscita e circondarla con blocchi di raggio sufficienti.
  8. Posizionare un misuratore di potenza ottica (Tabella dei materiali) nel percorso del raggio appena prima del PCF per misurare la potenza in ingresso. Assicurarsi che il laser a femtosecondi (Tabella dei materiali) sia bloccato dall'otturatore 1 prima di accendere il laser.
    NOTA: Completare sempre tutti i programmi di formazione sulla sicurezza laser richiesti per comprendere i rischi associati all'uso del laser.
    ATTENZIONE: Quando si utilizza il laser, indossare occhiali di sicurezza laser appropriati specificamente classificati per la lunghezza d'onda e la potenza del laser in uso. Prima di utilizzare il laser, rimuovere tutti i gioielli, gli orologi e altri oggetti riflettenti che possono causare pericolosi riflessi vaganti.
  9. Accendere il laser e lasciarlo riscaldare per il "tempo di riscaldamento a freddo" specificato dal laser. Aprire l'otturatore 1 e regolare la potenza utilizzando la piastra a semionda (HWP1) appena prima del divisore di fascio polarizzatore fino a quando il misuratore di potenza non legge 260 mW o meno.
    NOTA: L'uso di 260 mW per l'allineamento è stato determinato empiricamente come sufficientemente basso da evitare di danneggiare il PCF (anche se disallineato) pur fornendo un raggio luminoso per la visualizzazione su un visualizzatore IR o un bersaglio fluorescente.
  10. Bloccare il laser utilizzando l'otturatore 1 e spostare il misuratore di potenza sull'estremità di uscita del PCF.
  11. Sbloccare il laser e regolare l'asse ottico della faccia di ingresso PCF utilizzando lo stadio a 3 assi fino a quando il segnale non appare sul misuratore di potenza, indicando che una parte della luce è accoppiata nel nucleo, nel rivestimento o nel rivestimento plastico del PCF. Se il posizionamento dell'ingresso PCF al centro del raggio è al di fuori della portata del tavolino a 3 assi, bloccare il laser, quindi regolare e bloccare nuovamente il PCF.
    NOTA: È possibile utilizzare un visualizzatore a infrarossi (IR) o un bersaglio fluorescente per visualizzare il punto in cui viene focalizzato il raggio.
  12. Utilizzando il tavolino a 3 assi, regolare una dimensione dell'asse ottico del PCF per trovare l'intervallo in cui la luce è accoppiata, calcolare il centro di tale intervallo e spostare il tavolino lì. Ripetete l'operazione per la seconda quota in modo da centrare approssimativamente la trave sul nucleo del PCF.
    NOTA: I segni di graduazione μm sul tavolino a 3 assi possono aiutare a misurare le distanze e trovare il centro del PCF.
  13. Regola in modo iterativo le tre dimensioni del tavolino a 3 assi in una sequenza ripetuta, ottimizzando al contempo l'efficienza dell'accoppiamento per centrare e focalizzare con precisione il fascio nel nucleo del PCF.
    NOTA: Se l'efficienza massima dell'accoppiamento, misurata dal misuratore di potenza, è notevolmente inferiore all'80% della potenza in ingresso chiudere l'otturatore 1, sbloccare il PCF e ispezionarlo per verificare che non sia danneggiato. Se danneggiato, ricominciare dal passaggio 1.1, altrimenti bloccare il laser, bloccare nuovamente il PCF e riavviare l'allineamento dal passaggio 1.11.
  14. Bloccare il raggio con l'otturatore 1 e aumentare la potenza del laser a 1,6 W.
    NOTA: L'uso di 1,6 W è stato determinato attraverso la simulazione e i test empirici per generare un supercontinuum sufficientemente ampio, pur rimanendo al di sotto della soglia di danno del PCF.
  15. Aprire l'otturatore 1 e regolare nuovamente in modo iterativo lo stadio a 3 assi per regolare la posizione di ingresso PCF e ottimizzare l'efficienza dell'accoppiamento.
