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Articolo metodologico

Generazione di mutanti materni utilizzando zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

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DOI:

10.3791/68642

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22 luglio 2025

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1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di mutanti materni che accoppia una linea di knock-in stabile zpc:cas9 con la consegna mediata da Tol2 di cassette di espressione di sgRNA.

Abstract

L'ovogenesi e lo sviluppo embrionale precoce dipendono in modo critico dagli mRNA e dalle proteine di origine materna. L'eliminazione di questi fattori materni richiede mutazioni omozigoti nelle femmine di zebrafish, che spesso si traducono in fenotipi letali o sterili, che impediscono l'acquisizione di embrioni mutanti materni. Il nostro lavoro precedente ha introdotto un approccio rapido per bypassare la letalità zigotica attraverso l'editing del genoma specifico dell'ovocita. Tuttavia, il transgene cas9 precedentemente riportato mostra instabilità e subisce un graduale silenziamento nel corso delle generazioni successive. Inoltre, la presenza di elementi trasponibili Tol2 che fiancheggiano la cassetta zpc:cas9 in questa linea ostacola il potenziale per un'ulteriore transgenesi di sgRNA utilizzando il sistema Tol2, che è attualmente il sistema transgenico più efficiente nel pesce zebra. Di conseguenza, c'è un bisogno critico di una linea di zebrafish priva di Tol2 che garantisca un'espressione stabile e robusta di Cas9 specifica per ovociti. Qui, presentiamo una linea con zpccas9 knock-in al locus rbm24a che soddisfa questo requisito. Utilizzando questo strumento potenziato, forniamo una pipeline per la rapida generazione di mutanti materni di geni con fenotipi mutanti zigoticamente letali all'interno del modello zebrafish.

Introduzione

Lo sviluppo embrionale precoce dei vertebrati si basa in larga misura sull'RNA e sulle proteine immagazzinate all'interno dell'uovo, collettivamente indicati come fattori materni. Questi prodotti materni sono prevalentemente sintetizzati durante lo stadio diplotenico della meiosi I 1,2,3. Per studiare i loro ruoli funzionali, è essenziale generare individui di sesso femminile mutanti omozigoti, poiché solo la mutazione omozigote negli ovociti può esaurire completamente questi fattori materni. Tuttavia, ottenere tali femmine mutanti omozigoti diventa difficile quando le mutazioni omozigoti zigoti provocano letalità o sterilità 4,5. Ciò rappresenta un ostacolo significativo per chiarire le funzioni dei prodotti materni codificati da geni zigotici, letali o sterili. Per superare questo limite tecnico, sono stati sviluppati diversi approcci innovativi 6,7,8. Tuttavia, queste tecniche spesso soffrono di tempi sperimentali prolungati o di sfide tecniche sostanziali.

Nel nostro lavoro precedente, abbiamo anche sviluppato una strategia di knockout condizionale che consente la generazione di mutanti materni all'interno di una singola generazione 9,10. Il sistema comprende due componenti chiave: il pesce zebra transgenico Tg(zpczcas9) e un sistema plasmidico transgenico I-SceI che ospita 3-4 cassette di espressione di sgRNA. Sfruttando questo sistema, abbiamo ottenuto con successo il knockout condizionale dei fattori materni negli ovociti 9,10, ma c'è ancora spazio per miglioramenti. In primo luogo, l'efficienza dell'editing genomico della linea transgenica Tg(zpczcas9) precedentemente riportata non era stabile nel mantenere l'espressione transgenica di Cas9. Inoltre, poiché questa linea transgenica è stata generata utilizzando il sistema di trasposoni Tol2, la trasposizione di Tol2 non può essere ulteriormente utilizzata per l'integrazione della cassetta di espressione dell'sgRNA; invece, è richiesta una transgenesi mediata da I-SceI. Tuttavia, questo approccio è meno efficiente di Tol2 ed è anche più suscettibile al silenziamento transgenerazionale.