    NOTA: Empiricamente, l'efficienza massima è in genere di circa l'80%.
  16. Chiudere l'otturatore 1 e bloccare l'uscita del PCF approssimativamente alla lunghezza focale dello specchio parabolico. Posizionare un blocco trave all'uscita dello specchio parabolico.
  17. Ridurre nuovamente la potenza del laser a 260 mW o meno.
  18. Aprire l'otturatore 1 e utilizzare il tavolino a 3 assi dello specchio parabolico per allineare l'asse ottico dello specchio parabolico per ridurre al minimo la distorsione del raggio. Quindi, regolare la messa a fuoco e collimare il raggio nel campo lontano.
    NOTA: Utilizzare un visualizzatore IR o un bersaglio fluorescente per visualizzare il raggio di uscita.
  19. Regolare gli specchi dopo lo specchio parabolico per assicurarsi che il raggio sia allineato al resto del sistema ottico.
    NOTA: Installare i target di allineamento a ribaltamento permanenti o le iridi per rendere riproducibile questo passaggio.
  20. Chiudere l'otturatore 1 e aumentare la potenza del laser a 1,6 W. Aprire l'otturatore 1 e verificare che il percorso del raggio sia invariato.
  21. Misurare la potenza di uscita del modellatore di impulsi (Tabella dei materiali) utilizzando un misuratore di potenza. Ruotare la piastra a semionda davanti al modellatore di impulsi (HWP3) per ottimizzare l'efficienza di trasmissione del modellatore di impulsi.

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Figura 2: Estremità tagliate della fibra di cristallo fotonico (PCF). (A, B) Immagini del lato della fenditura. (C-F) Immagini del volto della fenditura. (A) Un PCF ben tagliato ha una faccia piatta e perpendicolare. (B) Un PCF mal tagliato con una faccia angolata e scheggiata. (C) Un PCF ben tagliato con una faccia pulita. (D) Un PCF mal maneggiato che presenta sporcizia sulla superficie. (E) Un PCF mal tagliato con graffi sulla sua superficie. (F) Un vecchio PCF che è stato sostituito. C'è un danno visibile al nucleo del PCF, come si vede dalla macchia scura al centro del PCF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Caratterizzazione e ottimizzazione degli impulsi

  1. Utilizzando uno spettrometro o un analizzatore di spettro ottico (OSA, Table of Materials), misurare il laser dopo lo specchio parabolico per verificare la generazione del supercontinuo del PCF.
  2. Ruotare la piastra a semionda dopo il divisore di fascio polarizzatore (HWP2) per ottimizzare la larghezza del supercontinuum.
  3. Accendere l'autocorrelatore per microscopia (Tabella dei materiali). Utilizzando il software, impostare il rivelatore sul rivelatore interno e impostare l'intervallo di scansione su 5 ps per garantire l'acquisizione dell'intera larghezza dell'autocorrelazione dell'impulso.
    NOTA: Per le configurazioni con larghezze di impulso più lunghe (ad esempio, a causa della dispersione in un PCF lungo), l'intervallo di scansione deve essere aumentato in modo appropriato. Tieni presente che l'ampiezza dell'impulso misurata da un autocorrelatore di intensità non è la vera durata dell'impulso, ma può comunque servire come utile riferimento per la compressione dell'impulso. Per una caratterizzazione accurata e completa sia dell'ampiezza che della fase dell'impulso, è necessario utilizzare tecniche a risoluzione spettrale come il Frequency-Resolved Optical Gating (FROG)48 .
  4. Sbloccare il laser e allineare l'autocorrelatore al raggio in uscita dal pulsatore fino a quando non viene visualizzato un segnale.
    NOTA: Il posizionamento di specchi temporanei (due all'ingresso e due all'uscita dell'autocorrelatore) consentirà l'allineamento del raggio all'autocorrelatore senza influire sul resto del sistema ottico.
  5. Assicurarsi che l'otturatore 2 sia chiuso e applicare il mezzo di immersione appropriato (come acqua o olio) alla lente dell'obiettivo (Tabella dei materiali). Posizionare il rivelatore esterno dell'autocorrelatore sul tavolino del microscopio (Tabella dei materiali) e regolare il tavolino per posizionare il rivelatore direttamente sopra l'obiettivo.
    NOTA: A differenza dei tipici obiettivi per microscopio, gli obiettivi consigliati utilizzati per la microscopia SLAM sono trasmissivi ultravioletti per migliorare la rilevazione di THG38.
  6. Accendere gli specchi del galvanometro a scansione (Tabella dei materiali) per impostare la loro tensione a zero. Aprire l'otturatore e utilizzare un visore IR o un bersaglio fluorescente per verificare che il raggio raggiunga il rilevatore esterno.
  7. Impostare il rilevatore di autocorrelatore in modo che sia il rilevatore esterno. Regolare la posizione del palco fino a quando non viene visualizzato il segnale.
    NOTA: Se il rilevatore si satura, abbassare la potenza utilizzando il filtro a densità neutra.
  8. Regolare i coefficienti polinomiali (ordini di dispersione) del modellatore di impulsi per ridurre al minimo l'ampiezza dell'impulso misurata dall'autocorrelatore. Ridurre l'intervallo di scansione dell'autocorrelatore in modo appropriato al diminuire dell'ampiezza dell'impulso per migliorare la precisione e la visualizzazione della funzione di autocorrelazione.
    NOTA: L'ampiezza ottimale dell'impulso misurata con un adattamento gaussiano dovrebbe essere di alcune decine di femtosecondi (fs).

3. Preparazione del campione

NOTA: Per semplicità, questo protocollo descrive l'imaging tissutale ex vivo . Tuttavia, a causa della natura label-free della SLAM, le procedure di imaging in vivo sono facilmente adattabili38.

  1. Eutanasia dell'animale tramite asfissia da CO2 o altro metodo di eutanasia approvato dall'IACUC.
  2. Prelevare l'organo o gli organi di interesse utilizzando la procedura standard di necroscopia49 entro 10 minuti post-mortem e risciacquare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pre-raffreddata per rimuovere il sangue.
    NOTA: In questo studio, il fegato e i polmoni sono stati prelevati.
  3. Sezionare l'organo verticalmente o orizzontalmente utilizzando una lama, a seconda dell'orientamento richiesto per l'analisi. Assicurarsi che la dissezione venga eseguita con precisione per mantenere l'integrità della struttura del tessuto.
  4. Posizionare il pezzo di tessuto in una piastra sterile per colture tissutali riempita con terreni di coltura cellulare completi privi di rosso fenolo. Refrigerare il fazzoletto a 4 °C se non si raccolgono immediatamente le immagini.
    NOTA: Il terreno di coltura cellulare utilizzato in questo studio era il terreno di eagle modificato (DMEM) di HEPES tamponato di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 4 mM di glutammina e integratori di terreno di crescita delle cellule endoteliali (Tabella dei materiali). Questo terreno è stato scelto con cura per mantenere la vitalità fisiologica delle cellule epiteliali ed endoteliali che risiedono nel campione di tessuto renale durante la durata dell'imaging50.
  5. Per preparare gli standard di calibrazione della fluorescenza, azzerare una bilancia di precisione al peso di un recipiente di pesatura antistatica e misurare circa 5 mg di sale disodico di flavina adenina dinucleotide (FAD, Tabella dei materiali) o 5 mg di sale disodico di nicotinammide adenina dinucleotide ridotto (NADH, Tabella dei materiali).