Per superare queste limitazioni, abbiamo cercato di stabilire una linea di knock-in che consentisse un'espressione robusta e stabile di Cas9 specifica per l'ovocita. Questa linea consente l'uso del sistema di trasposone Tol2 per la veicolazione altamente efficiente di plasmidi di espressione di sgRNA in zebrafish. Utilizzando una strategia di editing genomico11 basata su introni, abbiamo generato con successo una linea knock-in zpccas9 con il sito integrato nell'ultimo introne del gene rbm24a (Figura 1A, B). Abbiamo scelto questo locus come candidato porto sicuro genomico per l'espressione del transgene materno sulla base di due osservazioni indipendenti. 1) Integrazione innocua: nel nostro recente studio12, i pesci knock-in omozigoti che trasportano DNA esogeno in questo sito sono rimasti completamente vitali e fertili. 2) Espressione robusta: quando una cassetta zpccas9 è stata inserita nello stesso locus, Cas9 è stato espresso ad alti livelli, producendo efficienze di editing del genoma costantemente forti tra le generazioni (Figura 1C). Come componente principale del plasma germinale, la proteina legante l'RNA Rbm24a collabora con Buc per incorporare gli RNA del plasma germinale nei granuli germinali. Di conseguenza, il deficit materno di Rbm24a porta a una completa assenza di cellule germinali primordiali (PGCs)12. Qui, prendendo di mira rbm24a come esempio nel nostro recente lavoro, forniamo un protocollo video migliorato per la generazione e la caratterizzazione di mutanti materni per geni letali zigotici.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE e sono stati approvati eticamente dal Comitato Istituzionale per la Cura degli Animali dell'Università di Shandong (Approvazione n. SYDWLL-2021-15). La panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 2.