  6. Utilizzare una pipetta monocanale per erogare un volume appropriato di tampone HEPES da 1 M nelle imbarcazioni di pesatura contenenti polveri FAD o NADH pre-pesate per preparare soluzioni stock da 5 mM. Pipettare ripetutamente su e giù per sciogliere la polvere.
  7. Preparare 1 mM di soluzioni di lavoro dalle soluzioni madre mediante diluizione 1:5 nel tampone HEPES.
    NOTA: La concentrazione di lavoro di 1 mM utilizzata in questo studio è stata determinata empiricamente per produrre un segnale elevato evitando la saturazione del rivelatore.
  8. Conservare le soluzioni madre di FAD e NADH in provette per microcentrifuga a 4 °C.
    NOTA: Gli standard di soluzione possono essere conservati in frigorifero per diversi giorni, ma si consiglia di preparare soluzioni fresche per ogni esperimento.
  9. Poco prima di raccogliere le immagini al microscopio SLAM, posizionare i campioni di tessuto in piastre di imaging con fondo in vetro da 35 mm (Tabella dei materiali). In alternativa, utilizzare un vetrino coprioggetti. Aliquotare le soluzioni FAD e NADH in piatti o vetrini coprioggetti identici.
    NOTA: Si consiglia vivamente di rivestire il vetro non rivestito o il vetro rivestito in poli-D-lisina a causa della riduzione del segnale di fondo. Assicurarsi che lo spessore del vetro sia appropriato per l'obiettivo del microscopio utilizzato (questo studio ha utilizzato #0).

4. Configurazione e funzionamento dello SLAM

  1. Verificare che l'ingresso laser al PCF sia bloccato dall'otturatore 1 e accendere il laser. Lasciare che il laser si riscaldi per il "tempo di riscaldamento a freddo" specificato del laser.
    NOTA: In questo studio viene utilizzato un tempo di riscaldamento a freddo di 30 minuti per il laser.
  2. Verificare che il percorso del raggio sia libero da ostruzioni e posizionare un misuratore di potenza ottica nel percorso del raggio appena prima del PCF. Aprire l'otturatore 1 e misurare la potenza in ingresso.
  3. Chiudere l'otturatore 1 e spostare il misuratore di potenza sull'uscita del PCF dopo lo specchio parabolico. Aprire l'otturatore 1 e massimizzare l'uscita PCF utilizzando lo stadio a 3 assi in ingresso.
  4. Lasciare che il PCF si riscaldi per 10 minuti, quindi massimizzare nuovamente la potenza di uscita. Registrare la trasmissione del PCF. Se la trasmissione scende al di sotto del 50%, sostituire il PCF.
    NOTA: Durante il funzionamento del microscopio SLAM (nei passaggi seguenti), si consiglia di misurare la potenza di uscita del PCF ogni ora per garantire dati coerenti.
  5. Spostare il misuratore di potenza dopo il filtro a densità neutra (ND) e ruotare il filtro per controllare la potenza del laser che raggiunge il campione.
    NOTA: Moltiplicare la potenza misurata per la trasmittanza dei componenti ottici rimanenti. La trasmittanza viene misurata posizionando il misuratore di potenza dopo la lente dell'obiettivo. Per questo studio, è stata utilizzata una potenza laser media di 20 mW sul campione. La potenza del laser è stata determinata empiricamente per il campione dato, la profondità di imaging e il sistema del microscopio per generare immagini di alta qualità evitando danni al campione o non linearità del rivelatore. Sebbene non esista uno standard definitivo, l'imaging multifotonico tipico senza etichetta è limitato a diverse decine o centinaia di milliwatt 7,32,33,51,52.
  6. Accendi i galvanometri e il palco. Aprire il software di acquisizione e inserire i parametri desiderati per l'imaging.
    NOTA: Questo studio ha utilizzato 512 × 512 pixel e un tempo di permanenza dei pixel di 13,65 μs per visualizzare un campo visivo di 360 × 360 μm2 . Cinque fotogrammi acquisiti a 0,333 Hz sono stati calcolati in media in un singolo fotogramma di alta qualità.