1. Generazione della linea knock-in rbm24a-RFP zpc:cas9

  1. Screening dell'sgRNA per knock-in
    1. Selezionare e sintetizzare candidati sgRNA knock-in
      1. Inviare la sequenza dell'ultimo introne di rbm24a a CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) per identificare i candidati sgRNA ottimali che presentano sia punteggi CRISPRscan elevati (indicativi dell'efficienza on-target) che punteggi CFD bassi (che riflettono effetti off-target). Sintetizzare l'oligo lungo per ogni sgRNA (sgRNA oligo).
        NOTA: CRISPRscan genera oligo di sgRNA contenenti elementi funzionali essenziali, tra cui la sequenza del promotore T7, la sequenza bersaglio dell'sgRNA a 20 nucleotidi e una sequenza di scaffold sgRNA a 16 nucleotidi. Qui, abbiamo selezionato un sgRNA con la seguente sequenza: 5'-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (promotore T7 minuscolo, 20-nt guida maiuscola, scaffold parziale minuscolo).
      2. Per ottenere il DNA stampo per la sintesi dell'sgRNA, preparare 50 μL di reazione Fill-in PCR: 2x Taq Master mix 25 μL; primer sgRNA (10 μM) 2 μL; Primer universale (10 μM) 2 μL; Deionizzato H2O 21 μL.
        NOTA: Le sequenze di tutti i primer sono riportate nella Tabella dei Materiali.
      3. Miscelare accuratamente e trasferire la miscela di reazione in un termociclatore preprogrammato e avviare il protocollo di amplificazione utilizzando i parametri di ciclo come segue: 1 ciclo a 94 °C per 3 min, 35 cicli (94 °C per 15 s, 50 °C per 15 s, 72 °C per 30 s) e 1 ciclo a 72 °C per 5 min.
      4. Preparare la miscela di reazione per la sintesi dell'sgRNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL; combinare tutti i componenti a temperatura ambiente nel seguente ordine: 11 μL di acqua distillata, 2 μL di ATP/GTP/CTP/UTP (10 mM ciascuno), 10 μL di prodotto PCR, 4 μL di tampone di reazione RNA polimerasi 10x, 2 μL di RNA polimerasi T7 e 1 μL di inibitore della RNasi. Il volume totale di reazione è di 40 μl. Mescolare accuratamente con un fruscio ed eseguire una breve centrifugazione.
      5. Incubare a 37 °C per 1,5 h. Aggiungere 1 μl di DNasi I, mescolare con un fruscio e centrifugare brevemente. Incubare a 37 °C per 15 minuti per garantire la completa rimozione del modello di DNA.
      6. Aggiungere 5 μL di microsfere magnetiche di silice, seguite da 120 μL (4x volume) di tampone legante l'RNA (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05%, etanolo 100 mL). Miscelare accuratamente mediante pipettaggio. Incubare su un termomixer a 1.500 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente.
      7. Posizionare la provetta su un supporto magnetico e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta o un sistema a vuoto.
      8. Aggiungere 400 μl di etanolo al 90% e vorticare per risospendere le perle. Posizionare il tubo sul supporto magnetico ed eliminare il surnatante.
      9. Ripetere le fasi di lavaggio con etanolo per completare un totale di due cicli di lavaggio.
      10. Rimuovere il surnatante residuo e asciugare all'aria il tubo aperto su un blocco riscaldante a 50 °C per 10 minuti.
      11. Aggiungere 15 μL di acqua priva di nucleasi e incubare su un termomiscelatore a 1.500 giri/min per 5 minuti a temperatura ambiente.
      12. Posizionare la provetta sul supporto magnetico e trasferire l'eluato in una nuova provetta da microcentrifuga.
      13. Confermare la banda dell'sgRNA a 98 bp mediante elettroforesi dell'agarosio. Quantificare la concentrazione di RNA mediante microspettrofotometro ed elettroforesi dell'agarosio, etichettare in modo chiaro e conservare a -20 °C.
    2. Testare l'efficienza dell'sgRNA
      1. Per determinare l'effettiva efficienza degli sgRNA, preparare il complesso ribonucleoproteico (RNP) per la microiniezione. Miscelare 1 μL di ciascun sgRNA (50 ng/μL di concentrazione finale) con 1 μL di proteina Cas9 (100 ng/μL di concentrazione finale) su ghiaccio mediante pipettaggio. Fornire 2 nL del complesso RNP in ciascun embrione allo stadio di una cellula mediante microiniezione.