  7. Posizionare il campione sul tavolino utilizzando il mezzo di immersione appropriato per l'obiettivo, come è stato utilizzato in precedenza nel passaggio 2.5.
  8. Spegni le luci della stanza e chiudi le tende.
    NOTA: Per evitare di danneggiare i rilevatori, non accendere mai le luci della stanza mentre i rilevatori sono accesi o le persiane del rilevatore sono aperte.
  9. Accendere gli alimentatori del rivelatore e gli amplificatori.
  10. Chiudi la scatola luminosa che circonda il palco.
  11. Utilizzare gli interruttori di controllo elettronici per aprire manualmente le tapparelle del rilevatore (S3, S4, S5, S6).
  12. Nel software di acquisizione del microscopio, fare clic su Fare clic per avviare l'acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini SLAM. Regolare la messa a fuoco del microscopio ruotando la manopola sul controller del tavolino del microscopio (Tabella dei materiali) fino a quando il campione non viene messo a fuoco.
    NOTA: Il vetrino coprioggetti genera un forte segnale THG, che può essere utilizzato per determinare con precisione la profondità dell'imaging utilizzando la posizione del tavolino visualizzata sul controller del tavolino del microscopio. Ad esempio, tutte le immagini degli standard di soluzione scattate in questo studio sono state scattate su un piano focale di 20 μm sopra il vetrino coprioggetti.
  13. Utilizzare il joystick sul controller del tavolino del microscopio per individuare il campo visivo desiderato nel campione, quindi fare clic su Stop and Reset (Interrompi e ripristina).
    NOTA: Se l'immagine si satura, tornare al passaggio 4.5 e ridurre la potenza. Se l'immagine ha un rapporto segnale/rumore inferiore a 10, la potenza può essere aumentata con cautela.
  14. Nella scheda Salvataggio , fare clic su Salva dati per impostare Sì, quindi fare clic su Fare clic per avviare l'acquisizione. Attendi il completamento dell'acquisizione prima di continuare.
  15. Per modificare o manipolare il campione durante l'imaging, chiudere gli otturatori del rivelatore e utilizzare una torcia o una lampada frontale per la luce. Una volta modificato l'esempio, tornare al passaggio 4.10.
    NOTA: per consentire la ripetibilità e l'analisi quantitativa, raccogliere immagini SLAM degli standard delle soluzioni FAD e NADH. Assicurarsi che il campo visivo, le dimensioni dell'immagine e la potenza di eccitazione siano coerenti con ciò che è stato utilizzato per i campioni biologici.
  16. Per terminare l'acquisizione dell'immagine SLAM, chiudere gli otturatori del rilevatore e spegnere i rilevatori prima di accendere le luci della stanza.
  17. Bloccare il laser utilizzando l'otturatore 1, quindi spegnere il laser.
  18. Spegnere i galvanometri e il tavolino. Chiudere il software di acquisizione del microscopio.
  19. Smaltire il fazzoletto in modo appropriato e pulire il luogo di lavoro.

5. Visualizzazione dei dati

NOTA: La seguente analisi delle immagini può verificarsi in un software di analisi delle immagini come ImageJ53 (Table of Materials) o in un linguaggio di programmazione con funzionalità di analisi delle immagini, come Python o MATLAB. La procedura seguente descrive come eseguire la visualizzazione dei dati utilizzando ImageJ.

  1. Assicurati che le immagini di ciascun canale siano in un formato immagine senza perdita di dati (ad esempio, TIFF o PNG).
    NOTA: Il software di controllo del microscopio personalizzato utilizzato in questo studio salva automaticamente le immagini come TIFF. Per salvare un'immagine come TIFF, aprirla in ImageJ e selezionare File > Salva come > TIFF.