      2. A 24 ore dalla fecondazione (hpf), raccogliere 10 embrioni per ogni RNP Cas9 iniettato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e rimuovere con cura il terreno in eccesso. Aggiungere 100 μl di NaOH 50 mM (10 μl per embrione) e incubare a 95 °C per 15 minuti utilizzando un blocco riscaldante o un termociclatore. Neutralizzare il lisato aggiungendo 10 μl di Tris-HCl 1 M (pH 7,0).
      3. Utilizzare direttamente il lisato embrionale neutralizzato come modello per l'amplificazione della PCR. Primer di progettazione per amplificare un frammento contenente il sito target con sequenze di fiancheggiamento di ≥100 bp su entrambi i lati. Verificare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e purificare utilizzando l'estrazione con gel quando necessario. Eseguire il sequenziamento Sanger dei prodotti amplificati.
      4. Quantificazione dell'efficienza dell'editing CRISPR: analisi dei cromatogrammi di sequenziamento utilizzando lo strumento di analisi ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Normalizzare l'efficienza dell'editing rispetto ai campioni di controllo non iniettati seguendo i protocolli consigliati dal sito web.
  2. Costruzione di un plasmide donatore per knock-in
    1. Utilizzare la metodologia TEDA (T5 exonuclease DNA assembly) per eseguire la reazione di ligazione13.
    2. Impiegare una strategia di assemblaggio Gibson a tre frammenti per la costruzione del plasmide donatore knock-in rbm24a-RFP KIzpc:cas9 . Il primo frammento include un braccio di omologia da 1.704 bp 5' che comprende la regione genomica immediatamente a monte del codone di stop rbm24a . La seconda è la sequenza di codifica GFP. Il terzo contiene un braccio di omologia da 2.274 bp 3' a valle del codone di stop rbm24a , seguito dalla cassetta di espressione zpccas9 posizionata nella direzione 3' distale rispetto al rbm24a 3'-UTR.
    3. Assemblare i tre frammenti nel sito ApaI del vettore pBluescript SK- utilizzando l'assembly di Gibson.
    4. Verificare il plasmide finale attraverso la digestione di restrizione e il sequenziamento di Sanger.
  3. Microiniezione e selezione di embrioni con integrazione precoce
    1. Preparare la miscela per iniezione contenente 12 pg di plasmide donatore knock-in rbm24a-RFP KIzpc:cas9 , 200 pg di sgRNA e 600 ng di proteina Cas9 ricombinante in acqua priva di nucleasi. Erogare 1-2 nL della miscela nel blastodisco di embrioni in stadio unicellulare utilizzando tecniche di microiniezione standard. A 30 hpf, esaminare gli embrioni per i modelli di espressione RFP che imitano l'espressione endogena di rbm24a, che indica l'integrazione del plasmide del donatore già nella fase di scissione. Selezionare questi embrioni con integrazione precoce per la riproduzione, che ha mostrato un segnale RFP nel cristallino, nel cuore, nel muscolo scheletrico e nelle cellule ciliate dell'orecchio interno (Figura 3A, B).
      NOTA: Purificare il plasmide mediante estrazione fenolo-cloroformio prima dell'iniezione per eliminare eventuali RNasi residue introdotte durante la preparazione del plasmide.
    2. Analizzare i pattern di espressione di Rbm24a-RFP materna in embrioni di generazione F1 derivati da incross rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (Figura 4A, B).
  4. Valutazione dell'espressione della proteina Cas9 e dell'efficienza dell'editing
    1. Per valutare l'efficienza dell'editing di Cas9, microiniettare 200 pg di sgRNA bmp2b in embrioni rbm24a-RFP KIzpc:cas9 a 1 cellula (Figura 1C, D).
    2. Per valutare la stabilità dell'editing Cas9, quantificare il numero di embrioni che presentano fenotipi di dorsalizzazione ed eseguire l'analisi di sequenziamento Sanger per valutare l'efficienza dell'editing (Figura 5A-D).
      NOTA: Sebbene non sia stata rilevata alcuna riduzione dell'espressione di Cas9 nell'arco di tre generazioni, si consiglia comunque di verificare l'efficienza di editing in ogni generazione di questa linea knock-in.

2. Transgenesi di sgRNA nella linea rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. Selezionare e sintetizzare sgRNA per il knockout di rbm24a .
    1. Selezionare e sintetizzare i candidati sgRNA come descritto nel passaggio 1.1.1.
      NOTA: È fondamentale selezionare sgRNA che hanno come bersaglio la metà anteriore della regione codificante per garantire una perdita di funzione altamente efficiente. Inoltre, se vengono identificati domini proteici critici nella regione C-terminale, sono accettabili anche sgRNA che hanno come bersaglio l'estremità 3' della sequenza codificante. CRISPRscan genera oligo di sgRNA contenenti elementi funzionali essenziali, tra cui la sequenza del promotore T7, la sequenza bersaglio di sgRNA a 20 nucleotidi e una sequenza di scaffold di sgRNA a 16 nucleotidi. Per ottenere un efficace knockout genico materno, è consigliabile progettare 6-8 candidati per identificare in modo affidabile 3-4 sgRNA altamente efficienti. Un protocollo dettagliato può essere trovato in un precedente articolo9.
    2. Testare l'efficienza dell'sgRNA nell'embrione precoce di zebrafish come descritto nel passaggio 1.1.2.
      NOTA: sono preferiti gli sgRNA con un'efficienza di editing superiore al 50%.
  2. Costruzione di plasmidi transgenici che esprimono sgRNA
    NOTA: Per massimizzare l'efficienza dell'editing, si consiglia di utilizzare quattro sgRNA distinti e non sovrapposti, ciascuno separato da almeno 36 bp. Questi sgRNA sono legati individualmente in vettori pU6x:sgRNA (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4), ognuno dei quali ospita un promotore U6 unico insieme allo scaffold 3'14. Successivamente, questi quattro vettori U6, ciascuno contenente una cassetta di espressione di sgRNA, vengono assemblati nel vettore di destinazione pGGDestISceIEB-4sgRNA tramite legatura Golden Gate.
    I vettori pU6x:sgRNA devono essere selezionati in sequenza. Ad esempio, se si clonano tre sgRNA, utilizzare i vettori da #1 a #3; se si clonano quattro sgRNA, utilizzare i vettori da #1 a #4.
    1. Subclonaggio della sequenza bersaglio dell'sgRNA in vettori pU6x:sgRNA
      1. In base alla sequenza dell'sgRNA selezionato, sintetizzare i primer di ricottura: Primer diretto: TTCGN(19); Innesco inverso: AAAC[N(19)]*. Dove GN(19) è la sequenza bersaglio di 20 nt di sgRNA. [N(19)]* rappresenta la sequenza inversa del complemento del 19 nt del bersaglio dell'sgRNA nella direzione 3'.
      2. Per ricuocere i primer, preparare la miscela come segue: 1 μL di primer diretto (100 μM), 1 μL di primer inverso (100 μM), 2 μL di tampone 10x e 16 μL di H2O deionizzato per raggiungere un volume totale di 20 μL. Mescolare accuratamente.
        NOTA: Le sequenze di tutti gli inneschi sono state mostrate nella Tabella dei Materiali.
      3. Mettere la miscela in un termociclatore ed eseguire il programma come segue: 1 ciclo a 95 °C per 15 minuti, quindi raffreddare gradualmente a 50 °C a una velocità di rampa controllata di 0,1 °C/s e mantenere questa temperatura per 10 minuti; mantenere la temperatura a 4 °C per 10 min.
      4. Preparare la miscela di reazione per clonare la sequenza bersaglio dell'sgRNA ricotto in vettori pU6x-sgRNA come descritto: 1 μL di tampone enzimatico di restrizione 10x, 1 μL di tampone ligasi T4 10x, 0,3 μL di Ligasi T4, 0,3 μL di BsmBI, 0,2 μL di PstI, 0,2 μL di SalI, 1 μL di primer sgRNA ricotto, 5 μL di pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) e 1 μL di H2O deionizzato, regolando il volume finale della reazione a 10 μL.
      5. Miscelare accuratamente i componenti di reazione ed eseguire il seguente programma di termociclatore: 6 cicli (37 °C per 20 min, 16 °C per 15 min), 1 ciclo a 37 °C per 10 min, 1 ciclo a 55 °C per 15 min, 1 ciclo a 80 °C per 15 min.
      6. Per la trasformazione, scongelare le cellule competenti DH5α su ghiaccio, mescolare delicatamente 50 μL di cellule con la miscela di legatura muovendo la provetta e incubare la miscela su ghiaccio per 30 minuti. Eseguire uno shock termico a 42 °C per 60 s, quindi trasferire immediatamente il tubo di nuovo nel ghiaccio per 2 minuti. Distribuire le cellule trasformate su una piastra LB contenente 100 μg/mL di spectinomicina e incubare la piastra capovolta a 37 °C per almeno 16 ore per consentire la formazione di colonie.
      7. Per la PCR delle colonie, prelevare ciascuna colonia batterica con una punta per pipetta e trasferirla in 10 μL di H2O deionizzato. Risospendere accuratamente la colonia pipettandola su e giù per garantire una dispersione completa per l'analisi PCR a valle. Preparare la miscela di reazione PCR combinando 5 μL di 2x Taq Mix, 2 μL di liquido di colonia, 0,4 μL di primer diretto M13 (10 μM) e primer inverso (10 μM) e 2,2 μL di H2O deionizzato, ottenendo un volume di reazione totale di 10 μL.