  2. Per generare immagini standard di illuminazione, aprire le immagini dei canali FAD e NAD(P)H delle soluzioni FAD e NADH, rispettivamente, in ImageJ. Per ogni immagine, selezionare Elabora > filtri > Sfocatura gaussiana..., impostare Sigma (Raggio) su 41, quindi fare clic su OK.
    NOTA: Regolare il Sigma (Raggio) del filtro gaussiano secondo necessità per uniformare sufficientemente l'immagine.
  3. Per correggere contemporaneamente l'illuminazione irregolare e normalizzare l'intensità della fluorescenza, aprire le immagini dei canali FAD e NAD(P)H del campione. Per ogni immagine, selezionare Elabora > Calcolatore immagini..., per Immagine1 selezionare l'immagine campione, per Operazione selezionare Dividi e per Immagine2 selezionare l'immagine standard di illuminazione che corrisponde al canale dell'immagine campione, quindi fare clic su OK.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per correggere la variabilità del sistema e mantenere la coerenza nelle valutazioni quantitative dell'autofluorescenza, come il rapporto redox ottico (ORR).
  4. Se vengono scattate più immagini per formare un campo visivo più ampio o in una pila a z, unire o combinare le immagini in un'unica immagine o in una pila di immagini.
  5. Per generare un'immagine ORR, sommare prima le immagini FAD e NAD(P)H. Selezionare Elabora > Calcolatore immagini..., per Immagine1 e Immagine2, selezionare rispettivamente le immagini dei canali FAD e NAD(P)H, per Operazione selezionare Aggiungi, quindi fare clic su OK. Per calcolare l'immagine ORR, selezionare Elabora > calcolatore di immagini..., per Immagine1 selezionare l'immagine del canale FAD, per Operazione selezionare Dividi e per Immagine2 selezionare il risultato della somma di FAD e NAD(P)H, quindi fare clic su OK.
  6. Per applicare una mappa dei colori all'immagine ORR, selezionare Immagine > Colore > Modifica LUT..., fare clic su Apri, selezionare il file della tabella di ricerca (.lut) desiderato e fare clic su OK. Selezionare Immagine > Regolare > Luminosità/Contrasto e regolare il contrasto come desiderato.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare una mappa dei colori isoluminante come la mappa dei colori CET-I254,55 (invertita) utilizzata in questo studio. Per invertire una mappa dei colori in ImageJ dopo averla applicata a un'immagine, selezionare Colore > immagine > Inverti LUT .
  7. Per migliorare la nitidezza delle caratteristiche nell'immagine ORR, ridimensionare la luminosità in base all'intensità dei canali di fluorescenza. Innanzitutto, seleziona il risultato della somma di FAD e NAD(P)H e seleziona Elabora > migliora contrasto..., assicurati che Normalizza sia selezionato, quindi fai clic su OK. Seleziona Modifica > copia per copiare questo risultato negli appunti. Quindi, seleziona l'immagine ORR e seleziona Tipo di immagine > > Colore RGB", quindi seleziona Tipo di immagine > > HSB (32 bit). Sposta il cursore nella parte inferiore dell'immagine completamente a destra per visualizzare il canale Luminosità , seleziona Modifica > Incolla, quindi seleziona Tipo di immagine > > Colore RGB.