      8. Eseguire il programma come mostrato di seguito: 1 ciclo a 94 °C per 3 min, 23 cicli (94 °C per 15 s, 55 °C per 15 s, 72 °C per 30 s) e 1 ciclo a 72 °C per 5 min.
      9. Sottoporre i prodotti PCR a elettroforesi. Selezionare la colonia positiva con la dimensione prevista di 482 bp (Figura 6).
      10. Inoculare il liquido di colonia rimanente in 3 mL di terreno LB integrato con 100 μg/mL di spectinomicina. Incubare a 37 °C agitando a 200 giri/min per 14 ore.
      11. Estrarre i plasmidi dalla coltura batterica utilizzando il Plasmid Miniprep Kit secondo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione di plasmidi utilizzando un microspettrofotometro.
      12. Sottoporre i plasmidi estratti al sequenziamento Sanger utilizzando il primer diretto M13. Allineare i risultati del sequenziamento con la mappa vettoriale U6 prevista per verificare il corretto inserimento del target sgRNA.
    2. Assemblaggio del vettore pGGDestEB-4sgRNA
      NOTA: Come illustrato nella Figura 7, quattro cassette di espressione di sgRNA guidate da U6 possono essere efficacemente legate nel vettore della spina dorsale pGGDestEB-4sgRNA utilizzando l'assemblaggio Golden Gate. Il numero di sgRNA da legare determina l'uso dei vettori. Ad esempio, quando si assemblano quattro cassette di sgRNA, utilizzare pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 e pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Preparare i 20 μL di miscela di reazione Golden Gate contenenti: 2 μL di tampone enzimatico di restrizione 10×, 2 μL di tampone DNA ligasi 10x T4, 100 ng di ciascun costrutto pU6x:sgRNA#x, 50 ng di vettore di destinazione pGGDestIEB-4sgRNA, 1 μL di BsaI, 1 μL di DNA ligasi T4 e acqua deionizzata per regolare il volume finale a 20 μL.
      2. Eseguire la reazione di assemblaggio Golden Gate attraverso 3 cicli di 20 minuti a 37 °C, seguiti da 15 minuti a 16 °C, quindi completare con un'incubazione finale di 15 minuti a 80 °C per l'inattivazione enzimatica.
      3. Per la trasformazione, trasferire 5 μl della miscela di reazione in cellule competenti e piastra su terreno LB integrato con ampicillina.
      4. Eseguire la PCR delle colonie mediante screening delle colonie utilizzando i primer Dest forward e Reverse (vedere la Tabella dei materiali) per confermare la presenza dell'inserto (Figura 8).
        NOTA: La banda principale di 2.415 bp e un modello laddering dovrebbero essere presenti per un clone positivo.
      5. Estrarre i plasmidi dalle colonie positive e sequenziarli utilizzando i primer Dest forward e Reverse per ogni bersaglio di sgRNA.
      6. Allineare i risultati del sequenziamento Sanger con la sequenza vettoriale prevista per la verifica.
  3. Microiniezione e prescreening di fondatori transgenici
    1. Raccogli gli embrioni generati dal pesce omozigote rbm24a-RFP KIzpc:cas9 .
    2. Preparare la miscela per iniezione combinando 1 μL di pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μL) con 1 μL di mRNA della trasposasi Tol2 (50 ng/μL).
      NOTA: Purificare il plasmide utilizzando l'estrazione fenolo-cloroformio prima dell'iniezione per rimuovere eventuali residui di RNasi che potrebbero essere stati introdotti durante il processo di estrazione del plasmide. Il plasmide e l'mRNA di Tol2 sono stati diluiti direttamente in acqua pura.
    3. Mettere un vetrino coprioggetti in un piatto da 15 cm. Allineare gli embrioni lungo il bordo del vetrino coprioggetti e rimuovere con cura l'acqua in eccesso utilizzando una pipetta. Iniettare 2 nL della miscela nel blastodisco di ogni embrione allo stadio di 1 cellula. Dopo l'iniezione, sciacquare delicatamente gli embrioni con acqua blu e trasferirli in un piatto fresco. Infine, mettere il piatto in un'incubatrice a 28 °C per la coltivazione.
      NOTA: Preparare la soluzione di lavoro blu di metilene (acqua blu) come segue: Sciogliere 180 g di sale marino in 2,7 L di acqua distillata e sterilizzare per ottenere 100 volte il brodo di acqua di mare. Diluire questo brodo 200 volte con acqua distillata sterile per ottenere 1/100x di acqua di mare. Aggiungere 10 μL di soluzione madre di blu di metilene al 5% (m/v) a 1 L di questa acqua di mare 1/100x per preparare la soluzione di lavoro finale.
    4. A 24 hpf, selezionare embrioni che mostrano un'espressione BFP robusta e ubiquitaria. A 4 dpf, allevare solo quelli che mantengono forti segnali fluorescenti transgenici (Figura 9).

3. Caratterizzazione di embrioni doppi transgenici

  1. Fenotipizzazione di embrioni transgenici doppi
    1. Raccogli embrioni da femmine fondatrici transgeniche a mosaico che si accoppiano con maschi wild-type.
    2. Prelevare gli embrioni BFP-positivi (BFP+) allo stadio di una cellula con uno stereomicroscopio a fluorescenza.
    3. Identificare i difetti di sviluppo che emergono negli embrioni BFP+ ma non negli embrioni BFP- .
    4. Fissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 °C durante la notte. Eseguire l'ibridazione in situ a montaggio intero, la colorazione in immunofluorescenza o altre analisi istologiche quando necessario.
      NOTA: Solo i fenotipi difettosi che insorgono esclusivamente negli embrioni che esprimono sgRNA GFP o BFP-positivi sono affidabili. Le conclusioni devono essere tratte con cautela e i fenotipi mutanti materni devono essere comprovati da più di 10 casi.
  2. Genotipizzazione di embrioni materni mutanti
    NOTA: Per l'identificazione di Mrbm24a embrioni, possono essere facilmente rilevati dall'assenza di Rbm24a-RFP al microscopio a fluorescenza. Al contrario, l'identificazione di mutanti materni di altri geni si basa principalmente su una strategia di aspirazione cellulare prima dell'attivazione del genoma zigotico, seguita dall'analisi RT-PCR degli mRNA materni nelle cellule raccolte (Figura 10).
    1. Aspirazione cellulare
      1. Preparare una soluzione di agarosio all'1,5% sciogliendola in 1/3x di tampone Ringer e facendo bollire fino a quando non si sarà sciolta. Versare la soluzione in una capsula di Petri da 90 mm e inserire uno stampo (WPI, z-moulds) nell'agarosio fuso. Una volta solidificato, rimuovere delicatamente lo stampo, ottenendo una piastra pronta all'uso.
      2. Utilizza capillari di vetro e un estrattore per creare aghi sigillati a fusione. Per ottenere aghi per l'aspirazione cellulare ottimali, impostare due pesi leggeri e la potenza di riscaldamento su Lv1: 60 e Lv2: 90 e selezionare la procedura Step2. Tagliare le punte dei capillari con una pinzetta appuntita (vedi Tabella dei materiali) per ottenere un diametro di apertura di 30-40 μm. Successivamente, crea una punta sulla punta dell'ago usando una microforgia, che aiuta la penetrazione e riduce al minimo i danni all'embrione.
      3. Accoppia le femmine fondatrici putative con il pesce zebra di tipo selvatico e raccogli gli embrioni. Isolare gli embrioni BFP-positivi allo stadio di una cellula.
      4. A 3 hpf, dechorionate gli embrioni mediante incubazione in 1 mg/mL di pronasi in 1/3x tampone di Ringer per 10 minuti e pipettaggio delicato, e posizionare con cura gli embrioni sulla piastra di agarosio inondata con 1/3x tampone di Ringer integrato con 1x penicillina-streptomicina. Riorientare gli embrioni in modo che il blastomero sia diretto verso la punta del capillare.
        NOTA: È fondamentale trasferire gli embrioni con cura, perché sono estremamente fragili senza la protezione del corion. Non lasciare che tocchino la superficie del fluido!
      5. Utilizzare un microiniettore per aspirare 20-40 cellule da ciascun embrione riducendo attentamente la pressione di equilibrio che compensa la forza di aspirazione dell'azione capillare15. Rilasciare queste cellule in 2 μL di H2O deionizzato sul bordo di apertura delle provette per PCR aumentando la pressione di equilibrio.
        NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata, l'ago di vetro deve essere pulito aspirando ed espellendo H2O 3 volte deionizzato prima di ogni aspirazione.
      6. Aggiungere 200 μl di reagente per l'estrazione dell'RNA per lavare le cellule e conservare temporaneamente le provette sul ghiaccio. Successivamente, analizzare i genotipi delle cellule di embrioni con o senza difetti di sviluppo.
        NOTA: Le cellule conservate nel reagente di estrazione possono essere conservate a -20 °C fino a quando gli embrioni corrispondenti non mostrano fenotipi aberranti.
      7. Lasciare gli embrioni dopo l'aspirazione cellulare nella piastra di agarosio o posizionarli singolarmente in piastre a 24 pozzetti inondate con 1/3 di soluzione di Ringer contenente 1 di penicillina-streptomicina.
        NOTA: Bisogna prestare attenzione al trasferimento degli embrioni dechorionati! In genere, esaminiamo 20-40 embrioni in un esperimento, che dura circa 1 ora.
    2. Analisi dell'mRNA materno di interesse nelle cellule aspirate
      1. Aggiungere 40 μl di cloroformio alle cellule del reagente di estrazione e mescolare delicatamente. Centrifugare la miscela a 12.000 × g per 1 minuto a 4 °C.
      2. Raccogliere con cura il surnatante. Aggiungere 1 μL di soluzione di glicogeno (20 mg/mL) e un volume uguale di isopropanolo (se il volume del surnatante è 100 μL, aggiungere 100 μL di isopropanolo) e mescolare bene. Incubare la miscela a -20 °C per 30 minuti per facilitare la precipitazione.
        NOTA: A causa della piccola quantità di RNA totale nelle celle aspirate, è necessario aggiungere glicogeno per migliorare l'efficienza delle precipitazioni e facilitare la visualizzazione del precipitato.
      3. Centrifugare il campione a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
      4. Lavare il pellet 2 volte con l'aggiunta di 500 mL di etanolo al 70% e centrifugare a 12.000 × g per 1 min.
      5. Scartare il liquido e aprire il coperchio per lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 5 minuti.
      6. Aggiungere 7 μL di acqua per sciogliere il pellet. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando il kit di sintesi del cDNA del primo filamento, seguendo il protocollo dettagliato fornito nel manuale di istruzioni.
      7. Amplificare l'intera regione codificante con primer appropriati (vedere la Tabella dei materiali) ed eseguire l'elettroforesi dell'agarosio.
      8. Clonare i prodotti della PCR e sequenziare almeno 30 cloni per ogni embrione per analizzare la mutazione emersa negli mRNA.
        NOTA: Per confermare che la presenza di un fenotipo difettoso è causata da una mutazione mirata del fattore materno interessato, tutti gli embrioni (n > 5) con fenotipi difettosi devono mostrare l'assenza di trascritti materni wild-type. Al contrario, gli mRNA materni wild-type dovrebbero essere presenti in tutti gli embrioni che esprimono sgRNA in via di sviluppo normale (n > 5). Allo stesso tempo, negli embrioni sgRNA-negativi, sono rilevabili solo mRNA wild-type (n > 5).