  8. Per visualizzare l'immagine SLAM come una composizione, aprire i quattro canali SLAM in ImageJ e selezionare: Immagine > Colore > Unisci canali... Per C2 (verde), selezionare l'immagine del canale SHG, per C5 (ciano) selezionare l'immagine del canale NAD(P)H, per C6 (magenta) selezionare l'immagine del canale THG e per C7 (giallo) selezionare l'immagine del canale FAD. Assicurati che l'opzione Crea composito sia selezionata e fai clic su OK.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il complesso approccio multicanale e multimodale del microscopio SLAM (Figura 1) può rendere difficile per i nuovi utenti risolvere i problemi e comprendere i risultati. Innanzitutto, un PCF ben tagliato presenta una faccia pulita (Figura 2C) con una superficie piana perpendicolare alla lunghezza del PCF (Figura 2A). Una faccia di fendente angolata e scheggiata (Figura 2B) e la presenza di graffi (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La generazione di un supercontinuum adeguato è fondamentale per il successo dell'imaging SLAM, ma può essere difficile a causa della complessità dell'impostazione del PCF. Garantire un taglio preciso e un'attenta manipolazione del PCF è essenziale per mantenere le superfici pulite prive di detriti, sporco o graffi, che possono interferire con l'accoppiamento efficace, la generazione del supercontinuum e persino ridurre la durata del PCF. Poiché il PCF richiede una sostituzione regolare, ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

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Il finanziamento per le apparecchiature utilizzate in questo studio è stato fornito in parte da GSK attraverso il Center for Optical Molecular Imaging presso il Beckman Institute for Advanced Science and Technology. Questo lavoro è stato anche supportato in parte dal NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) e dal NSF Science and Technology Center for Quantitative Cell Biology. K.K.D.T è stato supportato dal NIEHS Research Training Program in Toxicology and Environmental Health (5T32ES007326-25), A.D.C è stato supportato dal Beckman Institute for Advanced Science and Technology Postdoctoral Fellows program e A.H. è stato supportato dal NIBIB Tissue Microenvironment Training Program (T32EB019944). Gli autori ringraziano Darold Spillman per la sua gestione degli spazi di laboratorio, delle attrezzature e della tecnologia e ringraziano i dottori Janet E. Sorrells e Rishyashring R. Iyer per i loro contributi passati al sistema di microscopio SLAM utilizzato in questo studio.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tavolino a 3 assiThorLabsMAX316Interrotto.
Piatto di imaging con fondo in vetro da 35 mmMatTekP35G-0-14-CVetro di copertura #0 non rivestito.
DMEMGibco21063029Glucosio alto, HEPES, senza rosso fenolo.
Integratori di terreno di crescita delle cellule endotelialiPromoCellC-39210Omettere il siero fetale di vitello.
Laser a femtosecondi FemtoTrainSpettri-Fisica1040-5Potenza media: >5,0 W, Energia dell'impulso: >500 nJ, Lunghezza d'onda: 1040 nm ± 8 nm, frequenza di ripetizione: 10 MHz, larghezza dell'impulso (FWHM): < 220 ss.
Siero fetale bovinoCitivaSH30071.03HyClone caratterizzato.
Stripper per fibreThorLabsT10S13
Flavina adenina dinucleotide sale disodico idratoSigma-AldrichF6625
Specchi galvanometriciTecnologia Cambridge6215HInterrotto.
Postazione di lavoro per la lavorazione del vetroVytranGPX3800
ImmagineJLaboratorio Eliceiri presso l'Università del Wisconsin MadisonVersione 2.16.0Distribuzione FIJI.
Carta velina KimwipeKimberly-Clark Professionista34120
L-GlutamminaCitivaSH30034.01
Tavolino per microscopioStrumentazione Scientifica ApplicataFTP-2050
Controllore di tavolino per microscopioStrumentazione Scientifica ApplicataMS-2000-500-UDSW
Autocorrelatore per microscopiaAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
ObiettivoOlimpoXLPLN25XWMP2Immersione in acqua, ingrandimento 25X, 1,05 NA.
Misuratore di potenza otticaNewport919P-003-10600 - 1700 nm.
Analizzatore di spettro otticoThorLabsOSA202C
Fibra di cristallo fotonicoFotonica NKTLMA-PM-15 NKTAmpia area modale, mantenimento della polarizzazione. Diametro del nucleo: 15 µm.
Mannaia di precisione per fibre otticheFujikuraCT-101
Modellatore di impulsiSoluzioni Biofotoniche Inc.FemtoJock-DInterrotto.
β-nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto idratoSigma-Aldrich10128023001

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