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Risultati

Generazione rapida di mutanti materni rbm24a
Abbiamo costruito un vettore transgenico che consente l'espressione di un marcatore BFP materno e di quattro sgRNA altamente efficienti che hanno come bersaglio la sequenza codificante rbm24a. A seguito dell'introduzione di questo vettore in embrioni omozigoti rbm24a-RFP KIzpc:cas9 tramite trasposizione Tol2, Mrbm24a è stato facilmente e rapidamente identificato tra g...

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Discussione

Le mutazioni zigotiche letali ostacolano l'analisi del contributo materno di un gene. Le strategie alternative, in particolare la sostituzione germinale e la microiniezione di ovociti in situ (OMIS), sono tecnicamente impegnative 6,8. Nel processo di trapianto di cellule di sostituzione germinale, l'embrione ricevente riceve pochissime PGC, spesso impedendo il normale sviluppo femminile 16,17,18.

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Dichiarazioni

Questo protocollo è stato concesso come brevetto dalla China National Intellectual Property Administration, che solleverà l'uso limitato del metodo dopo aver ottenuto il permesso degli autori. Gli autori dichiarano di non avere altri interessi concorrenti o finanziari.

Ringraziamenti

Ringraziamo Jianlin Shen, Yiteng Xu e Qingqing Wei della Core Facility and Service Platform, School of Lifesciences. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 32170816, 32370860, 32450630 e 31871451), dal Programma di eccezionali studiosi di mezza età e giovani dell'Università di Shandong, dagli studiosi di Taishan della provincia di Shandong.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2x M5 HiPer Taq PCR mixMei5bioGatto#MF001-BD-100
AgarosioMDbioGatto#A006L
Kit di minipreparazione del plasmidi AxyPrepAxygenGatto#AP-MN-P-4
Strumento per elettroforesi capillare (Qsep400)BiOtticoN/A
Miscela di etichettatura DIGRocheGatto#11277073910
DNasi IRocheGatto#4716728001
DTTThermo Fisher ScientificoGatto#R0861
Kit di sintesi di cDNA di primo filamentoTransGen BiotechGatto#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS NucleasiScript GenScriptGatto#Z03389
Capillari in vetro (1,0 x 100 mm)Fabbrica di attrezzature educative RantaiGatto#OS-2B
GlicogenoBBI Scienze della vitaGatto#28985
GraphPad Prisma 9GraphPadhttps://www.graphpad.com/
ImmagineJSorgente apertohttps://imagej.net/software/fiji/
Agarosio a basso punto di fusioneBiotechGatto#CA1351
Microforgia (MF2)NARISHIGEN/A
Micro-spettrofotometro (Nano-300)ALLSHENGN/A
OlyVIAOLIMPON/A
Penicillina-streptomicinaGibcoGatto#15140122
Iniettore da pico-litri (PLI-100A) Apparato di HarvardN/A
Pinzette appuntiteWPIGatto#500341
Pinzette appuntite  WPI 500341
Estrattore (PC-100)NARISHIGEN/A
Inibitore della RNasi RiboLockThermo Fisher ScientificoGatto#EO0381
rNTPThermo Fisher ScientificoGatto#R0481
Perle magnetiche in silicio idrossileSangon BiotechGatto#B518720-0001
T7 RNA polimerasiNEBGatto#M0251L
ZoldWPIStampi a z Cat#

Riferimenti

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  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
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  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
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  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
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  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
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  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

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